可替宁单克隆抗体的制备及其在免疫学检测中的应用

目的: 研制可替宁单克隆抗体（单抗）,并建立检测人体尿液样本中可替宁的免疫检测方法。方法: 利用人工合成的可替宁-牛血清白蛋白（COT-BSA）免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术筛选一种对可替宁具有高特异性和敏感性的单抗,并将该单抗用于建立间接竞争ELISA（ic-ELISA）和胶体金免疫层析试纸,检测人体尿液中可替宁的含量。结果: 所研制的可替宁单抗经ic-ELISA鉴定,半数有效抑制浓度为21 ng/mL,经胶体金免疫层析试纸鉴定,截断值为100 ng/mL。所建立的ic-ELISA方法检测限为0.1 ng/mL,回收率为99.41%~117.98%,批间和批内变异系数分别小于等于15.31%和15.07%。所建立的胶体金免疫层析试纸稳定性和重复性检测准确率均为100%。结论: 以制备的可替宁单抗为基础开发的ic-ELISA和胶体金免疫层析试纸可快速、可靠地检测人体尿液中可替宁含量,可作为环境烟草烟雾在人体内暴露程度的有效检测方法。     

时间分辨荧光微球免疫层析技术定量检测人血清胃蛋白酶原Ⅰ的实验研究

目的 研制快速定量检测人血清胃蛋白酶原Ⅰ (pepsinogens Ⅰ,PGⅠ)试纸,并评价试纸性能.方法 以包裹有时间分辨荧光的纳米微球作为标记示踪物,运用免疫层析试纸技术,研制PG Ⅰ检测试纸;考察试纸的检测线性、灵敏度、精密度、与对比试剂的符合率.结果 试纸定量检测的线性良好,方程为Y=0.027 9+0.004 8X,r=0.997 8;灵敏度为0.27 μg/L;批内CV小于10％,批间CV11.03％;与市售PG Ⅰ试剂平行检测489份血清样本,有良好的相关性(YTRFIA =0.856 6Xstrip+7.545 6,R2 =0.989 1,P＜0.01).结论 PG Ⅰ时间分辨荧光纳米微球免疫层析试纸操作简单、快速、经济、可定量,满足临床检测血清PG Ⅰ的需求.     

D-二聚体胶体金免疫层析定量检测方法的初步建立

目的建立一种检测D-二聚体的胶体金免疫层析定量检测方法,为临床检测D-二聚体提供一种简便、快速、准确的检测方法。方法根据免疫学中双抗体夹心和免疫层析的原理,研制定量检测样本中D-二聚体的胶体金试纸条,在金标定量仪上建立标准曲线,从灵敏度、特异性、线性、精密性、稳定性和方法学对比等方面对该方法进行评价。结果本试纸条的线性范围为0.156 25~10μg/ml,回归方程Y=92.907 X+307.88,R2=0.982 68;批内变异系数(CV)为3.78%和2.81%,批间变异系数(CV)为4.95%和4.07%;与纤维蛋白原无交叉反应性;在37℃条件下保存1周;与IL公司ACL-TOP700检测系统免疫比浊法的相关性良好,回归方程Y=0.959 64 X+0.026 45,相关系数R2=0.985 93。结论本研究初步建立了检测D-二聚体的胶体金免疫层析定量检测方法,为临床检测D-二聚体提供了一种新的技术和方法。     

全血胶体金免疫层析法检测HBsAg的临床应用评价

目的 :对全血胶体金免疫层析试纸法检测乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)的临床应用进行评价。方法 :用全血胶体金免疫层析试纸法和ELISA法对定值HBsAg血清和 2 0 0份临床标本同时测定并观察全血胶体金免疫层析试纸法检测HBsAg的灵敏度、重复性、测定范围和稳定性。结果 :全血胶体金免疫层析试纸法检测HBsAg的下限为 1ng/ml,但对 <10ng/ml的HBsAg重复性不够 ,检测上限至少达 1万ng/ml。与ELISA比较 ,一般不出现假阳性。对抗原量过大的标本 ,金标法结果准确 ,但对抗原含量低的标本 ,可出现假阴性。结论 :全血胶体金免疫层析试纸法适用于急诊、现场采血前献血员的筛查和婴幼儿 ,但单独用于HBsAg检测 ,可出现低浓度的漏检。     

