H5N1亚型禽流感病毒NSl蛋白表达影响因素分析

目的 优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol／L,诱导温度为37℃,诱导表达6．0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以o．1mm01／L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0。6mmo1／L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4．0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Westernblotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0。3mmol／L时,融合蛋白GST-NSl在IPTG诱导5．0h时的表达量最高,达28．5％;当IPTG诱导浓度为0。6ram01／L,在37℃诱导表达4。0h时,融合蛋白的表达量可达27．9％。选用优化的表达条件,IPTG0．6mmo1／L,37℃诱导表达4．0h,融合蛋白的表达量最高可达33．2％。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25．1％。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的获取H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白的多克隆抗血清,制备NS1蛋白的多克隆抗体。方法利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白GST-NS1,采用Glutathione-sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白。纯化的GST-NS1蛋白以不同剂量皮下注射免疫BALB/c小鼠,收集抗血清,采用Protein A-sepharose和CNBr-sepharose 4B亲和层析从抗血清中纯化抗NS1蛋白的多克隆抗体。Western blot和免疫荧光法鉴定多克隆抗体的特异性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体的效价。结果 SDS-PAGE结果表明,融合蛋白GST-NS1以可溶形式表达,诱导4 h的表达量占细菌可溶性蛋白的32.6%,融合蛋白的纯度达到90%以上。Western blot分析显示,亲和层析制备的多克隆抗体对NS1蛋白具有高度特异性。ELISA结果表明,皮下注射25、50、100μg GST-NS1融合蛋白的BALB/c小鼠血清光密度D(450)值均明显增高(P<0.01),其滴度达到1∶3 200。免疫荧光观察到病毒感染的A549细胞中,有内源性NS1蛋白的表达。结论成功地从抗血清中制备出NS1蛋白的多克隆抗体,制备的抗体具有高度特异性。     

H5N1人禽流感病毒HA基因的克隆和表达

目的对人禽流感病毒A/China/GD01/06（H5N1）HA基因进行克隆和表达,为进一步研究GD01/06HA的致病与免疫机制提供有效制剂。方法将H5N1全长HA基因克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并对表达的重组蛋白进行鉴定。结果经检验重组质粒p32-HA构建成功,表达蛋白分子量介于66.2~94.0kd。经鉴定所表达的特异性条带为HA蛋白片段。结论HA基因在大肠杆菌中表达并获得特异性重组蛋白,为其生物学、免疫学功能的研究提供了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白?方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T 载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因?双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达?结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功?Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达?结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础?     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究

目的设计并获得一种安全、高效,并能对以H5N1亚型为主的多种禽流感病毒亚型产生保护的复合基因工程疫苗。方法利用分子生物学和分子免疫学方法对国内以及周边国家流行的禽流感毒株进行全面分析,利用生物信息学技术合理设计亚单位加表位的全新复合结构疫苗的氨基酸序列;利用大肠杆菌密码子优化技术根据疫苗氨基酸序列获得基因序列;通过全基因合成的方法获得该疫苗的基因,并通过大肠杆菌表达系统对该疫苗进行表达;目的蛋白经过包涵体洗涤和色谱纯化后复性;通过ELISA评价其抗原特异性,并乳化制备成禽流感蛋白疫苗,通过小鼠体内免疫试验检测其免疫效力。结果设计了包含通用性的辅助性T细胞表位、B细胞表位以及CTL表位的串接疫苗结构;全基因合成获得了该复合疫苗的基因序列;该基因在大肠杆菌表达系统中得到了高效表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白30%;经过粗纯和精纯后的目的蛋白纯度达到95.5%,复性后获得可溶性蛋白溶液,浓度可达2.4 mg/mL。结论通过小鼠实验,验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫。小鼠免疫试验证明,该疫苗可以在小鼠体内有效诱发免疫应答。     

H5N1亚型禽流感病毒对小鼠致病性的研究

目的用一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠,观察其对小鼠的致病性及在小鼠间的传染性。方法将小鼠分为正常组、攻毒组、同居组,攻毒组乙醚麻醉后滴鼻感染AIV,观察各组食欲、反应、呼吸及有无皱毛、弓背、死亡等,测量体温及体重;检测相应抗体水平、小鼠排毒情况及小鼠各器官带毒情况,并观察病理组织学变化。结果攻毒组出现食欲反应下降,呼吸急促,皱毛,死亡;体重、体温下降。同居组未出现感染。攻毒组攻毒后12 h至第9天可从肺组织分离出病毒,第10天始出现相应抗体;感染小鼠的肺、心肌、肝、脾、肾和脑组织都有不同程度的病理改变。结论 AIV对小鼠具有致病性,AIV能跨越种系障碍直接感染哺乳动物, 但在小鼠间无传染性。     

