hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

端粒酶RNA的反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究

目的研究端粒酶RNA的反义寡核苷酸(As-ODN)抗白血病作用及其机制。方法采用脂质体包裹As-ODN转染入HL-60细胞;用端粒重复序列扩增法(TRAP)-酶联免疫吸附试验(ELISA）检测HL-60细胞的端粒酶活性变化;用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测凋亡细胞。结果0.1～2.0?μmol/LAs-ODN转染入HL-60细胞,培养1～6?d,HL-60细胞端粒酶活性（A值）由1.043±0.045降至0.063±0.011,且有剂量依赖性和时间依赖性。As-ODN转染的HL-60细胞培养后细胞增殖速度减慢,发生了细胞凋亡。而错义寡核苷酸(Ms-ODN)则无此效应。结论As-ODN能特异性抑制HL-60细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡。     

c—myc反义寡脱氧核苷酸诱导人髓质白血症细胞系HL—60细胞凋亡

为研究c-myc硫代反义寡脱氧核苷酸对白血病细胞系HL-60诱导细胞凋亡的作用,将人工合成的长度分别为18mer和15mer的硫代反义寡脱氧核苷酸（AspoI和AspoⅡ)转染HL-60细胞,用流式细胞术检测c-Myc蛋白及DNA倍体分析,RT-PCR检测c-myc mRNA水平,电镜观察凋亡细胞的超微结构,琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA降解片段。研究结果发现,经AspoI5μmol/L和10μmol/L作用后c-Myc蛋白分别降低23.8%和45.4%。经AspoⅡ10μmol/L作用后下降38.4%,RT-PCR显示AspoI和AspoⅡ组c-myc mRNA表达明显减少。DNA倍体分析AspoI10μmol/L作用48和72小时细胞凋亡率分别为23.97%和52.6%;AspoⅡ10μmol/L作用48和72小时后细胞凋亡率分别为28.8%和45.19%;而空白对照和正义寡脱氧核苷酸组均未出现凋亡细胞。电镜观察两个反义寡脱氧核苷酸μmol/L作用后均出现细胞固缩,染色质边集,胞浆浓缩等凋亡细胞的改变。反义寡脱氧核苷酸10μmol/L作用48小时后均出现典型的DNA降解片段。本研究结果说明,c-myc反义寡脱氧核苷酸是高特异性的基因药物,对HL-60细胞抑制c-myc mRNA的表达,减少c-Myc蛋白合成,并诱导HL-60细胞凋亡。     

hTERT反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖及端粒酶活性的抑制作用,探讨其在瘢痕疙瘩治疗中的作用。方法应用ASODN封闭瘢痕疙瘩成纤维细胞hTERT基因的表达,不同浓度不同时间以ASODN作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,细胞计数和MTT法检测成纤维细胞生长增殖情况,端粒酶PCR-ELISA法检测不同处理浓度和时间成纤维细胞端粒酶活性。结果 ASODN作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞72h后,成纤维细胞生长受抑,增殖能力减弱,并具有浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示:ASODN0.5、1.0和1.5μmol/L作用组OD450-690值分别为0.612±0.038、0.535±0.027、0.423±0.023,与空白对照组(0.898±0.058)比较,差异有统计学意义(P<0.05);正义寡核苷酸1.0μmol/L作用组(OD450-690值为0.893±0.042)与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hTERT基因ASODN能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖,降低成纤维细胞端粒酶活性是其重要作用机制之一。通过抑制端粒酶活性进行抗瘢痕疙瘩治疗可能是一个新途径。     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导HL—60细胞凋亡的影响