时间分辨免疫荧光分析检测乙型肝炎病毒表面抗原

目的 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是当前标记免疫分析研究应用领域的热点之一,具有高灵敏性和高特异性,用于生物分子的超微量检测.本研究者在建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法.方法 以Eu-DTTA{N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠}为示踪物,建立了用TRFIA检测乙型肝炎血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原的方法.结果 所建立的标准曲线分析范围分别为0.2～300 ng/ml,分析灵敏度为0.05 ng/ml,检测参考标准品的批内变异系数均小于10%,与免疫放射测定同时定量检测多份血清样本,相关系数高达95%.结论 TRFIA分析范围宽,灵敏度高,操作简便,具有优越的定量检测能力,价格适中,十分适合临床推广应用.     

基于近红外免疫层析技术食源性诺如病毒快速检测方法研究

目的建立一种快速、灵敏检测食源性GⅡ型诺如病毒的近红外免疫层析法。方法采用低噪声激发式荧光染料标记鼠抗诺如病毒单克隆抗体,将诺如病毒多克隆抗体和羊抗鸡Ig Y多克隆抗体喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,制备靶向于诺如病毒衣壳蛋白的免疫层析试纸条,研制检测诺如病毒的近红外免疫层析试纸条。结果采用便携式低噪声激发式荧光扫描仪分别扫描质控线和检测线,以检测线荧光强度检测值实现样本的定性检测,在45 min内即可完成检测。该试纸条与肠道病毒EV71、腺病毒、轮状病毒、甲肝病毒均无交叉反应。结论 GⅡ型诺如病毒的近红外免疫层析法具有良好的特异性和较高的灵敏度。通过效果评价试验发现,与荧光RT-PCR、胶体金法相比较,所建立的近红外荧光法检测时间最短,检测限低于胶体金法。因此,近红外免疫层析法可用于食品中GⅡ型诺如病毒的高效检测,为食品安全监管提供可靠的技术支持。     

寨卡病毒NS1抗原的金标免疫层析检测试纸条研制

目的研制一种快速检测寨卡病毒(ZIKV)NS1抗原的胶体金免疫层析试纸条。方法以胶体金标记的抗寨卡病毒NS1单克隆抗体为特异性识别及信号产生的探针,抗寨卡病毒NS1单抗和羊抗鼠多克隆抗体IgG分别固定于硝酸纤维素膜,作为检测线和质控线以制备金标免疫层析试纸条。通过肉眼对检测线上条带进行判断、读取灰度值比等方式对试纸条结果进行分析。通过检测逐级稀释的寨卡病毒NS1抗原标准品,考察该试纸条的灵敏度。进一步通过检测分别感染了寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、日本脑炎病毒的细胞上清及血清样品,评价该试纸条检测的特异性。考察存储温度及放置时间对试纸条检测寨卡病毒NS1样品的影响,评价该试纸条的稳定性。结果所研制的试纸条在寨卡病毒NS1抗原标准品浓度为100 ng/mL时能够有效检测寨卡病毒培养上清,并与感染了登革病毒、基孔肯雅病毒以及日本脑炎病毒的细胞上清及血清样品均无交叉反应。此外,室温(22～25℃)或4℃储存条件下存放时间为36周的试纸条检测效果未受影响。结论本研究研制的金标免疫层析试纸条特异性好、稳定性高,快速、简便,该方法在即时检测、大样本疾病初筛等应用领域具备一定潜力。     