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的：对HSN1亚型禽流感病毒株(A/Qa／ST/852/01)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法：用RT-PCR方法扩增A/Qa／ST／852／01的ns1基因。之后以扩增产物为模板，采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰，将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中，并将其克隆到真核表达载体，构建pcDNA3．1/ns1重组质粒。结果：RT-PCR产物测序显示，A/Qa／ST／852／01 ns1基因开放阅读框全长678bp，编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论：成功将缺失的15个核苷酸片段引入A/Qa／ST／852／01的ns1基因中，重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

H5N1流感病毒NS1蛋白D92E变异趋势的分析

目的分析H5N1流感病毒NS1蛋白D92E的变异趋势,为研究禽流感病毒的致病性及其逃避宿主免疫应答提供科学依据。方法利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的流感数据库,搜索2000年以前以及2000年以后世界各地流行的A/human/H5N1、A/avian/H5N1、A/swine/H5N1流感病毒的相关信息,然后进行NS1蛋白序列比对,分析其变异趋势。结果 2000年以前H5N1流感病毒NS1蛋白第92位大部分是谷氨酸,而2000年以后H5N1流感病毒的NS1蛋白第92位大部分是天冬氨酸。结论 H5N1流感病毒的NS1蛋白第92位天冬氨酸的存在有可能增强了病毒的抵抗力和毒力。     

不同职业暴露人群感染H5N1禽流感病毒风险性分析

目的了解长沙地区不同类型禽类职业暴露人群高致病性禽流感H5N1亚型病毒的抗体分布状况,分析不同职业暴露人群H5N1感染的风险性。方法采集菜市场家禽屠宰零售人员、大型家禽饲养企业工人和农村个体家禽散养人员的血清标本,用单放射免疫扩散溶血技术（SRH）检测H5N1抗体。结果市场零售人员、农村个体家禽散养人员、企业饲养人员H5N1感染率分别为25%、1%和1.92%,男性从业人员H5N1抗体阳性率为10%,女性为23.88%。结论市场零售人员感染H5N1风险性远高于农村散养人员和企业饲养人员,不同职业人员中女性H5N1抗体阳性率高于男性从业人员。     

禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病敏感性研究

目的观察禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病性。方法将NIH小鼠随机分为接毒组(20只)和对照组(10只),在负压感染实验室,接毒组于乙醚麻醉后给予AIVH5N1型病毒滴鼻,对照组予正常阴性尿囊液滴鼻,观察14d,记录小鼠的体温、体重、临床症状、死亡情况、病理变化、肺指数及抗体变化。结果 NIH小鼠感染禽流感H5N1型病毒后第1天就出现精神不振,病程主要集中在第3～7天,临床症状主要表现为弓背、蜷缩、竖毛、颤抖、反应迟钝、活动减少、爱扎堆,体重(下降)出现减轻,体温降低,死亡率为40%;接毒组死亡小鼠肺指数为(2.21±0.40),较对照组的(0.44±0.23)明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);肺组织病理严重改变,第8天才能检出抗体(OD值等于0.231)。结论禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠有一定的致病性。     

东南亚禽流感病毒H5N1亚型神经氨酸酶变异特征及进化分析

目的分析东南亚H5N1禽流感病毒NA蛋白特点,比较各国病毒NA核酸进化特点,为人禽流感防控工作提供参考。方法从GenBank获得东南亚和我国H5N1禽流感病毒NA核酸序列,ClustalX1.83和MEGA4.0对NA核酸和蛋白分析,构建遗传进化树。结果2004年以后东南亚各国H5N1病毒NA茎部均有20个氨基酸残基缺失;越南、泰国和柬埔寨及印尼样本分别在NA多个位点氨基酸残基替换相同,上述国家样本在进化树中各聚一分支内;2005年中国与2006年后老挝样本聚于一分支。结论2004年以后病毒可能能更好的适应人体内环境;越南、泰国、印尼H5N1病毒NA具有地域性;2006年以后老挝毒株可能由2005年中国毒株扩散到老挝。     

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达?方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因?HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过Cellfectin Ⅱ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达?分别用SDS-PAGE?Western blot?血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定?结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000?血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集?质谱分析鉴定该重组蛋白为HA 蛋白?结论:重组HA 蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础?     

人禽流感H5N1毒株PB1基因突变分析

目的 通过对人禽流感H5N1毒株PB1基因序列的变异分析,揭示毒株PB1基因的特征与进化.方法 检测广东地区人禽流感H5N1毒株PB1基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株PB1基因序列,采用DNA Star Lasergene软件对检索的人禽流感H5N1毒株PB1基因核苷酸序列进行比对和分析,并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果 将50株毒株PB1基因核苷酸序列按同源性分成两组:1997-1998年毒株为第1组(G1),2003-2006年毒株为第2组(G2).PB1基因74个氨基酸发生位点置换,占9.78%(74/757).PB1基因Ks值为26.1×10-6～39.8×10-6Nt/d,Ka值为3.91×10-6～5.59×10-6 Nt/d,检验结果显示,基因进化受到负选择性压力.2003-2006年毒株(G2)丢失G757,引起氨基酸结构改变;同时糖基化位点也较1997-1998年毒株减少了1个糖基化位点NES382-384.结论 目前PB1基因进化分成两组,自发突变作用影响PB1基因进化;PB1基因与PB2基因的进化途径在时间特征和区域特征方面类似.2003-2006年毒株PB1基因氨基酸结构和糖基化位点均有改变.     

