SIRT1 减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的实验研究

目的:研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响。方法:构建缺氧复氧肾小管上皮细胞损伤模型,用qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中SIRT1的表达变化。在肾小管上皮细胞中转染pc DNA3. 1-SIRT1,qRT-PCR和Western blot检测过表达效率。ELISA法检测细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平。Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、Caspase-11蛋白水平。全自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:缺氧复氧肾小管上皮细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均降低。pc DNA3. 1-SIRT1转染后的肾小管上皮细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均明显升高。缺氧复氧肾小管上皮细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平升高,细胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平升高,细胞培养液中LDH水平升高。过表达SIRT1的肾小管上皮细胞经缺氧复氧处理以后,细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平降低,细胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平降低,细胞培养液中LDH水平降低。结论:SIRT1具有减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的作用,其可减少细胞分泌炎性因子,作用机制与内质网应激介导的Caspase-11途径有关。     

TFPI-2对缺氧大鼠星形胶质细胞生物学特性及机制的研究

目的:研究组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)对缺氧大鼠星形胶质细胞生物学特性的影响,探讨其对大鼠星形胶质细胞缺氧保护的机制。方法:从大鼠脑组织中分离培养星形胶质细胞,将细胞作缺氧处理,分别采用qRT-PCR和Western blot法检测星形胶质细胞中TFPI-2表达水平。在星形胶质细胞中转染TFPI-2 siRNA后,采用qRT-PCR和Western blot法检测TFPI-2基因沉默效果,MTT检测星形胶质细胞增殖,流式细胞术检测星形胶质细胞凋亡情况,qRT-PCR检测星形胶质细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)mRNA表达水平。结果:Hypoxia组星形胶质细胞中TFPI-2 mRNA水平和蛋白水平明显高于Control组星形胶质细胞,转染TFPI-2 siRNA后,si-TFPI-2组星形胶质细胞中TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平明显低于si-control组细胞,差异有统计学意义(P0. 05)。缺氧星形胶质细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高,与正常培养的星形胶质细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。对缺氧星形胶质细胞敲减TFPI-2后,细胞存活率升高,细胞凋亡率和细胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,与缺氧星形胶质细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。结论:下调TFPI-2可以促进缺氧星形胶质细胞增殖,抑制细胞凋亡,其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

黄芪多糖抑制p38MAPK信号通路减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎症反应

目的研究黄芪多糖对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎症反应的影响及机制。方法构建缺氧复氧肾小管上皮细胞损伤模型,用黄芪多糖处理后,分光光度计法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,ELISA法检测上清中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,Western blot法检测细胞中磷酸化p38MAPK蛋白水平。用p38MAPK激活剂和黄芪多糖处理缺氧复氧肾小管上皮细胞,同样检测细胞分泌的LDH、IL-1β、TNF-α水平。结果缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞培养液上清中LDH水平和IL-1β、TNF-α水平升高,促进细胞中磷酸化p38MAPK蛋白表达(P0.05)。黄芪多糖处理能够下调缺氧复氧肾小管上皮细胞培养液上清中LDH和IL-1β、TNF-α水平,降低细胞中磷酸化p38MAPK蛋白水平(P0.05)。p38MAPK激活剂处理可以逆转黄芪多糖对缺氧复氧肾小管上皮细胞分泌LDH、IL-1β、TNF-α的促进作用。结论黄芪多糖能够通过抑制p38MAPK信号通路减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎症反应。     

下调lncRNA NEAT1通过NF-κB信号传导途径抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放北大核心CSCD