应用时间分辨荧光免疫分析技术检测SARS病毒抗原的初步研究

目的 建立定量检测SARS冠状病毒N蛋白的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)。方法 采用经SARS-CoVN蛋白和配对实验筛选的两株抗SARSN蛋白单克隆抗体,以双抗体夹心法为基础建立检测SARS-CoVN抗原的时间分辨荧光免疫分析技术,进行方法学的评价,并与相应ELISA试剂盒进行比较。结果 该法的测量范围为(0.02~150)ng/ml,灵敏度为0.02ng/ml;批内、批间CV分别为(3.3~6.2)%和(5.3~9.6)%,与采用ELISA试剂盒检测灭活SARS-CoVN蛋白情况比较的结果一致。结论 本研究建立的检测SARSN蛋白的时间分辨荧光免疫分析技术灵敏度高,特异性好,具有潜在的临床应用价值。     

疟原虫胶体碳试纸条的研制

目的建立一种简单、灵敏的疟疾诊断方法,并能对疟原虫感染进行定量分析。方法运用双抗体夹心免疫层析法,胶体碳标记间日疟原虫乳酸脱氢酶(Pv-LDH)和恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(Pf-HRP2)特异抗体,与疟原虫相应抗原结合,胶体碳抗原抗体复合物被NC膜上包被的疟原虫特异性抗体捕获并显色。曲线拟合疟原虫抗原浓度与对应的检测带灰度值,选取相关系数最高的拟合方程式。检测不同贮存条件的试纸条灵敏度稳定性,确定最佳保存条件。检测疟疾病人及健康人全血,判断试纸条与镜检法相比较的特异性、敏感性、符合率。结果成功制作了间日疟原虫和恶性疟原虫胶体碳标记特异抗体试纸条,灵敏度分别为5、2.5 ng/ml;检测线性范围分别为5~500 ng/ml、2.5~500 ng/ml。检测带灰度值与疟原虫抗原浓度呈正相关,可对疟原虫感染定量分析。4℃保存6个月后,灵敏度基本不变。与镜检法比较,试纸条的敏感性、特异性、符合率在95%以上。结论疟原虫胶体碳试条操作简便、快速,敏感性和特异性高,适合疟疾的快速定量诊断。     

农药醚菊酯抗原合成及抗体制备研究

目的 制备农药醚菊酯类似物和修饰物,与载体蛋白偶联成完全抗原,以之免疫大耳白兔制备抗醚菊酯抗体,为醚菊酯检测试剂的研制做好材料准备.方法 利用3-苯氧基苯甲醇和琥珀酸酐合成带羧基的醚菊酯类似物,用重氮法合成对氮基苯乙酸和醚菊酯的偶氮化合物;活化酯法将合成的半抗原与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,...     

胶体金法测定降钙素原试剂盒的研究

目的利用胶体金技术,开发新的半定量检测人血清降钙素原（PCT）试剂盒,为临床提供一种快速、简便、准确的PCT检测方法。方法依据双抗体夹心法原理,结合金标免疫层析试验,建立降钙素原的半定量检测方法。校准品梯度稀释,检测吸光度,建立标准曲线,并从灵敏度、精密度、特异性和稳定性等方面作出全面的方法学评价。结果本方法的最低检测限为不低于0．1ng／ml,线性良好,线性范围为0．1～30．0ng／ml;批内变异系数（CV）13．2％,批间CV为17．76％;与血清中常见的干扰物质特异性良好,重复性稳定。结论本研究成功建立胶体金技术半定量检测人血清降钙素原（PCT）含量检测方法,具有灵敏、简便、准确等特点,实现了PCT检测的自动化和快速化,所受干扰因素少,能完全满足临床检测需求,具有良好的应用前景。     

