正常人骨髓成纤维样基质细胞对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226增殖的影响，建立了RPMI8226细胞和HFCL细胞共培养体系，用MTT法测粘附率，台盼蓝拒染法测定生长曲线；流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化，瑞氏—吉姆萨染色后进行分裂指数(MI)测定，Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果显示，与HFCL细胞共培养1小时后，RPMI8226细胞的粘附率为29．4％；生长曲线显示直接接触组RPMI8226细胞生长受抑，而非直接接触组(transwell组)无变化；RPMI8226细胞与HFCL细胞共培养后，直接接触组G1期细胞增高，S期细胞减少；其分裂指数表现为单独骨髓瘤细胞组大于与HFCL直接接触组；直接接触组PCNA表达下调。结论：正常人骨髓成纤维样基质细胞HFCL能抑制骨髓瘤细胞系RPMI8226的增殖，阻止其细胞周期的运行。     

正常人骨髓基质细胞对HL-60和HL-60/VCR 细胞凋亡易感性的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对白血病敏感细胞HL-60和多药耐药细胞HL-60／VCR凋亡易感性的影响，先建立HL-60或HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养体系；采用瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙／溴化乙啶(AO／EB)染色，分别在光镜和荧光显微镜下进行形态学观察；TUNEL检测晚期凋亡细胞，流式细胞术检测细胞周期、凋亡峰和annexin V阳性的早期凋亡细胞；Western blot检测Bcl-2、活化的胱冬蛋白酶(caspase)-3蛋白和P糖蛋白(Pgp)的表达变化。结果表明，经topotecan(TPT)处理后的HL-60和HL-60／VCR细胞，在光镜和荧光显微镜下均有典型的凋亡细胞形态学改变，这些改变具有时间和剂量依赖性；annexin V染色后能检测到早期凋亡细胞；细胞周期显示：G1期细胞比例增高，S期减低，并有明显凋亡峰；TUNEL能检测到许多阳性细胞；同时出现活化的caspase-3，伴有Bcl-2的表达下调，但与HFCL细胞共培养后，经TPT处理的HL-60和HL-60／VCR细胞中早期和晚期凋亡细胞有所减少，凋亡峰减低，而且活化的Caspase-3表达减弱，Bcl-2蛋白表达上调，且以直接接触组为甚。结论：正常骨髓成纤维样基质细胞HFCL能轻度降低白血病HL-60和HL-60／VCR细胞对TPT的凋亡易感性，并有caspase-3和Bcl-2重要信号传导分子的参与。     

HFCL细胞诱导HL-60细胞分化和改变其基因表达谱的研究

本研究探索正常人骨髓成纤维细胞样基质细胞（HFCL）对急性髓系白血病HL-60细胞增殖分化影响的分子机理。采用流式细胞仪检测细胞周期,NBT还原实验和CD11b、CD14、CD13、CD33细胞表面抗原的测定检测细胞的分化;应用基因芯片技术检测HL-60细胞与HFCL细胞共培养前后基因表达谱的改变,并采用半定量RT-PCR、Northernblot对芯片结果进一步验证。结果发现,HL-60细胞与HFCL细胞共培养后,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少;NBT阳性细胞增高,CD11b和CD14的表达增多,并有明显的统计学意义;基因表达谱改变的研究发现,在与HFCL细胞共培养后,HL-60细胞中582个基因表达上调,1323个基因表达下调。结论：HFCL细胞能诱导HL-60细胞部分分化,并能明显改变HL-60细胞的基因表达谱,为研究基质细胞与白血病细胞之间的相互关系及重要信号分子传导途径或cross-talk等提供了新的线索。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究

