人脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管修复大鼠坐骨神经缺损

目的 探讨诱导后的脐带间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复大鼠坐骨神经缺损的可行性.方法 从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞并诱导分化为神经样细胞,与去细胞神经基膜管共培养以构建组织工程神经;用30只健康成年雄性SD大鼠建立坐骨神经缺损(10 mm)的动物模型并随机分成3组:A组为脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组,B组为单纯去细胞神经基膜管组,C组为自体神经桥接组.术后10周通过神经电生理检测、组织学观察等评测效果.结果 在局部观察和肌肉测量、神经电生理检测、组织学观察等方面,脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组(A组)神经再生及肢体功能情况良好,效果接近于自体神经桥接组(C组),明显优于单纯去细胞神经基膜管组(B组).结论 脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管构建的组织工程神经可有效促进大鼠坐骨神经缺损(10 mm)的修复.     

构建猕猴组织工程化周围神经的实验研究

目的评价组织工程化周围神经修复猕猴4cm尺神经缺损的实验效果,为临床研究提供资料。方法分别用6种移植物桥接4cm尺神经缺损。A组:自体BMSCs 去细胞同种异体神经支架;B组:自体SCs 去细胞同种异体神经支架;C组:自体BMSCs PLGA支架导管;D组:去细胞同种异体神经支架;E组:PLGA支架导管;F组:自体神经。通过功能学、神经电生理学及组织学研究评价各自的实验效果。结果A、B、C三种组织工程化神经实验组,术后6个月神经电生理和组织学检查,能引起小鱼际肌群产生复合动作电位的潜伏期、复合动作电位的最大振幅、神经传导速度和再生的神经纤维数目与自体神经移植组(F组)相比差异无显著性意义(P>0.05),但分别大于未加细胞的支架组(D、E组),差异有显著意义(P<0.05)。结论用自体源SCs或BMSCs作种子细胞与去细胞同种异体神经支架,或自体源BMSCs与PLGA支架导管构建不同的组织工程化周围神经,修复猕猴4cm尺神经缺损均取得较好的效果。     

骨髓诱导分化内皮细胞构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

骨髓基质干细胞（BMSCs）在特定培养条件下能够诱导分化为内皮细胞,是构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）较有前景的种子细胞来源.我们研究探讨应用BMSCs诱导分化的内皮细胞和猪去细胞瓣膜支架体外构建TEHV的可行性.     

去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨去细胞异种神经(acellular xenogeneic nerve,AXN)复合骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)修复周围神经缺损的效果.方法 体外培养大鼠BMSCs;取雌性Wistar大鼠60只,随机分为3组,每组20只,建立右坐骨神经10 mm缺损修复模型.A组:BMSCs与AXN复合修复神经缺损;B组:单纯AXN修复神经缺损;C组:自体神经移植组.术后4、12周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测,判断坐骨神经功能恢复情况.结果 术后移植物内均可见细胞生长,A、C组细胞数目较多,排列整齐,只有A组S-100免疫组化染色阳性细胞内可见BrdU阳性表达,术后12周再生神经已通过远端缝合口.A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组(P＜0.05),A组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs作为种子细胞可以在体内存活,并可分化为SCs,其与AXN复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植.     

自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养复合同种异体完全脱蛋白骨修复关节软骨全层缺损的研究

[目的]探讨自体骨髓间充质干细胞(bone m arrow-derived m esenchym al stem cells,BMSCs)与软骨细胞共培养复合同种异体完全脱蛋白骨(fu lly deprote in ized bone,FDB)修复关节软骨缺损的可行性,评价修复效果,为优化种子细胞源提供依据。[方法]取浓度为3×106/m l的第二代BMSCs和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞。FDB与共培养细胞复合接种植入修复缺损为实验A组、单纯FDB为对照B组和不处理为空白对照C组,移植8、16周后经人体观察、组织学评分和免疫组化染色评价缺损的修复。[结果]共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖快。A组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟。B组和C组的修复组织呈纤维组织和无修复。组织学评分表明A组优于B、C 2对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),B组与C组差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色显示A组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好。[结论]自体BMSCs与软骨细胞共培养作为种子细胞,BMSCs能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,节省大量的软骨细胞,与FDB复合后能有效修复关节软骨缺损。     

