RNA干扰沉默p16基因对小鼠胚胎成纤维细胞衰老的影响

目的：探讨RNA干扰沉默小鼠p16基因表达对137Csγ射线诱导的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）衰老的影响。方法构建p16 RNA干扰载体,采用实时荧光定量PCR、Western blot和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察RNA干扰前后辐射诱导衰老的MEF细胞mRNA水平、蛋白水平和衰老细胞百分率等的变化。结果辐射诱导衰老的MEF细胞RNA干扰后24 h,照射＋p16 siRNA-1和照射＋p16 siRNA-2组p16 mRNA 相对表达水平较照射组显著降低（t=16.52、16.13,P均〈0.05）,蛋白水平较照射组显著降低;干扰后5 d,照射＋p16 siRNA-1和照射＋p16 siRNA-2组SA-β-Gal染色阳性细胞百分比[（34.17±2.08）%和（33.83±1.75）%]明显低于照射组[（68.83±1.26）%]（t=37.72、38.09,P均〈0.01）。结论 RNA干扰沉默小鼠p16基因表达能够抑制MEF细胞的衰老,为其在细胞衰老相关研究中的应用奠定了基础。     

小鼠胚胎成纤维细胞复制性衰老模型的构建及衰老溶酶体功能检测

目的 构建小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）复制性衰老模型,检测衰老溶酶体相关功能改变,为衰老相关溶酶体疾病提供有效的细胞模型。方法 通过酶消化法分离提取MEF,体外连续传代培养构建MEF复制性衰老模型,实时定量PCR(qPCR)检测衰老标志物p16和p21,衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色方法进一步验证衰老状态;通过溶酶体探针类染料LysoTracker Red DND-99探针及LysoSensor Yellow/Blue DND-160双激发探针追踪酸性溶酶体定性检测溶酶体酸碱性及定量检测溶酶体pH值;通过偶联自淬BODIPY?染料的牛血清白蛋白（DQ-BSA）检测衰老溶酶体的降解能力。结果 qPCR和SA-β-gal染色结果显示,MEF复制性衰老模型构建成功。与年轻P3代MEF相比,衰老P9代MEF溶酶体的酸性明显丧失,差异有统计学意义（P<0.0001）,衰老P9代MEF溶酶体的降解能力明显降低（P<0.05）。结论 成功构建MEF复制性衰老细胞模型,并证明衰老MEF溶酶体的酸性丧失以及降解能力下降。     

GPS2基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化及其增殖凋亡的检测

目的 利用SV40大T抗原(SV40LT)过表达慢病毒建立永生化的GPS2野生与敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系,并检测GPS2敲除对MEF增殖及凋亡的影响.方法 构建pCDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,并进行病毒包装.分离胚胎发育9.5 d(E9.5d)的MEF细胞,感染SV40LT慢病毒,连续传代培养50代以上,把仍存活且状态良好的GFP阳性细胞视作永生化成功的MEF细胞.利用高内涵细胞成像分析仪检测永生化MEF细胞的增殖情况,采用AnnexinV/PI双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 成功构建pCDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,获得滴度为4.03×108 pfu/ml的病毒.分离E9.5d MEF细胞并感染上述病毒,阳性细胞扩大培养并稳定传代50代以上,成功建立了永生化的MEF细胞系.GPS2敲除MEF细胞的增殖能力明显低于野生型,而二者由于血清撤除所引起的凋亡并无明显差异.结论 敲除GPS2抑制MEF细胞的增殖.     

肝细胞生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）诱导小鼠胚胎干细胞（ESC）体外定向分化为肝细胞的能力。方法对ESC体外悬浮培养5～7天形成的拟胚体,观察ESC自主分化、HGF诱导分化的情况。观察和检测经诱导4周的细胞的HE染色,糖原染色,尿素氮及甘油三酯合成,心肌MHC、白蛋白、AFP、CK18的表达,以及吲哚氰绿（ICG）染色情况。结果ESC自主分化难以控制。HGF可促进ESC向内胚层进一步分化,但更可能诱导其向心肌分化。表达白蛋白、AFP、CK18、ICG和FDA染色阳性。结论HGF可诱导ESC分化出肝细胞,但HGF的单一作用能力有限,提示肝细胞的诱导分化可能需要多种因素共同作用。     