本研究通过体外实验探讨人可溶性血管内皮生长因子受体1（sFLT-1）对白血病细胞增殖的抑制作用。用RT—PCR检测白血病细胞株K562、HL-60、U937和骨髓LTC—IC VEGF mRNA、VEGF—R1（FLT-1）mRNA的表达，用流式细胞术检测上述细胞VEGF和VEGF—R1（FLT-1）的表达，ELISA法检测细胞培养上清中VEGF的含量，将sFLT-1加入K562、HL-60白血病细胞株和骨髓LTC—IC培养体系中，应用MTT法计算细胞生长的抑制率。结果显示：白血病细胞株K562、HL-60、U937和骨髓LTC—IC均表达VEGF，以K562表达VEGF量最高。K562和HL-60细胞株还表达FLT-1，U937细胞和骨髓LTC—IC表达的FLT-1表达量很低。sFLT-1明显抑制白血病细胞株K562及HL-60的生长，并且随着sFLT-1浓度的增加，其抑制率增加，以用药后48小时抑制作用最明显。结论：sFLT-1能够抑制某些白血病细胞株的生长，其抑制效应随用药浓度的增加而增加，而sFLT-1对正常骨髓细胞增殖无影响。     

周期蛋白A在白血病细胞中表达意义的临床与实验研究

不断增殖是肿瘤的基本特征。一些基本的细胞周期调控分子参与了肿瘤的形成。细胞周期蛋白A(cyclinA)是在Gl／S期表达的细胞周期蛋白(cyclin)，其异常高表达参与了肿瘤的形成。为了探讨cyclin A异常高表达与白血病细胞恶性增殖的关系，采用流式细胞仪胞浆内间接免疫荧光／DNA双染色法半定量分析了急性白血病患、门诊接受骨髓穿刺的患、健康献血这三种不同来源的外周血或骨髓标本细胞，以及白血病细胞系(HL—60)cycl?nA表达水平。为了进一步研究cyclinA在白血病细胞增殖中的作用，用在体内、体外均有抗肿瘤作用的六亚甲基二乙酰胺(HMBA)在体外抑制白血病细胞系HL—60增殖，并诱导其分化。增殖抑制效应采用四唑盐还原试验和细胞周期分析来检测。细胞表面分化抗原CD33、CDllb改变来检测分化。结果发现，两组来自白血病标本的细胞S期cyclin A(即急性白血病患外周血或骨髓幼稚细胞和白血病细胞系)表达阳性率要远远高于另两组(门诊骨髓穿刺的患骨髓细胞和健康献血员外周血细胞)；在HMBA抗肿瘤细胞系HL—60增殖实验中发现随药物剂量的加大，增殖抑制和分化程度呈剂量依赖性；同时，胞内cyclinA蛋白表达水平被明显下调了，也呈剂量依赖性。结论：白血病细胞S期cyclin A异常高表达，HMBA能下调S期cyclin A表达水平，且随着胞内S期cyclinA表达下调，细胞增殖被抑制和分化程度亦不断加深，两均呈剂量依赖性，这证明了下调cyclinA表达是HMBA技白血病细胞系增殖的主要机理，同时提示cyclinA的异常高表达参与了白血病恶性增殖的环节。     

白血病与非白血病骨髓间充质干细胞对HL-60细胞影响的比较研究

本研究比较急性髓系白血病（AML）骨髓间充质干细胞（BMMSC）,完全缓解AMLBMMSC以及非白血病BMMSC对HL-60细胞的影响。HL-60细胞分为3组：与AMLBMMSC共培养组、与完全缓解AMLBMMSC共培养组以及与非白血病BMMSC共培养纽。在规定时间比较各组HL-60细胞计数、各纽HL-60细胞的CD11b和survivin蛋白表达、各组HL-60细胞周期分布;在光学显微镜下观察各组HL-60细胞形态并比较其分化率。结果表明：第5天和第7天各组HL-60的细胞计数无统计学差异（P值均〉0．05）;各组HL-60细胞G0／G1期细胞分布比例、survivin表达和CD11b表达无统计学差异（P值均〉0．05）;各组HL-60细胞的形态皆向成熟方向转化,分化率分别为18．0±3、17．0±1．3、19．0±2．0,比较表明无统计学差异（P=0．23）。结论：未发现各组骨髓MSC对HL-60细胞增殖分化的影响有差异。     

