甲状腺乳头状癌组织及外周血中miR-146a含量变化

目的探讨miR-146a含量变化在甲状腺乳头状癌（PTC）发生发展过程中的作用及意义。方法应用荧光定量聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）检测43例PTC、36例结节性甲状腺肿组织的miR-146a含量变化及32例PTC、23例结节性甲状腺肿患者外周血的miR-146a含量变化,并根据PTC患者主要临床病理参数进行分析。结果①PTC与结节性甲状腺肿组织中miR-146a相对含量分别为0．0280±0．0131和0．0212±0．0111,差异有统计学意义（P〈0．05）;PTC组织的miR-146a含量变化与患者淋巴结转移、肿瘤分期等临床病理参数有明显关系（P〈0．05）,与患者年龄、肿瘤大小等无关（P〉0．05）。②PTC与结节性甲状腺肿外周血中miR-146a相对含量分别为0．0891±0．0419和0．09224-0．0456,2者差异无统计学意义（P〉0．05）;PTC外周血的miR-146a含量变化与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期等无相关性（P〉0．05）。结论miR-146a在PTC中表达升高,与淋巴结转移、肿瘤分期等临床病理参数有明显关系,多见于进展期,提示miR-146a在PTC的发生发展过程中起-定作用。     

乳腺癌线粒体DNA拷贝数改变的研究及意义

目的:用实时定量PCR对乳腺癌组织线粒体DNA的拷贝数进行检测,探讨线粒体DNA拷贝数改变与乳腺癌的关系。方法:对30例乳腺癌患者组织及其相应外周全血、30例健康献血员外周全血标本的线粒体DNAD-loop区克隆并制备标准品;用实时定量PCR检测标本线粒体DNA的拷贝数。结果:乳腺癌组织线粒体DNA的拷贝数平均值为7.75×1013copy/μgDNA,高于其相应外周血的平均值3.22×1011copy/μgDNA(P<0.05)和对照的平均值6.55×1010copy/μgDNA(P<0.05)。结论:线粒体DNA拷贝数改变与乳腺癌发生有关。     

甲状腺肿瘤细胞DNA含量分析

本文应用流式细胞术对６６例甲状腺肿瘤进行了ＤＮＡ含量分析。结果表明２６例甲状腺腺癌中，１１例为ＤＮＡ异体，１２例为近二倍体；不同类型的甲状腺癌之间，ＤＮＡ含量无统计学差异，但ＤＮ含量与组织学分化程度密切相关。４０例甲状腺腺瘤中，仅２例为ＤＮＡ异倍体，与甲状腺腺癌相比，甲状腺癌的异倍体率明显升高（Ｐ〈０．０１）；且２例经重新复习切片，１例被确确诊为滤泡性癌另１例伴有不典型增生，因此，流式分析ＤＮＡ含     

食管鳞状细胞癌组织中线粒体DNA含量及拷贝数量的变化

目的:比较食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常食管组织中线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)含量及拷贝数量的差异,探讨mtDNA与食管鳞状细胞癌发生、发展的关系.方法:应用半定量PCR法分别扩增62例食管鳞状细胞癌组织及其相应的癌旁组织和正常食管组织中的mtDNA编码区,琼脂糖凝胶电泳比较3种组织中mtDNA含量的差异;利用荧光定量PCR技术定量检测上述3组样品中的mtDNA拷贝数,并采用琼脂糖凝胶电泳对mtDNA含量进行定性检测.结果:食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中mtDNA的检出率均为100%(62/62),但食管鳞状细胞癌组织中mtDNA相对含量高于癌旁组织及正常食管组织(P＜0.05).食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常食管组织中mtDNA的平均拷贝数分别为(26.79±0.92)×106、(26.43±0.96)×106和(25.42±0.85)×106,3组间比较差异有统计学意义(F=37.532,P＜0.05).2种PCR结果一致.结论:mtDNA拷贝数量的增加与食管鳞状细胞癌的发生、发展密切相关.     

胆囊癌组织中线粒体DNA含量变化的研究

目的探讨线粒体DNA(mt DNA)含量的改变与胆囊癌的关系。方法通过实时荧光定量PCR检测30例胆囊癌组织、30例胆囊癌旁组织和30例胆囊良性病变组织标本中mt DNA的含量。结果胆囊癌组织中mt DNA的平均含量为(766±143)×10~6拷贝/L,胆囊癌旁组织中mt DNA的平均含量为(343±94)×10~6拷贝/L,胆囊良性病变组织中mt DNA的平均含量为(386±104)×10~6拷贝/L,胆囊癌组织中mt DNA平均含量分别高于胆囊癌旁组织(t=11.583,P<0.001)和胆囊良性病变组织(t=13.320,P<0.001)。胆囊癌组织中mt DNA含量的改变与患者性别、年龄及肿瘤分化程度无关(P>0.05)。胆囊良性病变组织与胆囊癌旁组织中mt DNA的平均含量比较,差异无统计学意义(t=1.673,P=0.107)。结论胆囊癌发生与mtDNA含量增加可能相关,mtDNA含量的检测是胆囊癌诊断的一种方法。     