目的:探究下调lncRNA NEAT1对TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放的影响。方法:将肺泡上皮细胞A549分成Control组、TNF-α组(TNF-α处理)、sh-NC组(转染shRNA control,TNF-α处理)、sh-NEAT1组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α处理)、sh-NEAT1+PMA组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α和NF-κB信号激活剂PMA处理)。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性,CellROX Green法检测细胞中ROS水平,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-1β水平,Western blot检测Cleaved caspase-3、p65蛋白表达。结果:与Control组相比,TNF-α组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,MDA含量、ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β增多,细胞中p65蛋白表达水平升高。与sh-NC组相比,sh-NEAT1组肺泡上皮细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,MDA含量、ROS水平降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β减少,细胞中p65蛋白表达水平降低。与sh-NEAT1组相比,sh-NEAT1+PMA组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3、p65蛋白表达增多,MDA含量和ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多。结论:下调NEAT1通过降低NF-κB信号通路激活水平抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症因子释放。     

PTEN对缺氧复氧心肌H9c2细胞凋亡、氧化损伤及免疫炎症因子水平的影响

目的:研究第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)对缺氧复氧条件下心肌H9c2细胞凋亡、氧化损伤及免疫炎症因子水平的影响。方法:用H9c2细胞构建缺氧复氧模型。细胞转染PTEN小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,缺氧复氧处理后,RT-PCR和Western blot分别测定细胞中PTEN的mRNA和蛋白水平。MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,用黄嘌呤氧化法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,用二硝基苯肼法测定培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,ELISA测定培养液上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平,Western blot法测定细胞中cleaved caspase-3、Bax和Fas L的蛋白水平。结果:缺氧复氧处理后H9c2细胞中PTEN的mRNA和蛋白水平均明显升高(P 0. 05)。转染PTEN siRNA后的细胞中PTEN的mRNA和蛋白水平明显下降(P 0. 05)。缺氧复氧处理后H9c2细胞活力下降,凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3、Bax和Fas L的蛋白水平升高,MDA水平也升高,SOD活性下降,培养液上清中LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平升高(P 0. 05),而下调PTEN可以部分拮抗缺氧复氧对H9c2细胞活力、凋亡率、MDA水平、SOD水平及培养液上清中LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。结论:下调PTEN可以减轻缺氧复氧诱导的心肌H9c2细胞氧化损伤,减少H9c2细胞凋亡,降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。     

炎性因子IL-1β对星形胶质细胞抗氧化应激能力的影响

目的:本研究应用原代培养星形胶质细胞,探讨炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)对星形胶质细胞抗氧化应激能力的影响。方法:在原代星形胶质细胞培养中分别加入1 ng/ml IL-1β,流式细胞仪检测不同作用时间(0、24、48、72 h)细胞线粒体膜电位改变,激光共聚焦显微镜观察活性氧(ROS)生成,分光光度法检测细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,RT-PCR、Western Blot检测星形胶质细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的表达变化。结果:1 ng/ml IL-1β处理原代培养星形胶质细胞24~72 h,细胞线粒体膜电位无明显改变,细胞未出现明显损伤。IL-1β孵育24 h,细胞内ROS生成减少,GSH生成增加;48 h细胞内ROS生成增加,GSH较24 h组减低(P0.05);72 h,原代培养星形胶质细胞内ROS生成明显增加,GSH较0 h组降低(P0.05)。1 ng/ml IL-1β处理原代培养星形胶质细胞24 h,细胞内GSH-Px mRNA及蛋白水平较0 h组升高(P0.05);但仅是一过性反应,IL-1β孵育72 h后,原代培养星形胶质细胞内GSH-Px mRNA及蛋白水平均较0 h组降低(P0.05)。结论:持续炎性因子刺激下,星形胶质细胞抗氧化应激能力呈现动态改变,并且细胞内抗氧化物参与此变化过程。     

