结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值.方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体.结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD.经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上.Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应.ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清.结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌.纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值.     

结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值

目的：获得重组抗原85A(rAg85A)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白，通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物（PPD）或纯化的rAg85A蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）及结核病一步检测血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的2％左右，Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右，每100ml培养菌可获得2mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 2s为正常界限值，一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％；PPD分别为93.9％和62.5％；rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论：pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵 体形式表达rAg85A蛋白，该蛋白具有较高的抗原特异性，但检测抗结核抗体的灵敏度低。     

结核分支杆菌ESAT6蛋白的表达、纯化及抗原性研究

目的：获得重组ESAT6蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：分别用生理盐水和卡介苗免疫小鼠8周后,以结核分支杆菌接种小鼠。应用基因工程技术表达、纯化ESAT6蛋白,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rESAT6蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测小鼠或人血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-ESAT6在大肠杆菌BL2（DE3）细胞内以包涵体形式存在,分子量约6kDa,每100ml培养菌可获得约18mg纯化的重组蛋白。生理盐水和卡介苗免疫小鼠血后血清中抗ESAT6抗体无区别。结论分支杆菌攻击后,两组小鼠血清中抗ESAT6抗体均明显升高,但只有卡介苗组小鼠抗体水平超过平均值＋2标准误。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,33例正常人和32例结核病人血清一步法和PDD、rESAT6 ELISA检测抗结核抗体的特异性和敏感性分别为：一步法87.9%(29/33),65.6%(21/32),PPD93.9%(31/33),62.5%(20/32);rESAT6 97%(32/33),18.2%(4/32)。结论：pET24b-ESAT6大肠杆菌工程菌能以包涵形式高效表达重组ESAT6蛋白,卡介苗免疫对血清中ESAT6抗体无影响,结核病人血清中抗ESAT6抗体阳性率低,rESAT6纯化蛋白可作为结核病血清学诊断的混合抗原之一。     

结核分支杆菌重组蛋白rCFP-10的表达、纯化及免疫反应性分析

目的表达、纯化结核分支杆菌H37Rv株重组蛋白rCFP—10,评价其免疫反应性,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b—CFP-10转化E．coli表达菌株BL21（DE3）pLysE,IPTG诱导重组蛋白rCFP-10表达。经SDS—PAGE电泳和Westernblotting鉴定后,优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱HisTrap^TMHP纯化重组蛋白,最后用斑点金免疫渗滤法初步评价纯化蛋白的免疫反应性。结果成功构建了重组质粒pET23b—CFP-10并且重组蛋白rCFP-10以可溶性形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的10％。经亲和层析后得到高纯度有免疫反应性的重组蛋白（纯度约为98．5％）。结论高纯度有免疫反应性的重组蛋白rGFP-10为新型亚单位疫苗的研发及其结核病血清学诊断价值研究奠定了基础。     

结核杆菌H37Rv株重组蛋白rESAT-6的表达纯化

目的表达纯化结核杆菌H37Rv株重组蛋白rESAT-6，为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b-ESAT-6转化Ecoli表达菌株BL21（DE3）pLysE，IPTG诱导重组蛋白rESAT-6表达。经SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定后，优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱纯化重组蛋白。结果成功构建了重组质粒pET23b-ESAT-6并且重组蛋白rESAT-6以可溶性形式高效表达，表达量约占菌体总蛋白的14％。经亲和层析后得到高纯度有免疫反应性的重组蛋白（纯度〉95％）。结论高纯度有免疫反应性的重组蛋白rESAT-6为新型亚单位疫苗的研发及结核病血清学诊断价值的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68的表达、纯化与多克隆抗体的制备

目的构建重组质粒pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下一步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-ppe68基因转入质粒pET32a,将经PCR、酶切、序列测定鉴定为阳性的质粒转入大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析法纯化重组蛋白后用凝血酶切除载体蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化。结果成功构建重组质粒表达体系pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,制得去除载体蛋白的高纯度重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68,并成功得到高纯度抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的抗体。结论成功表达结核重组蛋白并制得高纯度多克隆抗体。     

重组结核分枝杆菌38KDa蛋白抗原制备及其血清学诊断价值

目的通过基因工程技术获取纯化的结核分枝杆菌重组38KDa蛋白并评价其血清学诊断价值。方法在大肠杆菌中表达38KDa蛋白，通过亲和层析纯化并复性后用于ELISA检测结核患者血清中特异性抗结核抗体。结果38KDa蛋白表达量占总蛋白的22．80％，以包涵体的形式存在。纯化复性后的蛋白抗原检测54例肺结核患者敏感性为62．96％，其中检测痰涂阳性和痰涂阴性患者的敏感性分别为64.29％和62．50％，二者无显著性差异（X^2=0.02，P〉0．05），检测38KDa抗体特异性为84．38％。另外，通过与结核蛋白芯片检测，结果比较发现研制的重组38KDa蛋白免疫活性与国外进口的蛋白免疫活性相当。结论制备的重组38KDa蛋白抗原具有血清学诊断价值，可用于结核病诊断试剂的开发。     