2010年绵阳市H5N1禽流感职业暴露人群流行病学和血清学调查分析

目的了解绵阳市职业人群H5N1禽流感病毒感染状况,为人禽流感防治提供基础资料和科学依据。方法对全市9个县市区的200人职业人群发放问卷,对工作环境、个人防护措施等进行调查,同时采集其血清查H5N1禽流感病毒抗体。结果我市职业人群在通风好、干净整洁的环境中工作的占50%以上;37%的职业人群不懂得如何处理禽类污物。清理污物后59%的人不懂得保护环境。个人防护方面,能做到每次接触禽类均穿戴防护设施的人群占20%～32%。而近半年来职业人群手足部位皮肤曾明显破损者占31.65%。200人血清中未查见H5N1禽流感病毒抗体。结论我市禽类中暂时不存在H5N1禽流感病毒,相关部门应做好禽流感病毒禽间和人间监测,加强对职业暴露人群的健康教育,使其做好自身防护,减少感染机会。     

成人H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎的CT表现与动态变化

目的 探讨成人高致病性H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎的CT表现及动态变化。方法 2006年6月所确诊的H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎成人男性患者于发病第7天、30天、40天、50天、65天及95天分别行螺旋CT及HRCT扫描。回顾性分析其CT资料并结合文献复习。结果 病情严重时,CT显示肺叶或肺段大片状实变影伴支气管充气征、小淡片影及胸腔积液。病情稳定后,表现为多肺叶斑片状实变影、磨玻璃影,病灶内仍见支气管充气征。同时部分肺叶体积缩小,小叶间隔增厚、胸膜下细弧线影,相邻胸膜增厚。临床治愈出院以及近期复查时,大部分病灶消失,肺间质病灶吸收缓慢,以中叶、下叶为著。两肺散在多处条索状影,肺纹理聚集,胸膜下小叶间隔增厚,间隔旁小气肿,支气管扩张、扭曲。结论 成人高致病性H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎的CT表现为早期肺叶实变影,逐渐发展肺实质与间质病变并存,恢复期则以肺间质病变为主。CT动态观察能较客观的反映本病的病理改变过程。     

金刚烷胺修饰物对禽流感（H5N1）病毒的抑制作用

目的：寻找高效低毒的抗禽流感病毒药物。方法：体外实验选用狗肾细胞（MDCK）,实验分为正常对照组、病毒对照组和受试化合物组,采用细胞病变法结合MTT法检测金刚烷胺修饰物（NAM）对MDCK细胞的半数中毒浓度、对禽流感病毒的半数抑制浓度和治疗指数;体内实验采用NAM对禽流感病毒H₅N₁亚型小鼠感染模型的治疗实验,检测小鼠的死亡率、存活率、死亡保护率和延长生命率。结果：体外实验,NAM对MDCK细胞的最大无毒浓度为235.09 mg•L^-1,半数致死浓度为1582.78 mg•L^-1,NAM对禽流感病毒半数抑制浓度（IC₅₀）为15.32 mg•L^-1,治疗指数（TI,103.31)高于金刚烷胺对照组(TI,48.48);体内实验,NAM 100 mg•kg^-1剂量组对H₅N₁感染小鼠的死亡率（12.5%）明显低于病毒对照组小鼠死亡率(87.5%)（P<0.05）,平均生存日数（13.38 d）明显高于病毒对照组平均生存日数（9.63 d）（P<0.05）,肺炎抑制率（99.15%）和生命延长率（26.79%）均高于金刚烷胺对照组肺炎抑制率（69.18%）和生命延长率（13.39%）(P<0.05)。结论：NAM体外毒性和抗病毒活性均优于阳性对照金刚烷胺;体内抗病毒活性较好,可显著降低禽流感病毒感染小鼠的死亡率、提高平均生存日数和延长生命率。     

Interferon dysregulation and virus-induced cell death in avian influenza H5N1 virus infections

1. Hyper-induction of cytokines and chemokines was found in human blood macrophages infected with the avian influenza H5N1 and H9N2/G1 viruses, as compared to those infected with human influenza H1N1 virus. 2. IRF3 played a significant role in the hyperinduction of cytokines including IFN-β, IFN-λ1,IFN-α subtypes, MCP-1, and TNF-α, and also played a part in subsequent cytokine-induced cell signalling cascades. 3. Compared with H1N1 viruses, avian influenza viruses including H5N1/97 and its precursors triggered a caspase-mediated but delayed apoptotic response in human macrophages. 4. Therapies that can minimise immunopathology-associated dysregulation of innate immunity without impairing effective host defence may be valuable adjuncts to antiviral therapy.