采用端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR ELISA)的方法,检测人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变,并进一步通过姬姆萨染色及流式细胞术方法,分析HL-60细胞的端粒酶活性受到抑制后顺铂对HL60细胞凋亡的影响.结果显示hTERT基因ASODN作用于HL60细胞后,端粒酶活性表现逐渐下降;hTERT ASODN与顺铂联合可诱导HL-60细胞出现一系列特征性的凋亡细胞的形态学变化;hTERT基因ASODN作用于HL-60细胞24小时再加入顺铂,用流式细胞术测定凋亡细胞的百分率明显高于正义寡核苷酸(S)DN)联合顺铂作用组和单用顺铂作用组(P＜0.01).然而,hTERT基因的ASODN下调HL-60细胞的端粒酶活性以后,再用DNR和Ara-c处理不能加速HL-60细胞的凋亡.以上的结果表明了端粒酶活性的下调可选择性促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡.     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导K562细胞凋亡的影响

目的 利用人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）抑制K562细胞端粒酶活性后,探讨顺铂对K562细胞凋亡的影响。方法 采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附法（PCR－ELISA）检测端粒酶活性的变化;以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂;用流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果 hTERT基因ASODN作用于K562细胞后,hTERT蛋白的表达水平及端粒酶活性下降;ASODN作用于K562细胞24h再加入顺铂作用72h,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带,而正义寡核苷酸（SODN）与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到明显的DNA梯形条带。hTERT基因ASODN作用于K562细胞24h,再加入5μmol/L顺铂作用48,72h的凋亡细胞百分率（17．43％和20．34％）分别与SODN联合顺铂作用组（7．43％和9．23％）、单用顺铂作用组（5．49％和7．34％）进行比较,差异有显著性（P＜0．01）。结论 以hTERT基因mRNA起始密码区为靶点的ASODN能特异性地抑制K562细胞的端粒酶活性;端粒酶活性的下调可促进顺铂诱导K562细胞凋亡。     

X连锁凋亡抑制蛋白在HL-60细胞耐药中的作用

目的 探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在纤维连接蛋白（Fn）黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用。方法 用Fn包被培养板，以牛血清白蛋白（BSA）包被培养板作为对照。通过CCK-8实验检测Fn黏附对柔红霉素（DNR）敏感性的影响，流式细胞仪检测HL-60细胞内DNR浓度的变化，RT-PCR、Western blot检测XIAP、bcl-2、MRP和mdr1基因mRNA和蛋白表达变化。将XIAP反义寡核苷酸通过脂质体法转染Fn黏附培养的HL-60细胞，计算DNR对HL-60细胞的IC50值。结果 HL-60细胞与Fn黏附后，对DNR的敏感性下降，Fn组IC50值为0．526μmol／L，明显高于BSA组（0．132μmol／L）和悬浮培养组（0．123μmol／L）（P〈0．05）；Fn组XIAPmRNA和XIAP蛋白表达水平均较BSA组和悬浮培养组明显上调（P〈0．05）；Fn组细胞内的DNR浓度与BSA组和悬浮培养组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。XIAP反义寡核苷酸可使Fn黏附介导的耐药HL-60细胞XIAP表达明显下调，对DNR的敏感性增加。结论 XIAP可能参与了Fn黏附介导的HL-60细胞耐药，应用XIAP反义寡核苷酸能够逆转Fn黏附介导的HL-60细胞耐药。     

