EB病毒相关胃癌组织中病毒潜伏期基因表达的研究

Epstein Barrvirus(EBV)与多种人类恶性肿瘤如鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤和免疫功能缺陷病人的淋巴组织过度增生性疾病等密切相关 ,近年来研究表明约 2 %～ 16 %的胃癌组织EBV阳性。EBV具有潜伏感染的特点 ,通常认为EBV潜伏期基因如核抗原家族基因 (EBNAs)和潜伏膜蛋白基因 (LMP) 1与病毒的细胞转化功能有关。明确EBV在肿瘤组织中的存在状态和表达活动 ,是研究其致癌机理的基础。本研究首先应用PCR Southern杂交检测 12 6例胃癌和相应癌旁组织中EBVDNA ,进一步采用原位杂交检测PCR阳性标本石蜡包埋组织中EBV编码小RNA(EBER1…     

EBV潜伏膜蛋白LMP2A的研究进展

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与多种人类恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(na-sopharyngeal carcinoma,NPC)、何杰金氏病(Hodgkin’s disease,HD)等的发生有关,肿瘤组织中EBV主要以潜伏感染的形式存在。在EBV潜伏感染细胞中,可表达的EBV基因有10多种,包括EBV核抗原(EB nuclear antigen,EBNA)1,2,3A,3B,3C和LP;潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP)1,2A和2B;EBV编码的小RNA(EBER)1和2;以及BamHⅠ-A向右开放读码框(BARF0)的转录产物。NPC和其他EBV相关恶性肿瘤中可持续检测到LMP2A的转录物,提示LMP2A在体内病毒持续感染和EBV相关疾病中可能有重要作用。     

潜伏期膜蛋白1与疾病关系的研究进展

EB病毒(EBV)是一种普遍存在的致癌病毒,是高度相关的淋巴和上皮肿瘤的来源和发展,包括伯基特淋巴瘤和鼻咽癌(NPC)等,EBV基因几乎可以在所有细胞中。EBV感染通常与少数潜伏病毒功能的蛋白质表达,包括潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A等和巴尔核抗原1(EBNA1)。LMP1是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,被认为是EBV的主要致瘤蛋白。在EB病毒中通过2个C末端结构域编码基因蛋白LMP1信号来驱动细胞生长,存活和转化。LMP1蛋白目前是惟一已被证实的EB病毒的癌基因,LMP1的表达参与了肿瘤的发生与发展,是目前癌症方面研究的重点。     

EB病毒潜伏膜蛋白2的研究回顾

Epstein Barr病毒 (EBV)属于疱疹病毒科γ亚科 ,在人类中广泛传播。大多数EBV的初次感染是在患者幼儿时期 ,而且没有明显的临床症状 ,终身携带病毒。EBV与越来越多的人类肿瘤相关 ,包括由于免疫抑制引起的免疫增生性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、NPC、HD和多种T细胞淋巴瘤等疾病。EBV潜伏感染时表达 8种蛋白 (6种核蛋白EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNALP和 2种膜蛋白LMP1和LMP2 )。在这些与转化相关的病毒蛋白中 ,EBNA1、LMP1、LMP2是在NPC肿瘤标本和EBV相关肿瘤中可以检测到的蛋白。1　LMP2的功能198…     

EBV潜伏膜蛋白LMP2A的研究进展

EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）与多种人类恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（na-sopharyngeal carcinoma,NPC）、何杰金氏病（Hodgkin＇s disease,HD）等的发生有关,肿瘤组织中EBV主要以潜伏感染的形式存在。在EBV潜伏感染细胞中,可表达的EBV基因有10多种,包括EBV核抗原（EB nuclear antigen,EBNA）1,2,3A,3B,3C和LP;潜伏膜蛋白（latent membrane protein,LMP）1,2A和2B;EBV编码的小RNA（EBER）1和2;以及BamHⅠ-A向右开放读码框（BARF0）的转录产物。NPC和其他EBV相关恶性肿瘤中可持续检测到LMP2A的转录物,提示LMP2A在体内病毒持续感染和EBV相关疾病中可能有重要作用。     