125I粒子持续低剂量率照射对人前列腺癌细胞的抑制作用

目的探讨^125I粒子持续低剂量率照射对人前列腺癌细胞株（PC3）增殖抑制以及对细胞周期的影响。方法^125I粒子（初始剂量率2.77cGy/h）和^60Coγ射线（吸收剂量率2.215Gy/min）对体外培养的PC3细胞进行0、0.5、1、1.5、2、4、6和8Gy照射,用细胞计数、锥虫蓝染色和集落形成法检测细胞增殖、细胞活力和细胞存活率的情况;用单击多靶模型拟合剂量存活曲线;用流式细胞仪检测细胞周期。结果随着照射剂量的增加,^125I粒子照射组的细胞生长比^60Coγ射线组更加明显地受到抑制（P〈0.05）。^125I粒子照射PC3细胞D0值为2.243,Dq为0.87,N为1.618,SF2为0.5。^60Co照射组PC3细胞放射生物学参数D0值为2.824,Dq为1.08,N为1.587,SF2为0.7。^60Co和125I粒子的RBE比值为1.4。与空白对照组相比,^125I粒子组和^60Co组4Gy照射细胞24h后均出现G2期阻滞。结论^125I粒子照射能抑制人前列腺癌细胞的增殖并能使PC3细胞阻滞于G2期。     

镉诱导小鼠胚胎细胞抗辐射的适应性反应及时间效应

目的对镉（ＣｄＣｌ）诱导小鼠胚胎细胞１．５Ｇｙ６０Ｃｏγ射线的交叉适应性反应及时间效应进行了研究。方法小鼠于孕９天给予氯化镉（ｉｖ）后，分不同时间间隔给１．５Ｇｙ６０Ｃｏγ射线照射，孕１０天时进行胚胎细胞染色体制备。结果０．２５～２．０ｍｇ／ｋｇ剂量的镉能诱导胚胎细胞抗辐射的交叉适应性反应，而且与给镉后照射的时间间隔有密切关系，４小时已显示明显适应性反应，８小时达最高，１２，２４小时则产生协同作用。结论氯化镉可引起交叉适应性反应并与给镉后照射时间相关。     

人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立

目的利用β-甘油磷酸盐处理人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells,HVSMCs）制备体外血管钙化模型。方法用组织贴壁法从人胚胎脐带动脉中分离原代人主动脉平滑肌细胞,原代细胞通过抗体α-sm-actin染色鉴定,将传4～6代的细胞分为钙化组和对照组,对照组用正常DMEM培养基培养,钙化组加入10mmol/Lβ-甘油磷酸盐诱导细胞钙化,连续培养10d。茜素红S染色及碱性磷酸酶法鉴定。结果：分离的原代细胞经S-P染色鉴定为阳性,呈淡黄色。钙化组细胞诱导钙化后,细胞增殖缓慢,并形成囊泡结构,茜素红S染色形成红色的钙化结节,钙化组碱性磷酸酶活性较对照组在不同时间点（4,6,8,10d）都有所增加（P〈0.01）。结论：β-甘油磷酸盐体外能够诱导HVSMC钙化,此方法诱导的钙化模型是一种良好的研究血管疾病方面的体外模型。     

食管癌患者来源异种移植模型的构建及组织学观察

目的 建立食管癌患者来源的人源肿瘤异种移植（patient-derived xenograft,PDX）裸鼠模型,光镜观察初代（P0代）与第1代（P1代）、第2代（P2代）肿瘤组织切片结构形态的差别,比较不同代次之间成瘤速度和肿瘤体积大小的差异。方法 收集临床手术切除的食管癌患者的肿瘤组织3例,接种于裸鼠皮下,建立PDX模型,观察食管癌PDX模型不同代次肿瘤组织的形态,通过苏木精-伊红染色比较P0代患者肿瘤组织与移植瘤组织结构与细胞形态。结果 PDX裸鼠模型传至第2代,光镜下观察苏木精 伊红染色结果,PDX移植瘤与P0代肿瘤细胞形态结构相似。P2代成瘤速度快于P0代与P1代（P<0.01）。结论 PDX模型传代较好的保留了食管癌肿瘤组织的自身特性,加快了成瘤速度,便于进一步开展之后的实验研究。     