靶向TLR4 的siRNA 慢病毒感染减少过氧化氢诱导的心肌H9C2 细胞凋亡及氧化损伤

目的:研究沉默TLR4对过氧化氢(H_2O_2)诱导的心肌H9C2细胞凋亡及氧化损伤的影响。方法:用H_2O_2处理心肌H9C2细胞,qRT-PCR和Western blot检测细胞中Toll样受体4(TLR4) mRNA和蛋白水平。用siRNA TLR4慢病毒感染心肌H9C2细胞,H_2O_2诱导以后,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)和剪切型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)水平,硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)水平,黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测活性氧(ROS)水平,ELISA法检测培养液上清中TNF-α、IL-6水平。结果:H_2O_2诱导处理以后的心肌H9C2细胞中TLR4mRNA和蛋白水平均明显高于未经诱导的心肌H9C2细胞(P0. 05)。siRNA TLR4慢病毒感染后可以降低心肌H9C2细胞中TLR4 mRNA和蛋白水平。H_2O_2诱导后的心肌H9C2细胞凋亡率升高,Bax和Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,细胞中SOD活性降低,MDA水平升高,ROS水平也升高,同时细胞培养液中LDH水平升高,细胞分泌的TNF-α、IL-6增多,与未经诱导的心肌H9C2细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。敲低TLR4后的心肌H9C2细胞经H_2O_2诱导处理以后,细胞凋亡率降低,细胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,细胞中SOD活性升高,MDA水平降低,ROS水平也降低,同时细胞培养液中LDH水平降低,细胞分泌的TNF-α、IL-6减少,与单纯经H_2O_2诱导处理的心肌H9C2细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。结论:沉默TLR4减弱H_2O_2诱导的心肌H9C2细胞凋亡及氧化损伤,减少细胞中ROS的聚集,减少心肌H9C2细胞分泌炎症因子。     

青藤碱通过调节 Nrf2 通路保护心肌细胞免受缺氧复氧损伤 #br#

【摘要】 目的 探究青藤碱通过调节 Nrf2 通路对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响。 方法 建立缺氧复氧损伤细胞模型, CCK-8 法检测细胞存活率; 乳酸脱氢酶试剂盒检测 LDH 水平; 肌酸激酶同工酶测试盒检测CK-MB 水平; 肌钙蛋白测定测试盒检测 cTnⅠ 水平; DCFH-DA 探针检测 ROS 含量; 总超氧化物歧化酶测定试剂盒检测 SOD 含量; 测定试剂盒检测 MDA 含量; 过氧化氢酶测定试剂盒检测 CAT 含量; 谷胱甘肽过氧化物酶测试盒检测 GSH-Px 含量。 ELISA 检测 TNF-α、 IL-6 和 IL-1β 水平; Hoechst 染色检测细胞凋亡率;Western 印迹检测 Cleaved caspase-3、 Cleaved caspase-9、 Keap1、 Nrf2、 p-Nrf2、 HO-1、 NQO1 蛋白表达水平;利用 siRNA 敲减 Nrf2 低表达 Nrf2 后再次检测上述指标变化。 结果 与 OGD / R 组比较, 各剂量组细胞存活率降低, LDH、 CK-MB、 cTnⅠ 水平降低, ROS、 MDA 含量降低, SOD、 CAT 和 GSH-Px 含量升高, TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平降低, 细胞凋亡率降低, Cleaved caspase-3、 Cleaved caspase-9、 Keap1蛋白水平降低, pNrf2 / Nrf2、 HO-1、 NQO1 蛋白水平升高。 通过 siRNA 敲减 Nrf2 低表达 Nrf2 后, 氧化应激, 炎性反应和相关蛋白表达被逆转。 结论 青藤碱通过调节 Nrf2 通路保护心肌细胞免受缺氧复氧损伤。     