检测阴道液HCG及AFP水平诊断胎膜早破的临床价值

目的:探讨阴道液人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平在诊断胎膜早破中的临床价值。方法:①采用北京蓝十字生物技术有限公司生产的胶体金早早孕检测试纸对HCG定性检测。②应用放射免疫法(radioimmu noassay,RIA)对30例胎膜早破和20例胎膜未破的正常孕妇阴道液进行HCG、AFP定量测定。结果:①早孕试纸诊断的敏感性为93.3%,特异性为100%。②胎膜早破组阴道液β-HCG、AFP测量中位数值分别为820.00 mIu/ml和212.90 ng/ml,明显高于对照组的5.55 mIu/ml和0.12 ng/ml(P<0.01);四分位数间距分别为557.40 mIu/ml和199.50ng/ml,明显高于对照组的3.87 mIu/ml和0.30 ng/ml(P<0.01);以β-HCG≥50 mIu/ml或AFP≥30 ng/ml为阳性参考值,阳性检出率均为93.3%;其诊断的敏感性均为93.3%;特异性均为100%。③3种检测胎膜早破的方法无显著性差异。结论:阴道液HCG定性、定量检测和AFP定量检测,尤其是早早孕试纸检测是胎膜早破简易、准确、快速的诊断方法。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

应用时间分辨荧光免疫分析技术检测SARS病毒抗原的初步研究

目的 建立定量检测SARS冠状病毒N蛋白的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)。方法 采用经SARS-CoVN蛋白和配对实验筛选的两株抗SARSN蛋白单克隆抗体．以双抗体夹心法为基础建立检测SARS-CoVN抗原的时间分辨荧光免疫分析技术，进行方法学的评价，并与相应ELISA试剂盒进行比较。结果 该法的测量范围为(0．02～150)ng／ml，灵敏度为0．02ng／ml；批内、批间CV分别为(3．3～6．2)％和(5．3～9．6)％，与采用ELISA试剂盒检测灭活SARS-CoVN蛋白情况比较的结果一致。结论 本研究建立的检测SARSN蛋白的时间分辨荧光免疫分析技术灵敏度高．特异性好．具有潜在的临床应用价值。     

液相芯片技术定量检测人血清PSA反应模式的建立

目的 建立利用液相芯片技术定量检测人血清中前列腺特异性抗原的反应模式,并对该方法进行评价.方法 应用液相芯片技术检测50例前列腺增生患者血清中的前列腺特异性抗原(PSA),评价该方法的线性范围、最低检测限、精密度等指标,并将结果与化学发光免疫分析法(CLLA)进行相关性分析.结果 液相芯片技术检测PSA标准曲线的线性范围为0.022～129.6ng/mL,PSA的最低检测限为0.018ng/mL,检测PSA的批内CV为2.18%～2.28%,批间CV为1.61%～4.18%.用液相芯片技术和化学发光法分别对受检血清标本进行PSA定量分析,结果表明两法差异无显著性(P>0.05),r=0.9984,相关性良好.结论 液相芯片技术具有线性范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有临床应用潜力.     

自制GICA试纸条检测样品中人血红蛋白的初步研究

目的建立一种国产的简易快速,自测式胶体金免疫层析测试条(gold-immunochromatography assay,GICA)用于检测人血红蛋白(人Hb).方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗人血红蛋白抗体(抗人Hb抗体),制成免疫层析法试纸条.样品中人Hb抗原与试纸条上金标抗体结合后沿着硝酸纤维膜移动,与硝酸纤维膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色沉淀线.结果GICA试纸条仅与人Hb发生特异性反应,与牛、马、羊、猪等动物血清无交叉反应.检测人Hb参比品溶液,灵敏度可达30 ng/ml,与进口商品试纸条符合率为90%.结论GICA检测人Hb样品特异性强,灵敏性较高,简便快速,无需特殊仪器设备,具有广泛应用价值.     