反义寡核苷酸靶向hTERT对K562细胞株端粒酶活性和细胞凋亡的影响

本研究探讨靶向封闭端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的反义硫代寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,ASPSODN)对K562细胞目的基因抑制作用及对端粒酶活性和细胞凋亡的影响.选用3种浓度ASPSODN,分别为0.2 μmol/L、0.6 μmol/L、1.0 μmol/L,同时设空白组、脂质体组和三种相同浓度正义硫代寡核苷酸(SPSODN)作为对照,转染到人红白血病细胞株K562,于24、48小时收集细胞进行检测.用RT-PCR检测靶基因hTERT mRNA的表达,TRAP-ELISA检测细胞端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果表明①K562细胞被转染24小时后,hTERT mRNA的表达在脂质体组为0.80±0.24,在0.2 μmol/L ASPSODN组为0.69±0.12,在SPSODN组为0.72±0.25,它们与空白对照组(0.85±0.28)无统计学差异(p＞0.05),而0.6μmol/L ASPSODN组的hTERT mRNA的表达(0.42±0.16)比脂质体组明显下调(p＜0.05),而相同浓度的sPSODN组则下调不明显(0.69±0.26),1.0 μmol/L ASPSODN和SPSODN对hTERT表达都表现出一定的抑制.采用台盼蓝拒染法染色显示,经脂质体转染的1.0 μmol/L ODN无论正义或反义时,细胞死亡明显增多.②24小时端粒酶相对活性空白对照组为88.9%,脂质体作用组为77.7%,两者无显著性差异;0.2、0.6、1.0 μmol/LASPSODN作用后端粒酶相对活性分别为60.6%、52%、58%,与空白对照组相比均有显著性差异(p＜0.05),其中0.6 μmol/L ASPSODN组间与脂质体组有显著性差异(p=0.037);而0.2、0.6、1.0 μmol/L作用后SPSODN组端粒酶相对活性分别为76.1%、72.2%、65.7%,0.2和0.6 μmol/L SPSODN组与空白组、脂质体组间均无统计学差异.48小时ASPSODN各作用组则端粒酶活性有所恢复,0.2、0.6、1.0 μmol/L ASPSODN作用后端粒酶相对活性分另1为84.1%、82.3%、79.6%;而48小时0.2、0.6、1.0 μmol/L各SPSODN组端粒酶相对活性分别为74.8%、74.5%、67.9%,0.2和0.6 μmol/L SPSODN组间端粒酶活性无明显抑制.③培养48小时后0.6 μmol/LASPSODN组和SPSODN组细胞凋亡率分别为4.34%和1.83%,脂质体作用组为1.84%,空白对照组为1.07%,ASPSODN和SPSODN组两者问有统计学差异(p＜0.05),ASPSODN组与脂质体作用组及空白对照组间有显著性差异(p＜0.01).结论ASPSODN靶向hTERT能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调K562细胞株端粒酶活性,最佳作用浓度为0.6 μmol/L,但抑制时间较短,24小时明显抑制,48小时则有所恢复.高浓度(1.0 μmol/L)寡核苷酸表现出一定的细胞毒性;48小时0.6μmol/L ASPSODN能明显诱导细胞凋亡,而SPSODN组则无此作用,两者间有显著性差异(p＜0.05).     

大黄素抑制HL-60/ADR耐药细胞增殖和诱导凋亡的作用

本研究探讨中药大黄素(emodin)对人白血病耐药细胞株HL-60/ADR的增殖、凋亡影响及其相应的可能作用机制。采用MTT法绘制细胞生长曲线;集落培养法观察大黄素对HL-60/ADR克隆形成的影响;细胞周期分析、线粒体跨膜电位检测、Caspase-3酶活性检测、Annexin V FITC/PI法、TdT酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)分析凋亡细胞;RT-PCR及Western blot法检测大黄素作用后不同时间段bcl-2、c-myc mRNA及Bcl-2、c-Myc、Caspase-3前体蛋白表达水平的变化。结果表明,大黄素对HL-60/ADR细胞增殖具有明显的抑制作用,呈时间和浓度依赖性。较低浓度大黄素即可抑制HL-60/ADR细胞集落形成,IC50值为5.79μmol/L。细胞周期分析显示,与对照组比较,40、80μmol/L浓度组细胞被阻滞于G0/G1期比率明显增高(p<0.01),G2/M期细胞比率降低(p<0.01),而20μmol/L浓度组细胞周期改变差异不具有显著性(p>0.05),各浓度组均检测到典型的亚二倍体峰(凋亡峰)。大黄素作用12小时HL-60/ADR细胞线粒体跨膜电位降低,Annexin V FITC/PI法检测到早期凋亡细胞,作用24小时caspase-3酶活性显著升高,作用48小时TUNEL法检测到晚期凋亡细胞,细胞凋亡率呈药物浓度依赖性。大黄素作用HL-60/ADR细胞不同时间段,bcl-2、c-myc mRNA和Bcl-2、c-Myc、Caspase-3前体蛋白表达水平均有不同程度下调,并呈时间依赖性。结论:大黄素能够有效抑制HL-60/ADR细胞增殖,并诱导其凋亡,bcl-2、c-myc表达水平下调,线粒体跨膜电位水平降低和caspase-3激活可能参与了该过程。     