沉默beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响

目的 探讨beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖小鼠海马神经元细胞系HT22细胞凋亡的影响。方法 取对数生长期的HT22细胞,随机分为4组：正常组（normal）、缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）模型组（model）、beclin1基因沉默组（beclin1^-/-）、转染对照组（control）。除normal组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后进行复氧复糖。利用RNAi技术,针对小鼠cDNA序列设计beclin1干扰序列,用脂质体Lipo2000包裹后转染至HT22细胞。于转染48 h后用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting检测细胞beclin1 表达情况。各组细胞均于复氧复糖24 h后采用CCK-8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞损伤情况,免疫荧光染色检测Bax、Bcl-2表达及比值变化,Western blotting检测LC3、P62及Caspase-3表达。SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。结果 与normal组相比,model组细胞活力及P62蛋白表达显著降低（P<0.01）,乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Caspase-3表达及Bax/Bcl-2均显著升高（P<0.01）。与model组相比,beclin1^-/-组细胞活力及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 表达显著降低（P<0.01）,LDH漏出率、Bax/Bcl-2及P62、Caspase-3表达显著升高（P<0.01）;control组与model组比较差异无显著性。结论 沉默beclin1抑制细胞自噬可使缺氧缺糖/复氧复糖处理的HT22细胞损伤加重,细胞凋亡进一步增加。     

基于 Caspase-1 细胞焦亡信号通路探讨栀子苷对脂多糖诱导 RAW264.7 细胞炎症的抑制作用

目的：探讨栀子苷对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 Caspase-1细胞焦亡经典信号通路的干预作用。方法：LPS诱导RAW264.7细胞构建炎症模型,以地塞米松为阳性对照,20、40、80μmol/L栀子苷干预细胞24 h。乳酸脱氢酶（LDH）细胞释放法检测细胞LDH释放;碘化丙啶（PI）荧光染色观察细胞存活情况;检测细胞上清中炎症因子IL-18、IL-1β、TNF-α和IL-6分泌水平;Western blot检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β表达。结果：与正常对照组相比,模型组RAW264.7细胞中LDH释放量明显升高（P<0.01）,细胞形态学观察到有大量细胞被PI染色,细胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6分泌水平显著升高（P<0.01）;NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β蛋白表达显著升高（P<0.01）。与模型组相比,栀子苷各组和地塞米松组LDH释放减少（P<0.01）,有效抑制PI染色,细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6...     

氧糖剥夺诱导原代大鼠星形胶质细胞miR-21的表达变化

目的研究原代大鼠星形胶质细胞氧糖剥夺不同时间miR-21的表达,探讨miR-21是否参与了缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的活性变化。方法原代大鼠星形胶质细胞随机分为正常组和氧糖剥夺组,分别培养3、6、9和12h。CCK-8法检测各组星形胶质细胞的活力,real-time PCR方法检测各组星形胶质细胞miR-21的表达。结果氧糖剥夺组miR-21的表达水平随培养时间延长呈先升高后降低的动态变化,3h开始高于对照组水平(P<0.05),6h达高峰(P<0.05),随后下降,9h与对照组无差异(P>0.05),12h显著低于对照组(P<0.05)。氧糖剥夺不同时间星形胶质细胞活力变化与miR-21的变化趋势一致。结论 miR-21可能参与了缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的活性变化,发挥促增殖和抗凋亡的作用。     

Ghrelin抑制Aβ25-35诱导的BV-2细胞炎症反应及改善细胞线粒体功能的机制研究

目的探讨在小鼠小胶质细胞BV-2中过表达Ghrelin对Aβ诱导炎症反应及细胞线粒体功能的影响及相关机制。方法应用慢病毒介导Ghrelin过表达载体感染小鼠小胶质细胞BV-2,免疫荧光观察感染效率,应用RT-PCR及Western blot检测慢病毒感染后细胞中Ghrelin mRNA和蛋白的表达水平;Aβ25-35预处理过表达Ghrelin的BV-2后,利用ELISA、CCK-8、AnnexinV FITC/PI流式细胞术及JC-1法和免疫组化实验检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌水平及细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位及胞质中ROS及Cyt-C的表达;电子显微镜下观察过表达Ghrelin后,Aβ25-35对BV-2细胞中凋亡小体产生的影响;Western blot检测上述处理后BV-2细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表达。结果免疫荧光显示慢病毒介导Ghrelin过表达载体的感染效率可达85%以上,慢病毒感染的BV-2细胞中Ghrelin mRNA和蛋白的表达显著升高;ELISA及CCK-8、Annexin-V FITC/PI流式细胞术及JC-1法和免疫组化实验结果表明,过表达Ghrelin可明显抑制Aβ25-35对BV-2细胞所诱导的促进炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6分泌作用且细胞的增殖能力及凋亡率显著下降,细胞的膜电位明显下调,ROS及Cyt-C的表达显著减少;电子显微镜下观察发现,过表达Ghrelin后可明显抑制Aβ25-35对BV-2细胞中促进凋亡小体产生的作用;Western blot实验结果显示,处理后的BV-2细胞中促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表达显著下降,而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达明显增加。结论过表达Ghrelin可抑制Aβ25-35对小胶质细胞BV-2所诱导的炎症反应,并通过线粒体凋亡途径抑制后者诱导的细胞凋亡的现象。     