脱细胞骨软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞修复羊骨软骨缺损的研究

目的探讨脱细胞骨软骨支架接种自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复羊骨软骨缺损效果,探索骨软骨缺损新的修复方式。方法制备直径为8mm骨软骨脱细胞支架,培养羊BMSCs,接种于骨软骨支架,制备羊负重区骨软骨缺损模型,分空白、空白支架及细胞支架复合物3组,每组4只羊,3个月后处死动物取标本行大体及组织学检测。结果修复羊负重区骨软骨缺损模型实验结果显示细胞支架复合修复组骨软骨有较好修复,空白支架组软骨下骨基本修复、软骨侧无明显修复,空白对照组未见明显修复,缺损边缘软骨退变。结论含骨软骨连接结构的脱细胞骨软骨支架接种种子细胞能较好的修复羊负重区骨软骨缺损。     

组织工程化骨膜的构建及其在体外的成骨活性检测

[目的]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程骨膜,体外观察其生物学特性并检测成骨活性,为将来体内移植提供实验依据。[方法]以猪小肠粘膜下层基质作为支架材料,与新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)或体外成骨诱导培养后的BMSCs,采用沉淀法复合构建两种组织工程化骨膜(M2及M1),用MTT法检测种子细胞在支架材料上的生长情况;扫描电镜(SEM)观察种子细胞在支架材料上的生长、粘附状态;通过ELISA检测碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌水平。[结果]种子细胞在SIS上生长良好,M2及M1在含有成骨诱导剂的培养基中培养可分泌一定量骨钙素(11 d达峰值),并表达碱性磷酸酶活性(7 d达峰值)。而且,Ml所分泌骨钙素的量与碱性磷酸酶活性高于M2,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程化骨膜能够保持较稳定的生物活性,种子细胞能良好地在支架上附着、生长增殖,并稳定地分泌一定量的骨钙素和碱性磷酸酶,在体外表达较强的成骨活性。     

经碱性成纤维细胞生长因子修饰骨髓基质干细胞注射式修复全层软骨缺损

目的 探讨经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)修饰的骨髓基质干细胞(BMSCs)注射式修复全层软骨缺损的可行性.方法 体外培养家兔自体骨髓基质干细胞,并以bFGF处理修饰细胞,免疫组织化学Ⅱ型胶原蛋白表达、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蛋白聚糖表达.将其与藻酸钙凝胶支架复合注射式植入兔股骨髁全层软骨缺损处,同时设立凝胶支架对照组和空白对照组.术后8周取材观察修复效果,并行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色检测;透射电镜观察修复组织的微观结构.结果 BMSCs的细胞群体倍增时间(PDT)为33.8 h,经bFGF处理的BMSCs可检测到Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.至术后8周可见质硬的类白色修复组织完全充填软骨缺损处,组织学检查可见大量软骨样细胞分布于深染的细胞外基质中,检测到Ⅱ型胶原的表达.透射电镜可见丰富的细胞器和胞外基质.凝胶支架对照组和空白对照组仅有部分质软组织充填缺损处,未检测到Ⅱ型胶原的表达.结论 经hFGF修饰的自体骨髓基质干细胞藻酸钙凝胶复合物可用于修复全层软骨缺损.     