脐带间充质干细胞降低HL-60对阿糖胞苷的敏感性

本研究探讨脐带间充质干细胞（hUC-MSC）对HL-60白血病细胞药物治疗敏感性的影响,为研究hUC-MSC对白血病细胞的调节作用提供资料。体外建立HL-60细胞与hUC-MSC的transwell及直接接触共培养体系;使用流式细胞仪检测阿糖胞苷对HL-60细胞凋亡的影响,并检测与hUC-MSC共培养对HL-60细胞细胞周期的影响;应用RT-PCR和Western blot检测Caspase 3 mRNA和蛋白表达变化;通过transwell共培养体系观察hUC-MSC对HL-60细胞凋亡影响的作用机制。结果表明,与hUC-MSC共培养可以显著减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡（P〈0.05）;hUC-MSC可以将HL-60细胞阻滞于G0/G1期,阻止其进入S期（P〈0.05）;与hUC-MSC共培养可以降低HL-60细胞中Caspase 3 mRNA和蛋白水平的表达（P〈0.05）;transwell体系中hUC-MSC同样可以减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞的凋亡（P〈0.05）。结论：hUC-MSC通过分泌可溶性细胞因子减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡,其机制可能与通过调节HL-60细胞周期及下调Caspase 3表达有关。     

抑制SDF-1活性对人急性髓性白血病HL-60细胞系增殖的影响

本研究通过观察抑制SDF-1活性对HL-60细胞增殖活性的影响，探讨趋化因子SDF-1在维持HL-60细胞生存能力中的作用。培养骨髓基质细胞，并与HL-60细胞共培养，采用SDF-1受体CXCR4单克隆抗体阻断SDF-1生物活性后，用MTT法检测HL-60细胞活力、用流式细胞术观察HL-60细胞增殖周期变化、检测细胞膜表面CXCR4表达，同时检测CXCR4单克隆抗体应用前后HL-60细胞内钙离子浓度变化。结果显示，抗CXCR4单克隆抗体可下调HL-60细胞膜表面CXCR4的表达，同时处于G0／G1期的细胞增多，处于S期的细胞减少，而白血病细胞存活率下调，细胞内钙离子浓度降低。结论：抑制SDF-1活性可在一定程度上抑制白血病细胞的增殖。     

VEGF及其受体在恶性血液细胞系HL-60及Raji的表达

为了探讨血管内皮生长因子(VEGF)在恶性血液病中的作用，以恶性血液细胞系HL-60和Raji为实验对象，应用RT-PCR及ELISA法检测肿瘤细胞。VEGF基因的表达，并采用免疫组织化学染色法测定细胞表面VEGF受体Fit-1的表达。结果显示：髓性白血病细胞系HL-60和淋巴瘤细胞系Raji中均存在VEGF—mRNA的表迭。在培养48小时后，HL-60细胞和Raji细胞的培养上清液中VEGF含量明显高于正常人外周血单个核细胞。VEGE-R(Flt-1)在两种肿瘤细胞的胞膜上均有表达，而正常人外周血单个核细胞上无表迭。这一结果表明，白血病和淋巴瘤细胞具有产生VEGF的能力，并可将VEGF分泌到细胞外基质微环境中。VEGF可作用于白血病和淋巴瘤细胞本身，在恶性血液肿瘤细胞中存有VEGF的自分泌途径，而VEGF的自分泌成为血液肿瘤细胞高侵袭性生物学特性的基础。结论：抑制VEGF的分泌将有助于阻断其与内皮细胞间的互动环，降低其增殖、抗凋亡和侵袭性能．对提高肿瘤细胞对化疗的敏感性也将十分有意义。     