EB病毒潜伏膜蛋白1诱导细胞免疫的研究进展

Epstein-Barr Virus（EBV）是1964年Epstein等发现的。研究证实EB病毒与许多人类肿瘤相关。潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein1,LMP1）是EBV编码的潜伏感染过程中表达的病毒膜蛋白,是较早被确认的病毒癌基因之一。近期研究发现LMP1的氨基酸序列中存在诱导细胞免疫应答的多肽表位。可以诱导LMP1特异性细胞免疫反应。本文就LMP1在细胞免疫应答方面的研究做一介绍：     

CD21非依赖性EB病毒对人胃印戒细胞癌细胞系的感染

目的　探讨CD2 1非依赖性EB病毒 (EBV)对人胃印戒细胞癌细胞系 (HSC 39)的感染作用。方法　用Akata和P3HR 1EBV毒株感染HSC 39,有限稀释法对感染细胞进行克隆。结果　两种EBV毒株感染细胞中均可检测到EBV编码的小RNA(EBER)的表达 ,两种EBV毒株感染的亲代细胞及大多数细胞克隆表达EBV核抗原 (EBNA1) ,但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白 (LMP1)和LMP2A。表现为潜伏Ⅰ型感染。未感染的HSC 39细胞及P3HR 1感染的细胞克隆CD2 1表达阴性 ,而AkataEBV感染的部分细胞克隆CD2 1mRNA阳性。结论　EBV可能通过不依赖CD2 1受体的途径感染HSC 39,印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。     

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析

目的 对EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法 利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a(+)得到pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2(aa195-232)和LMP2(aa419-436)肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量(Mr)约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比(1:5,1:10,1:25)增加,CTL杀伤活性逐渐增强(12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%),同时产生了特异性血清IgG抗体反应(A490=0.258±0.040),与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究没计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.     

EBV LMP1和CMVpp65在肾脏疾病肾组织中的表达

目的 研究非洲淋巴细胞瘤病毒LMP1(EBV LMP1)、巨细胞病毒pp65(CMVpp65)在肾脏疾病患者肾组织中的表达情况,探讨病毒感染与人类肾脏疾病发生、发展的关系.方法 临床资料齐全的肾穿刺活检标本435例,免疫组化法检测EBV LMP1和CMVpp65在肾组织中的表达情况.结果 (1)175例(40.2%)肾组织中EBV LMP1表达阳性,狼疮性肾炎(LN)组及IgA肾病(IgAN)组与非免疫性肾病组及原发性肾炎(PGN)组比较,差异有统计学意义;170例(39.1%)肾组织中CMVpp65表达阳性,LN组与非免疫性肾病组及PGN组比较,差异有统计学意义;(2)PGN组初发患者与复发患者肾组织EBV LMP1、CMVpp65阳性率比较差异有统计学意义,其他病种则无;(3)合并感染与无合并感染患者EBV LMP1、CMVpp65阳性率比较差异均无统计学意义;(4)肾组织EBV LMP1表达阳性的LN患者血清anti-Sm-Ab阳性率高于阴性组(P<0.05,OR=6.00,95%CI:1.200～29.998);而CMVpp65表达阳性者血清anti-Sm-Ab阳性率低于阴性组(P<0.01,OR=0.156,95%CI:0.038～0.643).结论 肾组织EBV及CMV感染可能参与LN及IgAN的发病,其中EBV感染可能以分子拟态方式诱发系统性红斑狼疮.     