Vasostatin-1对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响

目的探讨血管生成抑制因子vasostatin-1(VS-1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤作用及机制。方法采用缺氧复氧方式制造肾小管上皮细胞炎性损伤。构建慢病毒载体并以脂质体法将shVS-1转染NRK-52E细胞。ELISA法检测细胞中LDH和IL-1β含量;Western blot检测细胞中VS-1、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表达。结果与对照组相比,缺氧复氧组细胞LDH和IL-1β含量显著升高,且VS-1蛋白表达显著升高。成功构建沉默VS-1的慢病毒载体,且转染缺氧复氧NRK-52E细胞,可降低细胞中LDH和IL-1β含量、降低caspase-1蛋白表达,过表达VS-1则具有相反的功能。结论沉默VS-1可保护缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤,可能与下调caspase-1有关,可为急性肾损伤的临床治疗提供依据。     

脯氨酰异构酶1 沉默抑制缺氧/ 复氧H9c2 心肌细胞凋亡

目的:肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)在心血管疾病发病过程中发挥重要作用,本研究检测RNA 干扰沉默Pin1 对缺氧/ 复氧诱导的大鼠胚胎心肌细胞H9c2 凋亡的影响及机制。方法:体外培养大鼠H9c2 细胞,建立缺氧/ 复氧损伤模型,模拟体内缺血再灌注损伤;RT-qPCR 和Western blot 法检测Pin1 的表达;将细胞分为空白对照组、缺氧/ 复氧组、缺氧/ 复氧组+转染Pin1 siRNA 组、缺氧/ 复氧组+转染scramble siRNA 组;MTT 法测H9c2 细胞存活率;用流式细胞术Annexin V/ PI 双染法检测细胞凋亡率;用Western blot 法检测H9c2 细胞Bax 和Bcl-2 蛋白表达;生化法检测Caspase-3 的活性水平。结果:Pin1 在缺氧/ 复氧H9c2 细胞中呈现高表达;转染Pin1 siRNA 后,Pin1 的mRNA 和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与缺氧/ 复氧组比较,Pin1 siRNA 组的细胞存活率增加,凋亡率降低,Bcl-2 蛋白表达升高,Bax 蛋白表达降低,Bcl-2/ Bax 升高,Caspase-3 活性降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Pin1 下调可减少缺氧/ 复氧诱导的心肌细胞凋亡,可能是通过上调Bcl-2,下调Bax 蛋白表达,降低Caspase-3 活性而发挥作用。     