bcl-2基因反义寡核苷酸的设计与白血病细胞对Ara-C敏感性研究

寻找在bcl-2mRNA上除了起始区以外的反义寡核苷酸作用的敏感位点和观察这些核苷酸对白血病细胞的阿糖胞苷敏感性的影响。用RNAstructure软件模拟bcl-2mRNA的二级结构设计合成两端硫代修饰反义寡核苷酸，用MTT法测定抑制HL-60和K562细胞的阿糖胞苷半数抑制浓度（IC50）值；用流式细胞术检测HL-60和K562细胞凋亡率和bcl-2蛋白表达水平。结果发现，10μmol/Lbcl-2基因的反义寡核苷酸同Ara-C结合使用，能明显地抑制HL-60和K562细胞bcl-2基因蛋白的表达，促进细胞凋亡，减低Ara-C的IC50值；同时发现针对蛋白编码区的反义寡核苷酸有更强的作用。结论：除了bcl-2mRNA的起始区外，在bcl-2mRNA的其他部位存在有设计反义寡核苷酸更有效的位点，该项研究将为反义药物的设计提供新的有用途径。     

Rac1在HL-60细胞中的表达及其对细胞周期和凋亡的影响

本研究旨在观察Rac1在急性白血病细胞系HL-60中mRNA的表达水平及其对细胞周期和凋亡的影响。采用半定量RT-PCR方法检测HL-60细胞及正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中Rac1mRNA表达水平;用脂质体FuGENE6法将Rac1特异性反义寡核苷酸(ASODN)转入HL-60细胞,应用MTT试验检测细胞存活率;采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化、Wright-Giemsa、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)及AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测凋亡细胞。结果表明:Rac1在HL-60细胞系中相对含量(Rac1/GAPDH)为0.84±0.13,在正常PBMNC中相对含量为0.26±0.1(P<0.01),Rac1在HL-60细胞中的表达明显高于PBMNC。与正义链(SODN)组相比,经2.0g/L Rac1特异性ASODN作用48小时后,HL-60细胞存活率降低[(73.7±5.0)%vs(93.2±3.0)%,P<0.01],G1期细胞百分数升高[(52.1±6.8)%vs(31.6±4.7)%,(P<0.05)],AnnexinⅤ阳性率升高[(19.2±2.1)%vs(4.1±1.7)%,(P<0.01)],凋亡小体明显增加。结论:白血病细胞系HL-60中高表达的Rac1可能促进白血病细胞HL-60的过度增殖并抑制其凋亡。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用

目的研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对 HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用。方法用流式细胞术检测 hTERT ASODN 转染 HL-60细胞72 h 后细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞 DNA 梯带;将转染及未转染寡核苷酸的 HL-60细胞分别接种BALB/c 裸鼠,观察成瘤情况,切片观察移植瘤组织形态;另取10只 BALB/c 裸鼠,改进成瘤方法使其均匀成瘤后分成两组,在瘤体局部分别注射 ASODN、磷酸盐缓冲液(PBS),经7d 治疗后测量瘤体并切片观察其细胞形态变化,采用 TUNEL 方法检测细胞凋亡。结果 hTERT ASODN 作用于 HL-60细胞72 h 后,流式细胞术检测出早期凋亡峰,琼脂糖凝胶电泳显示 DNA 梯形条带,SODN 组及空白对照组未检测出凋亡峰及 DNA 梯形条带 ASODN 转染的 HL-60细胞组 BALB/c 裸鼠接种后第16～17天成瘤,5只中2只成瘤,未转染组在第12～13天成瘤,5只中4只成瘤,成瘤后 ASODN 治疗组瘤组织间质及血管较少,PBS 治疗对照组瘤组织间质发达,血管丰富。成瘤后 ASODN 治疗前肿瘤体积为(100.9±24.6)mm~3,治疗后肿瘤与 PBS 对照组比较,生长明显减缓[瘤体积分别为(422.7±326.4)mm~3和(786.4±357.6)mm~3](P<0.05) 组织切片显示,ASODN 治疗组瘤组织中可见大量细胞呈现凋亡形态,PBS 治疗组则少见凋亡细胞 TUNEL 检测显示,ASODN 治疗组瘤组织中阳性细胞数较 PBS 治疗组明显增多(P<0.05)。结论 hTERT 基因 ASODN 能够诱导 HL-60细胞凋亡并降低其在 BALB/c 裸鼠体内的致瘤性,抑制移植瘤增长速度。     