Nuclear factor κB represses the expression of latent membrane protein 1 in Epstein-Barr virus transformed cells

AIM: To investigate the role of nuclear factor κB(NF-κB) in the regulation of Epstein-Barr virus(EBV) latent membrane protein 1(LMP1) in EBV transformed cells. METHODS: LMP1 expression was examined in EBV transformed human B lymphocytes with modulation of NF-κB activity. RESULTS: EBV infection is associated with several human cancers. EBV LMP1 is required for efficient transformation of adult primary B cells in vitro, and is expressed in several pathogenic stages of EBVassociated cancers. Regulation of EBV LMP1 involves both viral and cellular factors. LMP1 activates NF-κB signaling pathway that is a part of the EBV transformation program. However, the relation between NF-κB and LMP1 expression is not well established yet. In this report, we found that blocking the NF-κB activity by Inhibitor of κB stimulated LMP1 expression, while the overexpression of NF-κB repressed LMP1 expression in EBV-transformed IB4 cells. In addition, LMP1 repressed its own promoter activities in reporter assays, and the repression was associated with the activation of NF-κB. Moreover, NF-κB alone is sufficient to repress LMP1 promoter activities. CONCLUSION: Our data suggest LMP1 may repress its own expression through NF-κB in EBV transformed cells and shed a light on LMP1 regulation during EBV transformation.     

肺癌患者EBV感染、LMP1和Bcl-2表达状况的研究

目的 研究肺癌患者癌组织中EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染、EBV潜伏膜蛋白1 （latent membrane protein 1,LMP1）和B淋巴细胞瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/Leukemia-2,Bcl-2）的表达及意义。方法 采用原位杂交法（in situ hybridization,ISH）检测肺癌组织标本中EBV编码的小RNA（ EBER1）,免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）检测Bcl-2和LMP1的表达,以GD-6多媒体彩色病理图像分析系统进行形态学定量,以图像的平均面积（average area,AA）和积分吸光度（Integral optical density,IA）表示表达量的多少。结果 在108例肺癌癌组织中36例EBV阳性,阳性率为33.3％;LMP1阳性表达7例,阳性率6.5％。EBV阳性肺癌组中Bcl-2表达显著高于EBV阴性组,其AA分别为58014.23±6918.45和38156.22±4096.79,其IA分别为11.00±1.48和8.03±0.78,差异有统计学意义。进一步分析LMPI和Bcl-2表达的关系,可见LMP1可使Bcl-2表达率增加,但定性分析和定量分析差异无统计学意义。结论 EBV感染使Bcl-2表达增加,可能在肺癌的发生发展中有一定作用。在肺癌组织中EBV可能不是通过LMP1来影响Bcl-2的表达,具体机制有待进一步研究。     

EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究

目的 探讨EB病毒（EBV）对胃癌细胞系的感染作用。方法 用Akata和P3HR－1 EBV毒株感染人胃癌印戒细胞系（HSC－39），有限稀释法对感染细胞进行克隆。结果 EBV感染细胞中可检测到EBV编码的核抗原（EBNA)，2种EBV毒株感染的细胞克隆表现有不同的形态学特征及生长方式。EBV感染的亲代细胞及大部分克隆表达EBNA1，但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白（LMP）1和LMP2A；亲代细胞及所有细胞克隆未观察到裂解感染，EBNA启动子Qp表达阳性，而启动子Cp和Wp未见表达。结论 HSC－39对2种EBV毒株均易感，EBV感染可改变HSC－39的细胞表型，且不同EBV毒株对其影响不同，提示印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。     

鼻咽癌组织中DNA损伤与EB病毒感染的相关性研究

目的分析鼻咽癌(NPC)组织磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的表达水平和EB病毒(EBV)的感染情况,探寻二者的相关性。并用细胞实验进行验证,以阐明EBV诱导DNA损伤应答进而促进NPC发生发展的可能机制。方法选取NPC标本50例和鼻咽炎(NPI)20例,采用免疫组化法检测γ-H2AX及EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,对LMP1阴性标本采用原位杂交方法检测EB病毒编码的RNA(EBER);采用Western blot法检测EBV感染鼻咽癌细胞CNE1后γ-H2AX表达的变化。结果NPC组γ-H2AX的阳性率达94%,显著高于NPI组的40%;EBV阳性率为94%,显著高于NPI组的30%;97.9%EBV感染的NPC组织γ-H2AX阳性,二者表达有相关性(P0.05)。通过Western blot法检测进一步验证,EBV感染可使CNE1中γ-H2AX的表达量增高。结论γ-H2AX表达和EB病毒感染有密切关联性,EBV感染可能是通过诱导细胞DNA损伤,造成基因组不稳定从而促进NPC的发生发展。     