银杏叶提取物对体外培养大鼠皮层神经干细胞缺糖缺氧/复糖复氧损伤的保护作用

目的:探讨银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)对缺糖缺氧-复糖复氧损伤新生大鼠皮层神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的保护作用及其机制。方法:采用无血清法培养新生大鼠皮层NSCs,对NSCs进行缺糖-缺氧结合复糖-复氧处理。实验分为对照组、缺糖-缺氧结合复糖-复氧组和GBE组,MTT法检测细胞活性,DAPI染色检测原代培养细胞的凋亡,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞仪检测传代细胞的凋亡率,免疫荧光染色观察细胞的增殖分化的能力。结果:与缺糖缺氧-复糖复氧组相比,GBE明显提高了细胞的活性、存活率(P<0.05),同时降低了LDH漏出率和凋亡率(P<0.01)。DAPI染色显示:GBE可明显逆转缺糖缺氧导致的细胞凋亡。免疫荧光双标显示:与对照组相比,缺糖缺氧-复糖复氧组明显抑制了细胞Nestin/BrdU和Nestin/Tuj-1的表达;而与缺糖缺氧-复糖复氧组相比,GBE可显著促进细胞Nestin/BrdU和Nestin/Tuj-1的表达。结论:GBE能够增强皮层NSCs活性,减少细胞凋亡,促进细胞增殖、分化。提示GBE能够通过有效调节NSCs凋亡相关基因和促进细胞增殖与分化,进而对缺糖缺氧-复糖复氧损伤皮层NSCs起到保护作用。     

白藜芦醇对星形胶质细胞ATP释放的影响

目的研究白藜芦醇对体外培养的星形胶质细胞牵拉损伤后三磷酸腺苷（ATP）释放的影响,探索其对中枢神经保护作用的可能机制。方法采用不同剂量的白藜芦醇与星形胶质细胞共同培养12h后,进行牵拉损伤,检测不同实验组星形胶质细胞内、外ATP含量,并进行乳酸脱氢酶（LDH）漏出量的测定。结果牵拉损伤使星形胶质细胞分泌ATP明显增加,相反细胞内ATP含量明显下降（P〈0．05）;1μmol白藜芦醇能够使星形胶质细胞损伤后ATP分泌进一步增加（P〈0．05）;而100μmol白藜芦醇能减少损伤后ATP分泌（P〈0．05）。对细胞进行LDH漏出量的检测发现,牵拉损伤能够使星形胶质细胞的LDH漏出量增加（P〈0．05）,1μmol白藜芦醇进一步加剧了LDH漏出（P〈0．05）,100μmol白藜芦醇能够有效减少星形胶质细胞的LDH漏出（P〈0．05）。结论星形胶质细胞受到牵拉损伤后,100μmol白藜芦醇能够减少其ATP释放,且能够减少LDH漏出,进而对星形胶质细胞起到保护作用。     

缺氧复氧对肠上皮细胞凋亡指数及线粒体膜电位的影响

观察缺氧复氧对IEC-6(肠上皮)细胞凋亡和线粒体膜电位的影响,探讨其细胞损伤的机制.建立IEC-6细胞缺氧复氧损伤模型;用流式细胞仪检测细胞凋亡指数,采用激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位变化.结果表明IEC-6细胞缺氧复氧损伤后,细胞凋亡指数明显升高(P<0.01),线粒体膜电位明显降低(P<0.01).     