脂肪干细胞/Ⅰ型胶原凝胶/聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙骨组织工程复合体的构建及其异位成骨研究

目的 构建基于脂肪干细胞、Ⅰ型胶原凝胶以及聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙支架(PLGA-β-TCP)的骨组织工程复合体并对其异位成骨进行研究.方法 设计构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(C组)以及单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)作为对照.扫描电镜、相差显微镜观察细胞材料复合情况并对脂肪干细胞增殖以及成骨分化进行分析.体外成骨诱导培养2周后移植于自体股部肌袋,8周后取出,依次行放射学、组织学定性及半定量分析.结果 (1)体外成骨诱导2周,A组细胞增殖率慢于B组(P<0.05,n=4),但其细胞总数远高于后者(P<0.01,n=4).A组碱性磷酸酶(ALPase)活性、细胞外基质矿化程度均显著高于B组(P<0.01,n=4).A组细胞悬浮于Ⅰ型胶原凝胶并均匀分布于材料孔隙中而B组细胞仅见黏附于材料表面.(2)移植8周,X线片示A组高密度钙化影形成,B、C、D组未见有阳性结果.A组材料孔隙中均匀充满新生骨组织,可观察到骨小梁样结构.B组仅在少数孔隙中有类骨组织形成,同时伴有结缔组织长入.A组新生骨面积百分比显著高于B组(P<0.01,n=4).结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶来实现脂肪干细胞与PLGA-β-TCP多孔支架材料的均匀复合,能够有效促进脂肪干细胞在材料孔隙中的成骨分化及均质骨组织形成.     

基质金属蛋白酶-2敏感型聚乙二醇复合水凝胶的制备及性质

目的 采用相对分子质量20000 Da分枝状聚乙二醇(four-armed PEG-Ac)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)敏感型底物肽制备一种可降解复合水凝胶,并检测其性能.方法 以制备浓度为10％ (w/v)的酶敏感型复合PEG水凝胶为实验A组,单纯PEG水凝胶为对照B组,比较两种水凝胶在37℃磷酸盐缓冲液(PBS)和血清的降解,并检测细胞毒性.在制胶过程中包埋转化生长因子(TGF-β1),观察两组水凝胶对TGF-β1的缓释效果.结果 PBS中A、B两组4周累计降解率分别为78.36％、76.28％,两者差异无统计学意义(P＞0.05)；分别添加正常人体血清,A组4周累计降解率为88.35％,降解速度加快,B组则变化不明显.噻唑蓝(MTT)比色法检测复合PEG水凝胶无细胞毒性.A、B两组水凝胶TGF-β17 d累计释放率分别为50.63％、44.36％,两者差异无统计学意义(P＞0.05),分别添加MMP-2后,A组对TGF-β1的释放速度明显加快.结论 MMP-2敏感型PEG水凝胶结构稳定,对细胞无毒性,包埋TGF-β1有良好的控释效果,有望应用于新型组织工程心脏瓣膜支架材料的研制.     

去细胞猪主动脉瓣移植于犬腹主动脉内构建组织工程瓣

目的 探讨在犬腹主动脉内构建组织工程心脏瓣膜的实验方法。方法 将预种犬血管间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶(猪瓣),移植于6条犬的腹主动脉内,于术后4,6,8和10周对移植瓣叶进行形态、组织结构及免疫组化染色观察。结果 (1)移植术后4周时瓣叶周边有多层细胞长入,新细胞外基质形成,原支架组织部分吸收。(2)10周末猪瓣组织完全吸收,为宿主细胞及新合成的细胞外基质取代。基质中间质细胞主要为成纤维细胞和肌纤维母细胞。细胞外基质成分主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原和少量弹力纤维,并含有中性和酸性黏多糖。(3)内皮细胞覆盖于瓣叶表面。结论 (1)移植于犬腹主动脉内的去细胞猪瓣于移植术后10周末基本构成组织工程瓣叶;(2)腹主动脉内异位移植是一种可供选择的实验研究方法。     