二烯丙基二硫化物对HL-60白血病细胞株VEGF表达及分泌的影响

为了研究二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide，DADS）对白血病HL-60细胞株VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白分泌的作用，并从影响VEGF生成的角度探讨DADS的抗白血病机制，应用ELISA法检测药物作用前后白血病HL-60细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量；RT-PCR法检测药物作用前后白血病HL-60细胞VEGF mRNA的相对含量。结果表明：HL-60细胞中均有VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白的分泌；与空白对照相比，DADS3个浓度组（0，625，1，25，2，5μg／ml）作用HL-60细胞48小时和72小时均能下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌（P〈0.01）。3个浓度组间差异显著（P〈0．01），其下调HL-60细胞VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌效果与浓度相关（r〉0.9，P〈0．01）。结论：DADS可能通过抑制VEGF mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌发挥抗白血病效应。     

c-myb反义寡脱氧核苷酸对白血病细胞HL-60的生物效应

为了研究c-myb在髓系白血病细胞的增殖和分化中所起的调控作用,合成了与c-myb mRNA翻译起始区域互补的一段反义寡脱氧核苷酸(18bp),将其作用于白血病细胞系HL-60细胞,观察到细胞生长抑制率平均为55%。经过c-myb反义寡脱氧核苷酸片段作用HL-60细胞,c-myb mRNA的表达不能被RT-PCR方法检测到,而在未加反义序列组和加随机序列组细胞中则能检测c-myb的表达。NBT染色后在Wright-Giemsa细胞涂片上可观察到未经处理和随机序列处理的95%HL-60细胞处于未分化阶段,经过c-myb反义寡脱氧核苷酸作用后的细胞中NBT阳性细胞占50％,部分细胞出现分化状态。     

α-乳香酸对HL-60细胞株VEGF分泌及其Flt-1受体表达的影响

[目的]探索不同浓度α-乳香酸作用于白血病细胞株HL-60细胞末同时间后,细胞血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达及VEGF蛋白分泌及受体Flt-1的变化。[方法]MTT法检测乳香酸对细胞增殖的抑制作用,选择适当的药物浓度及作用时间;RT-PCR法检测α-乳香酸处理前后HL-60细胞中VEGFmRNA表达水平;流式细胞术检测α-乳香酸处理前后细胞中VEGF和受体Flt-1蛋白表达水平。[结果]α乳香酸在15．0mg／L时在体外能下调HL-60细胞VEGFmRNA的表达和VEGF蛋白的分泌并呈时间与剂量依赖性（P〈0．05）。[结论]α-乳香酸在体外可以抑制急性早幼粒细胞白血病血管新生,其作用可能与下调VEGF及Fit-1有关,具有抗白血病效应。     

神经毡蛋白-1在急性髓系白血病细胞中的表达和作用

本研究旨在探索神经毡蛋白(neuropilin-1,NRP-1)和NRP-2在髓系白血病细胞中的表达及抑制NRP-1基因表达后对白血病细胞生长和迁移的影响.采用RT-PCR观察NRP-1和NRP-2 mRNA在24例急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞(MNC)及7种髓系白血病细胞系中的表达;以小干扰RNA(siRNA)干扰NRP-1基因在HEL细胞的表达,用MTT和细胞迁移试验观察细胞增殖、迁移的变化.结果显示NRP-1在24例AML患者骨髓MNC中表达,其阳性率为100%,显著高于正常对照组67%(p=0.03).79%AML患者表达NRP-2,67%正常人表达NRP-2,两者无明显差异(p=0.6).NRP-1的表达与AML患者骨髓、外周血原始细胞比例呈正相关(r=0.5,r=0.4,p＜0.05).NRP-1和NRP-2 mRNA分别在6/7和3/7种髓系白血病细胞系表达.用siRNA转染HEL细胞24小时后NRP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低,当有VEGF165作用时,对照组细胞增殖明显增加,而干扰组无变化(MTT值对照组vs干扰组0.6±0.01 vs 0.49±0.02,p＜0.001).转染24小时后干扰组细胞迁移显著降低,其迁移细胞数干扰组vs对照组为500±17 vs 123±7(p＜0.001).结论NRP-1在AML患者骨髓MNC中表达增高,并在髓系白血病细胞的增殖和迁移中起重要作用.     