c-myc在大黄素抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡中的作用

目的研究中药大黄素(emodin)对人髓系白血病细胞株HL-60细胞的影响及探讨c—myc基因在其中的作用。方法应用MTT法绘制细胞生长曲线；细胞集落培养观察大黄素对HL-60细胞增殖的影响；DNA倍体分析、线粒体细胞凋亡检测法、末端缺失原位标记(TUNEL)法及DNA凝胶电泳分析细胞凋亡；RT—PCR及Western blot检测大黄素作用前后c—myc基因mRNA及蛋白表达水平的变化。结果大黄素能明显抑制HL-60细胞增殖，半数抑制浓度(IC50)约为20μmol／L；DNA片段化、亚G1峰(凋亡峰)的检出及线粒体细胞凋亡检测等证实大黄素能有效诱导HL-60细胞凋亡，细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关。大黄素与HL-60细胞作用后c—myc基因mRNA及蛋白的表达水平与作用时间呈负相关。结论大黄素能有效抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡；c—myc基因可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的过程。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸对白血病细胞端粒酶活性的影响

为了探讨人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）对原代培养的急性髓性白血病（AML）和慢性髓性白血病（CML）细胞端粒酶活性的影响。采用间接免疫荧光标记方法，通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT蛋白表达含量的变化。采用端粒酶聚合酶链反应-酶子弟免疫测定（PCR-ELISA0法检测白血病细胞端粒酶活性的改变。结果显示：hTERT ASODN作用于AML和CML细胞24，48和72小时后，hTERT蛋白表达水平不断降低；同时，AML和CML细胞端粒酶活性均逐渐受到抑制。结论：hTERT基因ASODN可以通过特异性地抑制AML和CML细胞hTERT蛋白的表达，抑制AML和CML细胞端粒酶的活性。     

骨髓瘤细胞分化过程中转录因子Blimp-1对c-myc基因表达的调控

目的探讨2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）诱导骨髓瘤细胞分化过程中转录因子Blimp—1对c—myc基因表达的调控作用。方法用0．5μmol／L 2ME2处理骨髓瘤细胞系CZ-1和LP-1细胞72h，以诱导转录因子Blimp—1表达上调，用RT—PCR和Westernblot检测c—myc基因mRNA及蛋白的表达情况；另用0．5μmol／L2ME2＋Blimp—1反义寡核苷酸（ASODN）处理CZ—1和LP-1细胞72h，采用细胞形态学、流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD49e的表达，ELISA法检测细胞分泌免疫球蛋白的水平，观察Blimp-1 ASODN对细胞分化作用的影响，同时采用RT—PCR和Western blot检测c—myc基因mRNA及蛋白的表达情况。结果当两种骨髓瘤细胞系采用2ME2处理72h后Blimp—1的表达均上调，c—myc基因mRNA及其蛋白的表达下调；而当Blimp—1表达受到ASODN封闭未出现上调时，细胞分化过程受到抑制，骨髓瘤细胞未出现成熟浆细胞的形态，细胞表面分化抗原CD49e的表达以及细胞分泌的免疫球蛋白水平与对照组相比，差异无统计学意义，此时c—myc基因mRNA及其蛋白的表达水平也未出现下调。结论2ME2诱导骨髓瘤细胞分化的信号转导通路中，转录因子Blimp—1抑制c—myc基因mRNA及其蛋白的表达。