利用不同复合技术体外构建三维尿道组织的比较研究

目的 探讨优化体外构建三维立体尿道组织的复合技术.方法 高速振荡脱细胞法制备猪尿道海绵体脱细胞(ACSM)支架,碘消毒法进行复合前消毒,酶消化法分离及扩增兔舌黏膜上皮细胞和海绵体平滑肌细胞.采用3种复合技术进行细胞与ACSM的复合.A组(三明治复合组):于ACSM尿道面及海绵体面分别静态接种两种细胞.B组(注射复合组):将平滑肌细胞注射入ACSM内部并在尿道面静态接种舌黏膜上皮细胞.C组(动态复合组):采用振荡法将平滑肌细胞接种于ACSM内部并在尿道面静态接种舌黏膜上皮细胞.体外培养14 d以后行HE染色以检查复合效果. 结果振荡脱细胞处理后ACSM的结构较脱细胞前更为疏松;碘消毒法在彻底消毒的同时能够最大限度的保留脱细胞支架的原有结构.复合支架体外培养14 d后HE染色均可见有完整的上皮细胞层形成于支架表面.A组复合后平滑肌细胞仅在支架大间隙中可见,未见向深部浸润趋势.B组复合后平滑肌细胞成团分布于支架内,并受周围支架组织约束成局限化表现,仅5%～10%的细胞有向外生长倾向.C组HE染色可见平滑肌细胞均匀分布于支架内部,15%～20%的区域可见平滑肌成束生长.同时平滑肌层与支架表面的上皮细胞层分界清晰. 结论高速振荡法制备的支架组织具有理想的三维空间结构,结合动态细胞复合技术可构建拥有良好立体结构的尿道组织.

Abstract：

Objective To investigate and assess the best seeding method for constructing three dimensional urethral tissue in vitro. Methods High speed agitation decellular method was used for preparing the porcine acellular corporous spongiosum matrix (ACSM). Before seeding, the matrix was sterilized via soaking compound iodine solution. Rabbit tongue epithelial cells and cavernosal smooth muscle cells were isolated and cultured. Three different groups of seeding method was used in this study. Group A (sandwich seeding group): The smooth muscle cells and epithelial cells were seeded onto the different side of ACSM by static method. Group B (injection seeding group): The smooth muscle cells were injected into the scaffold. Then, epithelial cells were seeded onto the urethral surface of ACSM by static method. Group C (agitation seeding group): The smooth muscle cells were seeded into the scaffold by agitation method. Then, epithelial cells were seeded onto the urethral surface of ACSM by static method. After being seeded, all matrixes were cultured in vitro for 14 d. HE and immunoassay staining were used to examine the results of seeding. Results Looser matrix was obtained after using high speed agitation decellular method. Compound iodine solution could not only sterilize efficiently but also reserve the original structure of biomaterial. An intact epithelial cellular layer onto the surface of scaffold could be observed in HE staining section after 14 d culturing in vitro.Few smooth muscle cells could be found in big space of biomaterial in group A. In group B, smooth muscle cells were restrained in some regions of the matrix. Smooth muscle cells were well distributed into the scaffold in group C. Conclusions After using high speed agitation decellular method, an ideal matrix with three dimensional structure can be obtained. Combined with agitated seeding method, three dimensional urethral tissue can be constructed.     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

同种异体软骨细胞与自体骨髓基质干细胞混合共培养构建软骨皮下移植的可行性研究

背景：软骨组织工程的种子细胞问题是目前研究的热点和难点,如何找到一种既能够避免对自体软骨进行取材又能够达到稳定软骨构建目的的方法呢？本研究尝试利用少量同种异体羊软骨细胞作为软骨诱导微环境提供者,与扩增后的羊自体BMSC混合共培养并植入皮下环境,探讨利用同种异体软骨细胞共培养构建软骨皮下移植的可行性。方法：本实验对山羊软骨细胞和BMSC分别进行取材和分离培养扩增,并将以上细胞分为以下四组进行混合并接种在PGA支架材料上：A组：100%自体软骨细胞;B组：30%自体软骨细胞＋70%自体BMSCs;C组：30%同种异体软骨细胞＋70%自体BMSCs;D组：100%同种异体软骨细胞。经过体外构建6周后植入羊皮下进行体内构建12周,对所形成的组织块进行大体观察和组织学染色等评价。结果：自体软骨细胞组和自体软骨细胞混合自体BMSC组皮下移植后可见成熟软骨组织形成,但同种异体软骨细胞参与的两组（包括同种异体软骨细胞混合自体BMSC的实验组和单纯异体软骨细胞组）在皮下环境中都因为较强的免疫反应未能形成软骨组织。结论：同种异体软骨细胞以及PGA支架材料的存在对于组织工程软骨在羊皮下环境的构建有负面影响。     