结直肠癌线粒体DNA拷贝数改变及4977片段缺失

目的 探讨结直肠癌（colorectal cancer,CRC）线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数异常、线粒体DNA 4 977 bp大片段缺失与TNM分期和分化程度的关系.方法 选取118例石蜡标本大肠癌组织,分别提取总DNA.以ND1和β-actin为目的基因,进行SYBR Green荧光定量PCR扩增,并用PCR扩增方法检测4 977片段缺失情况,探讨它们与不同TNM分期和分化程度之间的关系.结果 CRCⅠ和Ⅱ期癌组织平均拷贝数（2ND1/β-actin）分别为128.42±31.25和115.12±47.15,Ⅲ和Ⅳ期癌组织平均拷贝数为105.22±16.35和99.45±28.46.Ⅰ和Ⅱ期的拷贝数明显高于Ⅲ和Ⅳ期的拷贝数（P〈0.01）,癌组织低、中、高分化的平均拷贝数分别为101.34±41.35、112.33±42.32和127.22±31.23（P〈0.01）,4 977片段缺失率为15.25%（18/118）,线粒体DNA4977bp缺失与患者的分期呈负相关,与分化程度无明显关系.结论 线粒体DNA 4 977 bp缺失在大肠癌的早期阶段起到了重要作用,随着肿瘤的进展,拷贝数逐渐减少,线粒体DNA拷贝数的变化及大片段缺失在肿瘤的发病机制中可能起一定作用.     

动物组织线粒体DNA研究进展

线粒体基因组也叫线粒体DNA（mtDNA,Mitochondrial DNA）,结构与细菌DNA相似,呈双链环状,可独立编码一些蛋白质,是核外遗传物质,人们在线粒体中已发现RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体等全套装备,说明线粒体具有独立的遗传体系。     

石蜡包埋淋巴瘤组织线粒体DNA的提取及PCR扩增

目的:探讨从石蜡包埋组织标本获取线粒体DNA (mtDNA)并进行PCR扩增的有效方法。方法:选取27例石蜡包埋的淋巴瘤组织,分别使用二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20进行脱蜡,改进裂解缓冲液的成分及浓度,酚/氯仿抽提以获取mtDNA并进行电泳和PCR分析。结果:0.5% Tween-20法获取mtDNA纯度及浓度含量明显高于二甲苯/乙醇法(P<0.01);二甲苯/乙醇法和0.5% Tween-20法获取的mtDNA PCR扩增成功率分别为11.1%和40.7%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20两种方法都可以扩增出mtDNA的目的片段,但0.5% Tween-20法操作简便,PCR扩增成功率高,不用接触二甲苯等有毒化学试剂,是一种较为理想的mtDNA提纯方法。     

LYVE-1 在甲状腺乳头状癌的表达和意义

目的 观察淋巴管透明质酸受体1（LYVE-1）的表达和癌周组织中淋巴管的生成情况在甲状腺恶性肿瘤的变化及转移中的作用。方法 应用免疫组织化学和real-time PCR方法检测45 例甲状腺乳头状癌中央区、癌周边区和正常甲状腺组织中的LYVE-1及其mRNA 表达情况,并计算淋巴管密度（LVD）。结果 甲状腺乳头状癌周边区LVD 高于甲状腺乳头状癌中央区,而正常组织中很少见LYVE-1 阳性的微淋巴管;甲状腺乳头状癌周边区LVD 与淋巴结转移有密切关系（P＜0.05）。结论 LYVE-1是一种特异性较高的淋巴管内皮特异性标志物,对淋巴管生成促进甲状腺乳头状癌的淋巴结转移。     

一种改进的提取人外周血和组织线粒体DNA的方法

目的：建立一种简便、快捷地从人外周血和组织中制备高质量线粒体DNA的方法。方法：以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚／氯仿抽提,TE或ddH2O溶解。然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定并和其他现有方法制备的线粒体DNA用PCR进行长片段扩增,比较扩增效果。结果：用改进的方法制备的线粒体DNA中没有检测到核DNA,并能有效扩增8kb长的目的片段。结论：改进后的方法简便、快捷,制备的线粒体DNA纯度高,也有利于长片段PCR扩增。     

实时荧光定量PCR法检测EG-1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

目的：通过实时荧光定量PCR法检测内皮衍生基因-1(EG-1)的基因在甲状腺癌组织中的表达,探讨EG-1与甲状腺癌发生、发展的关系。 方法：选取38例甲状腺乳头状癌患者（病例组）和15例良性甲状腺疾病患者的甲状腺组织(对照组）,采用实时荧光定量PCR法检测甲状腺组织中EG-1基因的表达,同时应用免疫组化学法检测EG-1的表达水平。结果：免疫组织化学结果显示, EG-1主要定位于癌细胞的细胞质,甲状腺乳头状癌组织中EG-1 mRNA和蛋白表达水平明显高于良性甲状腺疾病患者 (P<0.05)。EG-1 mRNA表达与组织学分级有关(P<0.05),与性别、年龄无明显关联性(
P>0.05)。结论：EG-1基因在甲状腺乳头状癌组织中表达明显增高,EG-1基因可能在甲状腺癌的发生、发展中起重要作用。     

甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织和血清中miR-21表达水平检测及其意义

目的：检测甲状腺乳头状癌（PTC）患者肿瘤组织和血清中miR-21的表达情况,并阐明其临床意义。方法：选择46例PTC患者、35例结节性甲状腺肿患者和18名正常体检者作为研究对象。采用Real-time PCR法检测研究对象甲状腺肿瘤组织（正常人为甲状腺组织）和血清中miR-21表达水平并进行比较。分析PTC患者肿瘤组织和血清中miR-21表达水平与临床病理特征的关联性。结果：PTC患者肿瘤组织和血清中miR-21相对表达水平为2.74±1.53和0.21±0.08,明显高于结节性甲状腺肿患者(0.92±0.81和0.08±0.05)和正常人(0.86±0.39和0.07±0.03) (P<0.05)。PTC患者肿瘤组织和血清中miR-21的表达与腺外侵润、远处转移、淋巴结转移和不同TNM分期有关联(P<0.05),与性别和肿瘤大小无关联。结论：miR-21在PTC患者肿瘤组织和血清中的表达水平升高,其表达水平与PTC临床病理特征有关联;PTC肿瘤组织和血清中miR-21的检测可能用于PTC临床诊断。     

甲状腺乳头状癌中CK19表达与其生物学行为的关系

目的:检测细胞角蛋白19(CK-19)在甲状腺乳头状癌组织中的表达,探讨其在甲状腺乳头状癌发生发展中的作用。方法:用RT-PCR和免疫组织化学(EnvisionTM)法检测36例甲状腺乳头状癌,19例良性甲状腺疾病及8例正常甲状腺组织中CK19mRNA和蛋白的表达。结果:CK19基因mRNA和蛋白表达一致,在甲状腺乳头状癌组与其他非癌组间的表达差异均具有显著性;CK19mRNA在有淋巴转移组的表达水平明显高于无淋巴转移组,差异有显著性。结论:CK19基因在甲状腺乳头状癌中表达明显增加且与转移有关,提示CK19可能参与了甲状腺乳头状癌的发生发展,并对肿瘤的肿瘤转移有促进作用。     

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的：制备NIDD基因TaqMan探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR（FQ-PCR）,以进一步研究NIDD的表达情况。方法：采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区（CDS）片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果：RT—PCR法扩增出一特异产物与预期长度112bp相符,DNA序列测序的结果与C,eneBank提供的已知序列（AB098078）比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112bp完全相同,与NIDD基因100％同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0．99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10％。结论：采用RT．PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqMan探针。     

荧光定量PCR技术检测流产组织中人细小病毒B19的感染

目的 比较荧光定量PCR(FQ-PCR)与PCR在检测自然流产组织人细小病毒B19(HPV B19)感染临床应用中的优劣.方法 收集自然流产病例41例以FQ-PCR与PCR分别进行流产组织的HPVB19 DNA检测.结果 FQ-PCR HPVB19DNA的阳性检出率为51.20%,PCRHPVB19DNA的阳性检出率为36.56%,两种方法的阳性检出率经统计学检验具有统计学差异(P＜0.05).结论 FQ-PCR的灵敏性较PCR高,能更加清楚地了解HPVB19在体内的存在状态.     

HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义

目的通过与血清标志物(HBV-M),血清ALT的比较,探讨血清乙肝病毒DNA荧光定量PCR检测的临床意义及其与病毒复制程度变化的关系与原因.方法采用FQPCR法对慢性乙肝病人进行血清HBVDNA定量检测并与血清中乙肝标志物及血清ALT进行相关性分析.结果血清HBVDNA水平与HBvM表现模式有关,其水平变化与HBsAg HBeAg有明显正相关关系,血清HBVDNA水平与ALT成负相关.结论HBV-DNA含量与HBeAg有明显关系,抗HBe阳性患者HBV-DNA含量仍高,病毒突变是其重要原因.HBV-DNA FQPCR检测能更准确地反映病毒复制程度,对乙肝的诊断治疗预后意义重大.     

结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒PET-32a（＋）-16srRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系。并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为102～109copies／μL,灵敏度为lcopy／μL,特异性为100％。高拷贝样品的天问CV为2．65％、批内CV为1．86％,低拷贝样品的天间CV为2．12％、批内CV为0．78％。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值。     

聚合酶链反应扩增大片段mtDNA

目的 :探讨聚合酶链反应 (PCR)扩增大片段线粒体DNA方法。方法 :快速碱裂解法提取线粒体DNA ,长时程PCR扩增出 5 430bp线粒体DNA。结果 :扩增出 5 430bp线粒体DNA产物特异性强 ,产量高。 结论 :该方法反应条件简便、稳定 ,也可用于其它大片段的扩增 ,有一定的实用价值。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.