EB病毒编码的潜伏膜蛋白1参与鼻咽癌侵袭和转移的研究进展

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种高转移的肿瘤,其侵袭转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程.Epstein-Barr病毒(EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)见于多数鼻咽癌细胞中,其调控的多条信号通路都与鼻咽癌的侵袭和转移密切相关.研究发现,LMP1通过诱导产生一系列与细胞侵袭和转移相关的因子,包括基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases,MMPs),c-Met,Ets1,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),Ezrin,MUC1和Twist等,参与鼻咽癌的侵袭和转移过程.本文阐述LMP1与鼻咽癌侵袭转移关系研究的新进展.     

RNA激发的DC体外诱导EBV特异性CTL的研究

本研究采用酶切等方法将质粒pSVTP1中LMP2a (latentmembraneprotein 2a)的编码基因克隆至pGEM 3Zf+,再经体外转录系统转录获得EBV LMP2aRNA ,将以此RNA激发的DC所诱导生成的CTL作为效应细胞分别与含EBV基因之一EBNA1、EBNA2、EBNA3c、LMP2a的重组病毒感染的正常人成纤维细胞混合后 ,采用LDH释放法检测细胞毒活性。结果显示 ,经体外转录的LMP2aRNA激发的DC所诱导的淋巴细胞对表达LMP2a抗原的成纤维细胞产生特异性的细胞毒活性 ,证实了这种RNA激发的DC能有效地诱导EBV特异性CTL的生成 ,为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供了新的实验依据。     

2005-2010年北京地区儿童原发性EBV感染流行株EBNA1与LMP1基因特征分析

目的 分析2005-2010年北京地区儿童原发性EBV感染流行株EBNA1与LMP1基因特征,为研究EBV变异株与疾病临床表型间是否存在相关性提供背景资料.方法 应用PCR方法扩增EBV的EBNA3C、EBNA1和LMP1基因片段,测序后应用BioEdit 7.0.9和Mega 4.0.2软件进行序列分析.结果 62例进行了EBV分型,以EBV-Ⅰ型为主,检出率为98％.62例EBNA1基因扩增阳性,其中V-val亚型(均是Vvv1变异株)为98％.50例LMP1基因羧基段扩增阳性,以China 1为主,其检出率为90％.Vvv1变异株和China 1变异株在EBV-IM与EBV-HLH中的检出率差异均无统计学意义(P=1.00).40例进行了多基因连锁分析,其中EBV-Ⅰ型、EBNA1-Vvv1变异株和LMP1-China 1变异株高度连锁,其连锁检出率为90％.35例患儿LMP1基因全长扩增阳性,CG1-CG4的检出率分别为85％、6％、6％和3％.结论 北京地区儿童原发性EBV感染疾病中,EBV亚型以EBV-Ⅰ型为主,Vvv1变异株和China 1变异株分别是EBNA1和LMP1变异株中的优势变异株,且二者高度连锁.儿童原发性EBV感染流行株可以分为CG1-4组,其中以CG1为主.     