实验肿瘤局部照射动物模型的改进

目的对局部照射肿瘤实验动物模型进行改进以提高肿瘤放疗增敏药物增敏实验结果的可靠性。方法分别在小鼠腿上皮下（传统方法）和小鼠脚背皮下（改进方法）接种肝癌H22细胞,使其生长成实体瘤;用5Gyγ射线照射肿瘤后,每隔1d测量肿瘤的长、宽、高并计算肿瘤体积,连续观察24d。结果将肿瘤接种于小鼠腿上皮下时,照射组的肿瘤体积和质量与对照组之间的差异无统计学意义（t=0．55、0．70,P均〉0．05）;而将肿瘤接种于脚背皮下时,照射组的肿瘤体积和质量均明显低于对照组（t=2．25,P〈0．05;t=3．14,P〈0．01）。结论肿瘤接种于小鼠脚背皮下的方法,操作简单、方便、易行且实验结果准确、可靠。     

6 Gy全身一次~(60)Co γ线照射对大鼠小肠吸收酪氨酸的影响

目的 :探讨 6Gy全身一次 60Coγ线照射对大鼠小肠吸收酪氨酸的影响。方法 :用在体实验方法研究 6Gy全身一次60 Coγ线照射后第 1、3、5、7天大鼠小肠对酪氨酸的吸收率的变化 ,并进行相应的小肠上皮细胞计数。结果 :6Gy全身一次60 Coγ线照射后第 3天出现小肠对酪氨酸的吸收率下降 (P <0 .0 5 ) ,第 5天已恢复正常水平。小肠上皮细胞计数在照射后第 1天即出现明显下降 (P <0 .0 5 ) ,第 3天达最低 (P <0 .0 5 ) ,第 5天即恢复正常水平。结论 :6Gy全身一次 60 Coγ线照射后大鼠小肠对酪氨酸吸收率的变化与小肠上皮的损伤和修复有关     

白细胞介素21基因联合放射对肺癌细胞生长的协同抑制作用

目的：探讨白细胞介素21（IL-21）基因联合放射对肺癌A549细胞生长的协同抑制作用。方法将肺癌A549细胞分为4组：空白对照组、Ad-IL-21组（用Ad-IL-21腺病毒转染细胞）、照射组（行6 Gy 137Csγ射线照射）以及Ad-IL-21联合照射组（用Ad-IL-21腺病毒转染细胞后再行6 Gy 137Csγ射线照射）,观察IL-21基因对A549细胞生长的抑制效应。结果 Ad-IL-21联合照射组的A549细胞的抑制效应最强（抑制率约为40%）,显著高于Ad-IL-21组（约22%）和照射组（约17%）（F=45．6、57．5,P＜0．05）。Ad-IL-21联合照射组A549细胞发生明显的G2期阻滞（35．4%）,与Ad-IL-21组（25．2%）和照射组（17．5%）比较,差异有统计学意义（F=16．6、32．8, P＜0．05）。Ad-IL-21联合照射组凋亡细胞所占比例最高,凋亡率达到33．1%,与Ad-IL-21组（27．8%）和照射组（14．8%）相比差异有统计学意义（F=15．9、41．7,P＜0．05）。结论 IL-21基因联合放射对肺癌细胞生长的抑制效应具有协同作用,可显著地抑制肿瘤细胞的生长。     

淡豆豉提取物对急性辐射损伤小鼠的保护作用研究

目的研究淡豆豉提取物对6Gy的^60Coγ辐射损伤小鼠的保护作用。方法6Gy的^60Coγ全身性照射小鼠造模,小鼠灌胃给予0．5％CMC—Na为溶媒配制的阳性对照药尼尔雌醇和淡豆豉提取物的混悬液28d,每天1次,照射前后分别连续灌胃给药14d;血细胞分析仪检测白细胞、红细胞、血小板等血液学指标,称取小鼠体质量,脾脏和胸腺质量;透射电子显微镜观察小鼠脾脏、胸腺、小肠和睾丸的超微结构。结果淡豆豉提取物能明显减轻^60Coγ射线引起的小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板等指标的减少和体质量减轻,显著提高股骨骨髓有核细胞数,明显改善辐射受损的脾脏、胸腺、小肠和睾丸的超微结构和增加萎缩的胸腺、脾脏等指数。结论淡豆豉提取物对低剂量^60Coγ辐射损伤小鼠具有明显的保护作用。     

