不同周龄大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的对比研究

目的：寻求大鼠周龄对骨髓间充质干细胞体外培养的影响,并进行细胞形态学观察和表面分子鉴定.方法：分别对1,4,8周龄SD大鼠采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果：全骨髓贴壁法能有效的获得大鼠骨髓间充质干细胞,以梭形细胞为主,细胞集落呈鱼群状或放射状排列.传代至第3代以后能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,表面分子鉴定CD44、CD90呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达.原代及传代细胞的融合时间相比较,小周龄BMSCs较大周龄BMSCs明显缩短.细胞培养达80％融合时间：原代细胞依次为（5±0.7）,（7.8±0.8）,（10.2±1.1）d,第3代细胞依次为（3.8±0.4）,（5.2±0.5）,（6±0.7）d,结果均有明显差异（P＜0.05）.结论：1,4,8周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞经多代传代培养后,1周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞较4周龄和8周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞能维持更好的细胞状态和细胞活性.应用1周龄SD大鼠进行全骨髓贴壁法分离体外培养骨髓间充质干细胞,能更经济、更快捷、更高效地为组织工程研究提供数量充足、状态良好的种子细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的建立兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分离、培养和鉴定的方法.方法采用贴壁法培养扩增兔BMSCs,通过形态学观察及流式细胞仪鉴定证实得到的细胞为BMSCs.结果倒置相差显微镜可观察到大量梭形、漩涡状贴壁细胞,流式细胞仪鉴定可见所培养的间充质干细胞高表达其表面标记物CD44,低表达CD14和CD45造血细胞表面标志物,初步证实所培养的细胞为兔BMSCs.结论骨髓贴壁分离法培养间充质干细胞是一种方便快捷、经济有效的培养方式.此种细胞培养方法能够得到较纯化的BMSCs.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的 建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，为组织工程支架研究提供细胞基础。方法 分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法，对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中，将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性，流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化，并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能，通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果 改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一，细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论 改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜...     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的:培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打基础.方法:分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定.结果:两种方法培养的细胞均为成纤维样细胞,呈集落式生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%),CD11b-(87.6%),梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%),CD11b-(96%).结论:两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,但全骨髓贴壁培养法简单易行,原代培养周期较短.     

SD大鼠骨髓基质干细胞的全骨髓培养与鉴定

目的：采用体外全骨髓培养法培养SD大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）并进行鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、CD34、CD45的表达。结果：全骨髓培养法能迅速、有效地培养和获得大量骨髓基质干细胞,流式细胞仪检测显示CD29阳性率为99.0%,CD34阳性率1.5%,CD45阳性率0.8%。结论 ：全骨髓贴壁培养法是获得骨髓基质干细简捷、高效、经济的途径,可以获得较纯的BMSCs。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期.细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/C1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性.结论 体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济.     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离扩增及鉴定

目的:探讨一种简单易行的的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增小鼠BMSCs。观察原代及传代小鼠BMSCs形态变化,对第3代小鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106进行流式细胞仪检测。结果:小鼠BMSCs的原代接种培养24h后可见大量悬浮细胞,少许贴壁细胞,呈小圆形;72h后贴壁细胞逐渐增多,培养至第7天细胞伸展成长梭形,呈集落生长。BMSCs在培养的2～6d细胞增殖较慢,7～10d细胞增殖较快。传代后的小鼠BMSCs 24h基本全部贴壁,呈均匀性梭行细胞样生长。流式细胞仪检测结果显示:CD105、CD106表达阳性,表达率分别为92.2%、90.4%;CD34、CD45表达阴性,表达率分别为8.8%、13.1%。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养小鼠BMSCs的理想方案。流式细胞术可以鉴定体外分离培养的小鼠BMSCs。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外CFSE染色标记的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）体外分离、培养、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光标记的实验方法。方法差速贴壁离心法分离纯化大鼠BMSCs,并进行表面标志物流式检测鉴定和成脂、成骨分化鉴定。 CFSE标记BMSCs ,荧光显微镜下观察BMSCs 形态和标记率,台盼蓝染色检测CFSE对BM-SCs存活率的影响,以筛选CFSE标记BMSCs的最佳条件。结果第5代BMSCs的特异性表面标志物： CD29阳性,阳性率为90．10％;CD90阳性,阳性率为96．61％;CD45阴性,仅0．40％表达。且BMSCs具有成脂和成骨分化能力。10μmol/L CFSE作用15 min时,BMSCs的CFSE标记率几乎达到100％,且对BMSCs 的活性没有影响（P＞0．05）。结论利用差速贴壁法可获得纯度高、未分化性能强的BMSCs,BMSCs标记CFSE的最佳条件为10μmol/L CFSE作用15 min。     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的采用全骨髓贴壁培养法分离和体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过形态学观察和排除鉴定法进行初步鉴定。方法无菌分离小鼠胫骨和股骨,剪开骨干骺端,用RPMI1640培养基反复液冲洗骨髓腔,收集并过滤离心。DMEM—LG培养基重悬细胞,将细胞悬液转入0．1％明胶包被的培养瓶中,37℃,5％CO2常规进行原代培养并传代。在培养过程中,取不同代数的细胞做CD45流式标记鉴定。结果采用全骨髓贴壁培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第4-5代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,并不表达白细胞标志抗原CD45。结论本实验可稳定获得均质性良好的小鼠骨髓问充质干细胞,并初步通过鉴定。     

三羟异黄酮对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用

目的　探讨三羟异黄酮(genistein,GEN)对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)的保 护作用。方法　成年雄性小鼠辐射前24h给予GEN,6.0Gyγ射线辐射后观察BMSCs的形态变化、成纤维细胞集落 (CFU -F)形成数量、BMSCs层对正常小鼠骨髓细胞(BMCs)的粘附能力以及血管细胞粘附分子(VCAM- 1)、纤维连接素(Fn) 和层粘素(Ln)等细胞粘附分子的变化。结果　GEN处理组辐射后BMSCs虽然形态上与单纯辐射损伤组在光镜下无差异, 但其CFU -F形成数量、对正常BMCs的粘附能力以及VCAM -1、Fn和Ln等细胞粘附分子的表达均较单纯辐射损伤组高而且 恢复较快。结论　GEN可减小辐射对小鼠BMSCs的损伤,促进受损BMSCs增殖、粘附功能恢复,改善骨髓造血微环境,有 利于辐射损伤小鼠造血重建,具有辐射防护作用。