鼻咽癌高发区何杰金病EB病毒DNA及潜伏感染膜蛋白检测的意义

为检测鼻咽癌高发区何杰金病中爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）DNA及其表达产物──潜伏感染膜蛋白的存在及探讨其意义，采用热启动聚合酶链反应（PCR）及LSAB免疫组化法结合微波处理技术，检测了选自鼻咽癌高发区的40例何杰金病、20例淋巴结良性病变存档标本中的EBVDNA和潜伏感染膜蛋白（LMP1）。结果显示：65％的何杰金病中EBVDNA阳性，淋巴结良性病变中的阳性率也达50．0％（10例／20例），两者差异无显著性（P＜0．05）。LMP1只在何杰金病肿瘤细胞中表达，其检出率为52．5％（21例／40例）。20岁以下何杰金病中EBVDNA和LMP1的检出率分别为84．6％（11例／13例）和76．9％（10例／13例），皆明显高于20岁以上年龄组（分别为14例／25例，56．0％和10例／25例，40．0％）P＜0．05。本结果表明：鼻咽癌高发区半数以上何杰金病肿瘤细胞中有EBV潜伏感染，并可能在肿瘤的发生发展中起着一定的作用。提示青少年何杰金病和EBV潜伏感染并表达LMP1的关系更为密切。     

EB病毒与乳腺癌的相关性

目的：探讨EB病毒( Epstein-Barr virus, EBV)与乳腺癌发生、发展的相关性。方法随机选取不同发展阶段的乳腺病变组织246例,采用聚合酶链反应( polymerase chain reaction, PCR)、原位杂交( in situ hybridization, ISH)、激光捕获显微切割( laser capture microdissection, LCM)、免疫组化染色EnVision法检测EBV DNA、RNA、蛋白质水平,分析EBV与乳腺癌发生、发展的关系。结果免疫组化标记246例乳腺病变均未检测到EBV潜伏膜蛋白LMP1的表达。 PCR法在乳腺癌(12/23)、原位癌(0/10)以及乳腺良性病变(0/15)中检测到EBV DNA,但用地高辛标记的EBV DNA探针对48例乳腺良、恶性病变组织(包括PCR扩增阳性的12例乳腺癌标本)进行ISH检测,在癌细胞、乳腺上皮细胞和间质淋巴细胞内均未检测到阳性杂交信号。采用LCM PCR检测12例PCR扩增阳性和12例阴性乳腺标本的乳腺上皮细胞和间质淋巴细胞,在12例PCR阳性标本的间质细胞中扩增出EBV DNA,癌组织中未检出EBV DNA。用EBV RNA探针和ISH方法在75例乳腺良恶性病变组织中均未检测到EBER表达。结论在该文选择的标本中,乳腺癌发生、发展与EBV感染无关。     

EB病毒分子免疫学研究进展

1964年Epstein和Barr首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养建立病毒株,并在该病毒株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒,命名为EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)。EBV与多种人类恶性肿瘤有关,研究发现EBV除引起Burkitt’s淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌及NK/T淋巴细胞瘤之外,还与平滑肌肉瘤及胃、乳腺、肺等部位的恶性上皮肿瘤发病有关[1]。EBV致癌谱的扩大使得对其致癌机制的研究具有更广泛的意义[2]。     

EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达

目的　寻找在真核细胞中表达Epstein Barr(EB)病毒潜伏膜蛋白 2 (Latentmembraneprotein 2 ,LMP2 )的有效途径 ,研究LMP2蛋白功能及深入探讨其在诱导细胞免疫应答中的作用。方法　将EB病毒LMP2蛋白的基因重组至逆转录病毒载体LXSN上 ,通过脂质体将重组质粒导入PT6 7细胞 ,G418筛选抗性克隆 ,收集含重组病毒的上清 ,将其感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3 ,测定病毒滴度 ,提取转染细胞DNA进行PCR鉴定 ,间接免疫荧光法检测外源基因在感染病毒的NIH 3T3中的表达。结果　培养上清的病毒滴度为 5 .8× 10 5 PFU ml,聚合酶链反应 (PCR)结果证实 ,转染细胞的DNA中含有目的基因的特异性片段。免疫荧光结果表明EBV LMP2基因在小鼠成纤维细胞中获得表达。结论　重组逆转录病毒成功地将EB病毒LMP2基因整合到细胞中并得以表达