Mettl9基因过表达促进氧糖剥夺大鼠离体星形胶质细胞损伤

目的:探讨甲基转移酶样蛋白9(Mettl9)基因过表达对氧糖剥夺(OGD)大鼠离体星形胶质细胞损伤的影响及机制。方法:体外原代培养SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞,建立OGD诱导的星形胶质细胞损伤模型。实验分为正常对照(Con)组、慢病毒空载体转染(NC)组、慢病毒重组载体pLenti6.3-Mettl9转染组(Mettl9组)、正常对照+OGD处理(Con+OGD)组、慢病毒空载体转染+OGD处理(NC+OGD)组及慢病毒重组载体pLenti6.3-Mettl9+OGD处理(Mettl9+OGD)组。慢病毒载体pLenti6.3-Mettl9转染后48 h,收集细胞,采用RT-qPCR及Western blot法检测Mettl9的表达以验证转染效率。采用MTT法检测各组细胞活力;以乳酸脱氢酶(LDH)漏出率作为细胞损伤指标;RT-qPCR法检测Bcl-2和Bax的m RNA表达;Western blot法检测Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:慢病毒载体pLenti6.3-Mettl9转染星形胶质细胞后,RT-qPCR及Western blot检测结果显示Mettl9的m RNA和蛋白表达水平均升高(P0.05),获得了Mettl9基因过表达的星形胶质细胞。与Con组比较,Mettl9组星形胶质细胞的LDH漏出率升高,细胞活力下降(P0.05),促凋亡蛋白Bax的mRNA及蛋白表达升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA及蛋白表达降低(P0.05)。与Con+OGD组比较,Mettl9+OGD组星形胶质细胞的LDH漏出率显著升高,细胞活力显著下降(P0.05),Bax的mRNA及蛋白表达显著升高,而Bcl-2的mRNA和蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:Mettl9基因过表达促进OGD大鼠离体星形胶质细胞损伤,其机制可能与调控Bcl-2/Bax信号通路有关。     

丹酚酸B保护缺糖缺氧/复糖复氧神经元的作用机制研究

目的： 通过建立大鼠皮层神经元缺糖缺氧/复糖复氧性损伤模型,探讨丹酚酸B保护神经元的作用机制。方法: 将原代培养的大鼠皮层神经元随机分为正常组、缺糖缺氧/复糖复氧组和丹酚酸B治疗组,复制缺糖缺氧3 h后复糖复氧24 h的细胞模型。采用MTT法观察神经元的活性,比色法测定乳酸脱氢酶（LDH）漏出率,流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）及细胞凋亡率,激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内游离钙水平,以及 Hoechst 33342染色观察细胞核的形态变化。结果: 与缺糖缺氧/复糖复氧组相比,丹酚酸B可提高神经元的活性、存活率以及MMP荧光值（P<0.05,P<0.01）,同时可降低LDH漏出率、细胞内钙荧光强度和凋亡率（P<0.01）;荧光染色显示,丹酚酸B可减轻缺糖缺氧/复糖复氧诱导的细胞核的损伤。结论: 维持MMP和钙稳态可能是丹酚酸B保护缺糖缺氧/复糖复氧处理的神经元的作用机制。     

敲减TLR4表达减少LPS诱导的胰腺腺泡AR42J细胞分泌炎症因子

目的:研究Toll样受体4(TLR4)对脂多糖(LPS)诱导的胰腺腺泡AR42J细胞分泌炎症因子的影响。方法:用LPS处理大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,real-time PCR和Western blot测定细胞中TLR4表达的变化。将携带TLR4 siRNA的慢病毒感染AR42J细胞,给予LPS处理,real-time PCR和Western blot检测干扰效率,MTT法检测细胞活力,二硝基苯肼法测定乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率,ELISA法检测细胞分泌白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,硫代巴比妥酸法测定上清中丙二醛(MDA)的含量,用黄嘌呤氧化法测定上清中超氧化物歧化酶(SOD)活力,比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性。结果:LPS处理后的AR42J细胞中TLR4的mRNA和蛋白水平明显升高(P0.01)。携带TLR4 siRNA的慢病毒可以明显下调LPS刺激下AR42J细胞中TLR4的mRNA和蛋白水平(P0.01)。LPS处理后的AR42J细胞活力降低,LDH漏出率升高,细胞分泌的IL-1β和TNF-α增多,培养上清中MDA含量升高,SOD、GSH-Px和CAT活性降低(P0.01)。敲减TLR4表达可以提高LPS刺激下AR42J细胞的活力,降低细胞的LDH漏出率及分泌IL-1β和TNF-α的水平,减少细胞培养液中MDA的含量,提高SOD、GSH-Px和CAT的水平(P0.01)。结论:LPS诱导胰腺腺泡AR42J细胞TLR4表达,敲减其表达可以减少LPS诱导的AR42J细胞分泌IL-1β、TNF-α等炎症因子,减轻氧化损伤。