日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的构建日本脑炎病毒核心蛋白（JEV C蛋白）基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应。方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoRI/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PEG/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达。结果重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均〉0.8,在SD/-Trp/X/A培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC。结论成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pGBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础。     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定.方法获得正常人外周血 PBMC,抽提mRNA,通过巢式 RT-PCR 在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至 pMD18-T 载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-Foxp3和酵母表达载体 pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为 pGBKT7-Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌 AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-Foxp3 在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 RT-PCR 扩增出的DNA 片段约1 203 bp,大小正确,与pMD18-T载体连接,测序正确.构建的诱饵载体pGBKT7-Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.pGBKT7-Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/-Trp 板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade /-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7-Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能.结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的"诱饵", 为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件.     

利用酵母双杂交系统筛选Pak4相互作用蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选信号转导分子Pak4相互作用蛋白.方法 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒.质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达.将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187,与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验.交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板上筛选,阳性克隆质粒酶切鉴定.结果 成功构建了pGBKT7-Pak4 KD诱饵质粒,Western blot证实其在酵母菌AH109和Y187中表达,筛选了多个与Pak4相互作用的阳性转化子.结论 利用酵母双杂交系统筛选出Pak4相互作用蛋白质.     

硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ诱饵质粒的构建和检测

目的 构建硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)诱饵质粒,同时检测其在酵母菌内的表达和对酵母细胞的毒性.方法 提取人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的RNA,利用RT-PCR获得其cDNA, PCR方法扩增PrxⅡ基因片段,纯化后以内切酶双酶切PrxⅡ和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7-PrxⅡ, 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用.结果 构建的诱饵载体pGBKT7-PrxⅡ测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.将pGBKT7-PrxⅡ成功转化入酵母感受态AH109,并证明PrxⅡ蛋白对酵母无毒性作用.结论 证实了PrxⅡ蛋白无酵母毒性,诱饵质粒pGBKT7-PrxⅡ可以用于酵母双杂交研究前列腺癌发病机制.     

DNA修复蛋白Ku70酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

目的构建Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,为研究Ku70及其相互作用蛋白在乳腺癌中的作用机制奠定基础。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法从人宫颈癌HeLa细胞株扩增出Ku70cDNA全长片段,用SalI和EcoRI双酶切Ku70cDNA片段后定向克隆到真核细胞表达载体pGBKT7,获得诱饵质粒pGBKT7-Ku70,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后转化到酵母菌株AHl09,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-KuT0的自激活作用,同时利用蛋白质免疫印迹检测诱饵蛋白Ku70的表达。结果Ku70cDNA正确克隆到载体pGBKT,转化到酵母菌株AHl09中的诱饵载体pGBKT7-KuT0经表型筛选证实无自激活作用,蛋白质免疫印迹检测显示pGBKT7-KuT0在酵母细胞中稳定表达诱饵蛋白Ku70。结论成功构建了Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,并且在酵母菌株AHl09中稳定表达。     

人卵巢cDNA文库中与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7 Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/X α Gal（SDO/X）和SD/Trp/X α Gal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7 Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

应用酵母双杂交方法筛选LRP16相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7中可与LRP16相互作用的蛋白。方法:将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7双链cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化AH109酵母菌,营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选阳性菌落。提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用。结果:获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白,为研究LRP16的病理生理功能和分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交系统中LRP16诱饵质粒的构建

目的:在酵母细胞中构建LRP16诱饵质粒,以期从人cDNA文库中钓取可与LRP16相互作用的蛋白。方法:pLPC-LRP16质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收,获得LRP16的基因片段,将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切验证其正确插入方向后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109和Y187,并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性。随后提取转化后的酵母总蛋白,经Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果:重组诱饵质粒经酶切验证,片段大小和插入方向均正确,将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性,Western blot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRP16蛋白。结论:构建的重组质粒pGBKT7-LRP16能够在酵母细胞中正确表达,可作为酵母双杂交系统的诱饵质粒。