结核杆菌分泌蛋白katG基因的克隆、表达及其诊断价值

目的　获得重组katG(简称rkatG)蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法　应用基因工程技术表达、纯化katG蛋白 ,通过Westernblotting分析其抗原性 ,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rkatG蛋白为抗原 ,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果　重组质粒pET2 4b -katG在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞内以包涵体形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 2 %～ 56 3 %左右 ,分子质量约为80 0 0 0 ,Westernblotting分析与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rkatG样品经SDS -PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 92 75 %,每 1 0 0ml培养菌可获得 2 8mg左右的重组蛋白。以 33例正常人血清的OD值 2s为正常界限值 ,一步法的特异性和敏感性分别为 87 9%(2 9/ 33) ,65 6 %(2 1 / 32 ) ;PPD分别为93 9%(31 / 33) ,62 5 %(2 0 / 32 ) ;rkatG分别为 97 0 %(32 / 33) ,1 5 2 %(5/ 33)。结论　pET2 4b -katG大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rkatG蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性 ,但检测抗结核抗体的灵敏度低。     

结核分枝杆菌蛋白Rv0315的克隆表达及其抗原性研究

目的评价结核分枝杆菌重组蛋白Rv0315在结核病血清学诊断中的价值。方法采用常规分子克隆方法获得重组Rv0315蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测84份确诊结核病人血清和48份健康人血清中相应的抗结核抗体水平,并与结核分泌蛋白ESAT-6的检测结果进行比较。结果成功构建了重组蛋白Rv0315,其在E.coli BL21plysS（DE3）中主要以可溶性形式表达,分子量（30.3kDa）与预期相符,ELISA血清学活性评估显示其特异性和敏感性分别为94.0%（45/48）和35.7%（30/84）。结论重组蛋白Rv0315有望成为新的结核病血清学诊断候选抗原。     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

Seroreactivity and immunogenicity of Tp0965, a hypothetical membrane protein of Treponema pallidum

Background  Treponema pallidum (T. pallidum) subsp. pallidum is the causative agent of syphilis. Analysis of recombinant antigens of T. pallidum led to the identification of potential candidate antigens for vaccine development and syphilis serodiagnosis. Tp0965 was predicted to be a membrane fusion protein and was found to be reactive with infected human sera in previous studies, but the results were controversial. In this research, the antigenicity and immunoreactivity of recombinant protein Tp0965 were assessed.

Methods  T. pallidum subsp. pallidum (Nichols strain) was propagated and isolated and the genomic DNA was extracted. The Tp0965 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Then the recombinant protein Tp0965 was expressed in Escherichia coli and purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) purification system. The reactivities of protein Tp0965 were examined by immunoblot analysis and indirect enzyme-linked immunosorbent assay. The antisera against protein Tp0965 were obtained by immune rabbits and the immunogenicity of antisera were detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay.

Results  Recombinant protein Tp0965 was expressed successfully in vitro. Immunoblot assay showed that the recombinant protein Tp0965 could be recognized by human syphilitic sera of all stages. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay showed there were only 4 of 74 human syphilitic sera that failed to show reactivity to recombinant antigen Tp0965, and lack of reactivity of Tp0965 to all 28 uninfected sera. A low titer of antiserum against Tp0965 in immune rabbits could be detected after the third time of immunization.

Conclusions  The recombinant antigen Tp0965 shows excellent sensitivity for the reactivity with sera from syphilitic individuals at all stages. The results also demonstrate a potential application for the serodiagnosis of syphilis.     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的表达及纯化

目的克隆结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的编码基因Rv1926c,并在大肠杆菌中表达纯化,获得结核分枝杆菌重组MPT63蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1926c基因编码序列,克隆入原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组MPT63抗原蛋白。结果测序表明重组质粒pET30aRv1926c具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白MPT63在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达。结论结核分枝杆菌MPT63重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

The detection of transmissible gastroenteritis viral antibodies by immunodiffusion.

Precipitating antibodies against transmissible gastroenteritis viral antigens were detected by the immunodiffusion test in two transmissible gastroenteritis viral hyperimmune antisera and in antiserum prepared against haemagglutinating encephalomyelitis virus but not in sera from several species of normal animals, in antisera prepared against a variety of othet viruses and bacteria or sera from swine with bacterial enteritis. When the immunodiffusion test was compared with the virus neutralization test for the detection of transmissible gastroeneritis viral antibodies in 20 swine sera certain samples which contained high titres of virus neutralizing antibodies failed to produce precipitation while other sera were positive in the immunodiffusion test although their virus neutralizing antibody titres were relatively low. Precipitating antibodies were also detected by immunodiffusion in several samples of milk whey from a sow which had been vaccinated with inactivated transmissible gastroenteritis virus.     

感染犬弓首线虫鼠血清抗弓首线虫幼虫抗体和循环抗原检测

采用间接 ELISA 和双抗体夹心 ELISA 检测感染犬弓首线虫小鼠血清抗弓首线虫幼虫抗体和循环抗原。间接 ELISA 用犬弓首线虫幼虫排泄分泌抗原(TES-Ag)包板,二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG。夹心 ELISA 用豚鼠抗 TES-Ag 的 IgG 包板,第二抗体用辣根过氧化物酶标记的兔抗TES-Ag 的 IgG。结果表明,感染后第1天血清循环抗原即为阳性,第15天血清抗体出现阳性,第87天实验结束时,血清抗体和循环抗原均是阳性。