Computed tomography detects tissue formation in a stented engineered heart valve

Tissue-engineered heart valves (TEHV) are being explored as an alternative to conventional heart valve prostheses. Using the classic tissue engineering paradigm, a stented tri-leaflet valve is fabricated. Subsequently, the construct is implanted into the pulmonary position in a sheep. Follow-up by means of computed tomography, magnetic resonance imaging, and echocardiography was used to assess tissue formation. After 4 weeks, the scaffold of the TEHV has degraded and new tissue is formed. However, small areas without tissue formation were present at macroscopic inspection. This phenomenon was only visible on computed tomographic images. Therefore, computed tomography appears a promising technique for in vivo follow-up of tissue formation in tissue-engineered heart valves.     

同种异体脱钙骨复合骨髓间充质干细胞在兔膝关节腔内培养组织工程软骨的研究

目的 比较同种异体脱钙骨和细胞因子诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)制成细胞-支架复合物在兔膝关节腔内环境较体外培养出组织工程软骨的优点.方法 BMSC向软骨细胞诱导后与同种异体脱钙骨支架复合分别在体外培养(A组)和成年雄性新西兰白兔(15只)左侧膝关节腔内(B组)培养,右侧膝关节腔内(C组)培养单纯脱钙骨支架做空白对照.每4、8、12周各组标本分别取材,制石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学等组织学观察,并通过形态学分析软件计算免疫组织化学平均光度(A)值.结果 标本石蜡切片HE染色:4周时A组标本见软骨细胞散在分布于支架表面,内部基本未观察到细胞.B组标本支架内软骨细胞数量明显较多,软骨陷窝形成,陷窝周围基质深染,可见由单个细胞分裂形成的同源细胞群.8周时B组标本以成熟软骨细胞为主,细胞数量多,出现柱状排列的同源细胞群,细胞周围分泌着色均一的玻璃样基质,且渗入支架结构内部,脱钙骨支架有部分被吸收.12周时各组支架结构明显被吸收,A组支架内填满软骨细胞,部分已纤维化,但结构排列紊乱.B组支架呈透明软骨样,软骨细胞充分渗透进入支架内,呈一定应力方向排列.Ⅱ型胶原免疫组织化学A值统计学分析比较发现:第4,8,12周B组Ⅱ型胶原免疫组织化学的A值均高于A组,差异有统计学意义(P＜0.01).两组间A值随时间的变化趋势差异有统计学意义(P＜0.01).结论 同种异体脱钙骨支架复合经细胞因子诱导的BMSC,在膝关节腔内进行培养,利用关节腔内低氧、多种生长因子的微环境以及关节活动时的应力刺激等优势,较体外培养可以培养出组织学特点更好的工程软骨.