胚胎停止发育的危险因素分析

目的 对胚胎停止发育患者在生活和工作中接触到的某些危险因素进行分析,探讨其对胚胎停止发育的影响,为预防胚胎停止发育提供科学依据.方法 选取2010-06至2012-06诊断为胚胎停止发育患者60例为病例组,胚胎正常发育者60例为对照组,对以上两组孕妇予以问卷调查,内容涉及基本情况、生活习惯、生活和工作环境中各种因素等,对搜集到的资料进行t检验、x2检验和非条件Logistic回归分析.结果 既往流产史、每日使用辐射性电器的时间、睡眠不足6 h/d、饮酒、吸烟等十项因素与胚胎停止发育的发生率相关（P＜0.05）,采用非条件Logistic回归法进一步分析,有流产史（OR=18.254）、使用辐射性电器的时间2～6 h/d（OR=43.067）和＞6 h/d（OR =94.886）、经常睡眠不足6 h/d（OR =9.017）、经常饮酒（OR=7.602）、经常吸烟（OR=7.573）、进行适量体育锻炼（OR=0.151）、孕期心情抑郁（OR =46.025）、工作强度较大（OR=108.003）有统计学意义（P＜0.05）.结论 有流产史、使用辐射性电器的时间＞2 h/d、有经常睡眠＜6 h/d、饮酒、吸烟的情况、孕期心情抑郁、工作强度较大等可能是导致胚胎停止发育的危险因素,进行适量体育锻炼可能是预防胚胎停止发育的保护因素.     

60Coγ射线诱导EJ细胞DNA损伤及γH2AX 表达的研究

目的 探讨不同剂量⁶⁰Coγ射线对EJ细胞DNA损伤的情况,不同剂量⁶⁰Coγ 射线照射EJ细胞后诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成,以及与γH2AX表达量的关系。方法 单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂损伤情况。免疫荧光法检测不同剂量γ 射线照射后立即、以及2 Gy γ 射线照射后不同时间的EJ细胞中γH2AX焦点的数量。流式细胞分析法检测不同剂量γ 射线照射后EJ细胞中γH2AX 蛋白表达量的变化。结果 单细胞凝胶电泳结果显示,γ射线照射后DNA损伤情况明显加重,随照射剂量的增加,细胞尾矩不断加大,0 Gy组尾矩为0.24,4 Gy照射组尾矩为5.26;免疫荧光结果显示,随着照射剂量的增加,γH2AX焦点数目及大小均明显增加,照射的剂量范围从0.1~4 Gy均可检测,且照射剂量和焦点形成数目之间存在剂量-效应关系,0.1 Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达12.37个,4 Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达46个;2 Gy γ 射线照射后24 h仍可检测到γH2AX焦点,随时间延长焦点数目减少、强度减弱,具有时间依赖性。流式细胞检测结果表明,γ 射线照射后γH2AX 蛋白表达量明显增加,呈现明显量效关系,0.1和4 Gy照射组γH2AX阳性细胞表达率分别为7.4%和29.2%。结论 免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目比其他实验方法更能敏感、直观的反映DNA损伤及修复情况,有望成为检测辐射损伤的理想生物指标。     

重组人粒细胞集落刺激因子对8Gy γ射线照射大鼠凝血系统的影响

目的探讨造血细胞因子重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）对8Gyγ射线照射大鼠凝血系统的影响。方法分析照射对照组和rhG-CSF治疗组照射前、照射后3、7、11、15、21和30d的血常规、血小板聚集、凝血四项以及血栓弹力图（TEG）的变化。结果rhG-CSF治疗组动物活存率增加,外周血白细胞、红细胞和血小板数目较照射对照组明显升高（P〈0.05）;发现rhG-CSF治疗可逆转辐射后活化部分凝血活酶时间（APTT）缩短（P〈0.05）,加快TEG血栓形成速度,增加血栓形成最大幅度（P〈0.05）。结论rhG-CSF能明显促进8Gyγ射线照射大鼠造血功能恢复,并改善辐射后凝血功能异常。     