川芎嗪影响血管内皮生长因子诱导HL-60白血病细胞增殖的效应

背景:川芎嗪抑制血管内皮生长因子的表达,但对其诱导HL-60白血病细胞增殖是否有抑制效应尚需进一步实验.目的:观察川芎嗪对血管内皮生长因子诱导的白血病细胞HL-60细胞增殖的影响.设计:重复测量观察.单位:武汉科技大学医学院.材料:实验于2007-03/06在武汉科技大学医学院分子生物学实验中心完成.人白血病细胞系HL-60细胞购于上海细胞生物研究所.盐酸川芎嗪注射液为无锡市第七制药有限公司产品, 批号为011014,硫酸鱼精蛋白注射液购自上海第一生化药业公司,批号为010302, 免疫组化试剂盒购自博士德公司.方法:①取对数生长期人白血病细胞系HL-60细胞,加入100 μg/L 血管内皮生长因子,分别加入终浓度为1.5,15,150 mg/L川芎嗪实验培养基,以未加川芎嗪注射液的细胞为空白对照组,只含20 mg/L鱼精蛋白的细胞为阳性对照组,同时设立血管内皮生长因子对照组,细胞培养48 h后,采用MTT法检测HL-60细胞的生长抑制率.②川芎嗪影响HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达实验:用终浓度为1.5,15及150 mg/L川芎嗪处理HL-60细胞,24 h后采用免疫组织化学法计算血管内皮生长因子蛋白阳性细胞表达率.主要观察指标:① HL-60细胞生长抑制率.②血管内皮生长因子蛋白表达情况.结果:① HL-60细胞生长抑制率:川芎嗪15, 150 mg/L作用血管内皮生长因子诱导的HL-60细胞吸光度值均低于血管内皮生长因子对照组,差异有显著性意义(P < 0.05).②血管内皮生长因子蛋白表达情况:川芎嗪作用HL-60细胞24 h后,血管内皮生长因子蛋白随川芎嗪给药浓度升高表达逐渐下调,呈一定依赖性,各川芎嗪浓度干预HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达阳性细胞表达率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01).结论:川芎嗪可抑制血管内皮生长因子诱导HL-60细胞的增殖, 并下调血管内皮生长因子蛋白的表达.     

雷帕霉素对急性髓系白血病细胞系HL-60和HL-60/VCR生长的抑制作用

为了探讨mTOR抑制剂雷帕霉素对急性髓系白血病（acute myeloid leukemia;AML）细胞的增殖和药物敏感性的影响。以AML细胞株HL-60和多药耐药HL-60/VCR细胞系为研究对象,采用MTT法测定生长曲线和流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测P糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）的表达。结果显示：与空白对照组细胞比较,雷帕霉素能抑制HL-60和HL-60/VCR细胞生长增殖（p〈0.05）,且随着浓度升高,增殖抑制率逐渐增高,24-72小时的细胞增殖抑制率随着时间的延长而有所增高（p〈0.05）,同时可阻滞细胞从G1期到S期的细胞周期转换。雷帕霉素抑制HL-60/VCR细胞的Pgp蛋白的表达。与柔红霉素单独应用相比,雷帕霉素50nmol/L、100nmol/L与柔红霉素联合应用使HL-60和HL-60/VCR细胞增殖抑制率明显增高（p〈0.05）,尤其是当先加雷帕霉素,而24小时后再加柔红霉素时。结论：mTOR抑制剂雷帕霉素对HL-60和多药耐药的HL-60/VCR细胞的生长均有抑制作用,除伴G0/G1期阻滞外,还增加细胞对柔红霉素的敏感性,这为临床难治性AML治疗提供新的治疗手段。