Abstract：

Objective To compare the superiority of cultivating tissue engineered cartilage by homologous decalcified bone matrix combined with bone-marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in rabbits' knee cavity with culture in vitro. Methods Archiogeneration BMSCs were isolated and purified by adhering to the culture glassware wall from neonatal New Zealand white rabbits. The third generation BMSCs were induced to chondrocytes by transforming growth factor TGF-β1, insulin-like growth factor IGF-1 and vitamin C. Seven days later, the cells were bond to homologous decalcified bone matrix and cultured in vitro (group A) , cultured in rabbits' left knee cavity (group B) , or bond to homologous decalcified bone matrix and cultured in rabbits' right knee cavity ( group C ). Every 4 weeks after cellular transplant, all rabbits in groups B and C were sacrificed and paraffin-embedded sections were made from the specimens.All the section were subjected to H-E stain, toluidine blue stain and type Ⅱ collagen immunohistochemical staining with chromogen diaminobenzidine ( DAB) . Immunohistochemical absorbance ( A) values were calculated by morphology analysis software. Measurement data were expressed as mean ± standard, and satistical analysis was performed by t test, one-way ANOVA using SPSS 15. 0 software. Results After cultivation for 4 weeks, H-E stain showed diffuse distribution of chondrocytes on scaffold' s surface in group A.In group B, there were a great quantity of chondrocytes in the scaffold, and cartilage lacuna, matrix anachromasis and isogenous group were group. At the 8th week, in group B maturated chondrocytes and isogenous groups arranged as column, surrounded by a pond of cellular matrix infiltrating into the scaffolds. The decalcified bone matrix was absorbed partly. At the 12th week, all the scaffolds were absorbed obviously.Chondrocytes filled into the scaffolds in group A, but arranged irregularly. In group B chondrocytes arranged in the stress orientation. At 4th, 8th, and 12th week, A values of type Ⅱ collagen in group B was significantly higher than in group A with the different being significant. Conclusion Compound of Homologous decalcified bone matrix-induced BMSCs cultured in rabbits' knee cavity could yield better histological feature tissue engineered cartilage.     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复兔桡骨节段性骨缺损

目的 探讨丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HA)组织工程化骨的成骨作用,以期为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料.方法 将SF/HA与成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)复合,构建组织工程化骨.取54只兔于左侧桡骨中上段制备15 mm节段性骨缺损.实验分3组(A、B组各24只,C组6只):A组:植入SF/HA组织工程化骨,B组:单纯植入SF/HA;C组:骨缺损区不植入任何材料.于术后4、8、12及16周摄X线片,并于16周行螺旋CT扫描重建,观察骨缺损修复及骨塑形情况,参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组骨缺损的骨修复程度评分.骨痂标本行 HE染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较12周和16周时各组的骨修复情况. 结果 术后16周,X线片示A组髓腔通畅,新骨塑形好,骨皮质连续;B组缺损区有缩小,两断端不连接;C组缺损区无明显骨痂生长.16周时螺旋CT扫描重建显示:A组骨塑形明显,骨缺损完全修复;B组有部分皮质骨形成,缺损区不能完全修复;C组骨缺损基本无修复.每组术后4、8、12、16周不同时间点的放射学评分差异均有统计学意义(P＜0.05).术后12、16周时3组间Lane-Sandhu组织学评分差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 SF/HA组织工程化骨具有良好的节段性骨缺损修复能力,但SF/HA本身缺乏骨诱导作用,单独修复节段性骨缺损作用有限.     

犬骨髓间充质干细胞体外分离、诱导成纤维细胞的实验研究

目的探讨体外稳定诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为成肌纤维细胞和成纤维细胞的方法,为构建组织工程瓣膜提供种子细胞。方法应用Percoll(密度1·073g/ml)淋巴细胞分离液分离健康犬骨髓标本,取分离的BMSC,在低糖改良Eagles培养液中培养,并用免疫组织化学的方法做细胞表型鉴定,然后用条件培养基对第2、3代细胞进行诱导分化,并用层黏连蛋白单抗对诱导后的细胞做免疫组织化学鉴定。并对诱导后细胞进行冻存,7d后复苏观察细胞的生长、增殖及功能。结果经Percoll液分离的骨髓单核细胞,经贴壁培养后,其表型为波形蛋白阳性、α平滑肌肌动蛋白阳性、CD3-4、层黏连蛋白阴性;诱导后细胞表达层黏连蛋白,阳性细胞数可达(50±3)%;诱导后BMSC经冻存复苏后,细胞复苏率(85±3)%,复苏后细胞生长、增殖旺盛,功能不受影响。结论BMSC体外能定向诱导分化为成肌纤维细胞和成纤维细胞,并符合种子细胞的要求。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。