γ射线照射对肺腺癌细胞迁移能力的影响及其分子机制

目的探讨辐射对肺腺癌A549细胞迁移能力的影响及其所依赖的信号通路。方法划痕实验检测2和4 Gyγ射线照射后A549细胞的迁移能力,Western印迹实验检测STAT3及磷酸化STAT3水平,ELISA法检测IL-6的分泌水平,间接免疫荧光染色观察STAT3在细胞内定位情况。结果 2或4 Gyγ射线照射均能显著增强A549细胞的迁移能力,并能激活STAT3的磷酸化,促进STAT3入核以及IL-6的分泌。JAK-2激酶特异性抑制剂AG490能阻断辐射诱导的STAT3磷酸化并进一步抑制辐射诱导的A549细胞迁移。结论本研究结果表明辐射能通过激活JAK-2/STAT3信号通路促进A549细胞的迁移,而IL-6可能参与了辐射诱导的JAK-2/STAT3信号通路的激活。     

大鼠皮肤急性深Ⅱ度β射线损伤创面愈合过程中的对比观察

目的观察大鼠皮肤急性深Ⅱ度β射线损伤创面自然愈合过程中β_1整合素表达阳性细胞的动态变化,探讨急性β射线皮肤损伤创面的难愈机制。方法将96只SD大鼠随机分为实验组(48只)与对照组(48只),实验组建立大鼠皮肤急性深Ⅱ度β射线损伤创面模型;对照组建立大鼠皮肤深Ⅱ度热力烫伤创面模型。分别于伤后1 d、3 d、7 d、14 d、21d、28 d、35 d记录创面变化,并取创面组织标本,行HE染色和免疫组化染色,观察创面愈合过程中的组织变化和β_1整合素阳性细胞的变化。结果实验组大鼠创面愈合时间较对照组长,经统计学分析,差异有统计学意义(P0.01);通过对β_1整合素的检测发现,照射及烫伤后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d的β_1整合素阳性细胞IOD值比较,差异有统计学意义(P0.05),对照射及烫伤后28 d、35d的β_1整合素阳性细胞IOD值进行比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论皮肤急性深Ⅱ度β射线损伤创面愈合时间相对缓慢,且在愈合过程中β_1整合素阳性细胞增殖分化延迟,可能是皮肤急性深Ⅱ度β射线损伤创面延迟愈合的原因之一     

X射线和γ射线预处理对小鼠异基因骨髓移植后造血免疫重建的影响

目的 研究X射线和γ射线两种预处理方式造成的损伤程度的差别,以及对造血、免疫重建的影响,确定适用于异基因造血干细胞移植的预处理照射方式.方法 对受鼠分别使用直线加速器X射线或60Coγ射线进行致死剂量(总剂量为7.0 Gy)全身照射后,给予相同数量供鼠骨髓细胞移植.观察受鼠移植后的生存时间、重要脏器(肝、小肠和肺)病理...     

参苓白术复方提取物抗放射性肠损伤作用的实验研究

目的探讨中药参苓白术复方对放射性小鼠肠损伤模型的治疗作用。方法 MTT法检测复方对辐照后小肠上皮细胞的增殖作用。小鼠腹部局部照射后立即灌胃中药复方,测定小鼠体质量,记录腹泻和存活情况,取小鼠空肠切片进行HE染色,观察肠道病理改变。结果体外实验显示,参苓白术复方能明显促进辐照后小肠上皮细胞的增殖。治疗组小鼠一般状况和小肠病理切片明显得到改善,腹泻减少,小鼠存活率明显提高。结论中药复方参苓白术对辐射性肠损伤小鼠有明显的保护作用,为其应用于临床放射性肠损伤提供了实验依据。     

双氢青蒿素对辐射小鼠血液系统的保护作用

目的研究双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）对辐射损伤小鼠血液系统的保护作用。方法40只昆明小鼠,随机分为5组（DHA低、中、高剂量组、空白对照组和正常组）,除正常组外,其余各组给予4．5Gy^60Co—γ射线全身照射,以外周血白细胞、血小板计数观察辐射后小鼠血液系统的变化,并筛选出药物的合适剂量;另取24只小鼠．随机分为3组（用药组、对照组、正常组）,以此前确定的最适剂量于照射前灌胃给药,予9．0Gy^60Co-γ射线全身照射,照射后第9天处死小鼠,通过骨髓病理组织学改变进一步观察对小鼠造血系统的影响。结果双氢青蒿素使辐射后小鼠血小板升高（P〈0．01）,可降低死亡率,促进骨髓增生,对白细胞无明显影响。结论双氢青蒿素促进辐射小鼠血小板恢复．对小鼠血液系统有保护作用。