应用胶体金层析法快速检测鼠疫耶尔森氏菌F1抗原

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫耶尔森菌的快速诊断。方法采用胶体金免疫层析测试条,加入待测鼠疫耶尔森菌液及对照菌液。结果金标免疫层析试纸条在检测中并未出现交叉反应,特异性达到100%,显示其在鼠疫耶尔森菌的检测中特异性较好,结果可靠。同时该试纸条敏感性亦较高,少量细菌或抗原就可得到阳性结果,检测效果好。结论该方法简便、快速、敏感、特异性好,适合于公共突发卫生事件中的鼠疫快速诊断和现场鼠疫监测。     

结核病的体液免疫诊断研究(Ⅳ.PPA—ELISA检测尿液结核抗体方法的建立)

以PPD为抗原建立了检测尿液结核抗体的过氧化物酶金葡菌A蛋白-酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA),并对最佳检测条件进行了探讨。90份尿液标本的检测结果表明,肾结核患者尿液特异性抗体水平非常明显地高于对照组(P<0.01)。吸收试验和交叉试验证明本法特异性良好,批内和批间变异系数均小于10%,灵敏度达0.01ng/ml。本法简便、灵敏、快速,可作为肾结核的辅助诊断方法。     

气相色谱-质谱联用外标法检测4.5%高效氯氰菊酯中邻、间、对二甲苯的研究

目的建立气相色谱-质谱联用(GC/MC)检测4.5%高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)农药中邻二甲苯(ox)、间二甲苯(mx)、对二甲苯(px)的实验室方法,为含有二甲苯农药中毒的鉴定和诊治提供参考。方法选用外标标准曲线法对二甲苯三种同分异构体进行定量分析。优化的GC-MS色谱条件,达到二甲苯三种同分异构体完全分离,分别配制二甲苯ox、mx和px三种异构体的不同浓度梯度的标准溶液绘制标准曲线。标准样品及特征离子比对进行同分异构体定性,在选择离子模式下选用峰面积进行定量。结果二甲苯三种同分异构体在0.5~300 ng/ml之间线性均良好,线性相关系数(R2)均大于0.999。ox、mx和px的检出限(LOD)分别为0.48、0.46和0.42 ng/ml;定量限(LOQ)分别为1.61、1.54和1.40 ng/ml。方法的平均回收率大于94.2%,精密度相对标准偏差小于6.4%。结论 GC/MC外标标准曲线法用选择离子模式检测4.5%高效氯氰菊酯中二甲苯含量的方法灵敏性好、操作简便,可为农药中毒有机溶剂二甲苯成分法医学鉴定提供参考。     

抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的研制及其检测试剂的初步应用

目的 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在国际上已成为临床诊断急性肾损伤(AKI)的主要生物标志物.该课题主要研制抗人NGAL单抗及探讨其国产化诊断试剂的初步应用.方法 预测NGAL抗原表位并结合NGAL的晶体结构,设计合成抗原表位肽并与血蓝蛋白偶联,免疫小鼠制备抗NGAL单抗;人工合成NGAL基因构建原核表达载体pET-DsbA-NGAL,诱导表达后分离纯化重组NGAL蛋白,研制NGAL标准品;建立双单抗体夹心ELISA法,检测该方法的线性范围、检测限、灵敏度和精密度,同时检测20份健康对照组和20份AKI患者血清和尿液样品.结果 针对NGAL两个表位(21-34aa;58-71aa)分别获得了4株和3株能够稳定分泌抗NGAL单抗的细胞株;ELISA法最低检出限为0.25 ng/ml,标准曲线在2.5～125.0 ng/ml范围内线性良好,批间变异CV值均小于10％;冻干NGAL标准品在4℃稳定达6个月;AKI组血清和尿液中NGAL含量分别为(589.5±75.5)和(89.4±12.4)ng/ml,而健康对照组血清和尿液中NGAL含量分别为(58.8±9.5)和(7.2±1.4)ng/ml;两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 该研究获得了抗人NGAL单抗及其基因工程NGAL标准品并建立了ELISA定量检测试剂,为实现NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化提供了良好的技术基础.