人骨髓间充质干细胞体外培养及与Bio-gide胶原膜复合培养的实验研究

目的本实验拟研究人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stemcells,hMSCs)分离、培养与鉴定的方法,探讨其作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法体外分离培养hMSCs,进行形态学观察,细胞表面抗原检测;将hMSCs与Bio-gide胶原膜进行体外复合培养,通过倒置相差显微镜,扫描电镜进行观察。结果梯度密度离心法结合贴壁筛选法能获得高纯度高活性的hMSCs。hMSCs可在Bio-gide胶原膜上贴附增殖,并复层生长。结论hMSCs取材方便、创伤小;扩增分化能力强。hMSCs可作为牙周组织工程种子细胞来源。Bio-gide胶原膜可作为细胞生长载体。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞方法的建立

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,并在体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。方法：利用Percoll梯度分离法、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增hMSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、IBMX及胰岛素定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hMSCs,hMSCs具有独特的细胞免疫学表型,即CD73、 CD105、CD166、CD90及CD44阳性,CD34、CD31及CD45阴性。诱导3 d后,hMSCs细胞内有小脂滴出现,诱导2周后,脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形。结论：成功建立hMSCs分离培养方法,体外定向诱导hMSCs分化为脂肪细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法：应用贴壁筛选法分离培养Wistar大鼠髓间充质干细胞,用直接荧光抗体染色法对培养的细胞进行鉴定。结果：体外培养的原代MSC 9d融合,荧光抗体染色CD44、CD105表达阳性,CD14、CD34表达阴性。结论：贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增MSC,可作为获得MSC的一种有效手段。     

全骨髓贴壁改良法分离培养人骨髓间充质干细胞及标记鉴定

目的对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的方法,探讨hMSCs鉴定和标记的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法采集成人健康志愿者骨髓5mL,全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增,获得hMSCs,对比三种方法。＂慢冻速融＂的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记,免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得,比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示：CD44阳性及CD71弱阳性,表达率分别为95.05%,78.86%;CD34、CD45阴性,表达率分别为3.40%,2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增,Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库,为组织工程、细胞移植研究打好基础。     

犬骨髓间充质干细胞体外分离培养及分化鉴定

目的:建立犬骨髓间质干细胞(dog bone mesenehymal stem cells,dBMSCs)的体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离d BMSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养。诱导dBMSCs向成骨、成脂细胞分化,并分别以矿化(钙)结节茜素红染色、油红O染色鉴定。结果:dBMSCs在体外分离培养扩增,形态呈长梭形成纤维细胞样,通过成骨、成脂诱导分化鉴定其为dBMSCs。结论:密度梯度离心法结合贴壁筛选法能有效的获取dBMSCs,所分离培养的d BMSCs同时具有多向分化潜能,是组织工程研究中理想的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究

目的 通过体外细胞培养和贴壁筛选法将骨髓间充质干细胞由骨髓中分离纯化并加以鉴定，观察该细胞的生物学特性，为其用于组织工程提供实验基础。方法 提取骨髓，通过离心和贴壁筛选培养获取骨髓间充质干细胞，原位杂交检测骨髓间充质干细胞的表面标志CD44对培养细胞进行鉴定；测定其生长曲线和贴壁率。结果 通过体外培养和贴壁筛选可获得骨髓间充质干细胞，该细胞在体外培养条件下可在短时间内贴壁生长，增殖速度迅速，适应性强，长期传代不改变其生物学特性。结论 体外细胞培养和贴壁筛选能有效分离纯化免骨髓间充质干细胞，细胞扩增稳定。     

人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定

目的：建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人成骨细胞共培养体系,为人破骨细胞体外培养提供更完善的方法。方法：采用酶消化法分离流产胎儿头盖骨,获取人成骨细胞,对在体外培养的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色（ALP染色）;利用Percoll 梯度分离法和贴壁筛选法培养hMSCs,应用流式细胞术检测hMSCs 免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的成骨细胞和hMSCs在体外共培养作为实验组,单独培养的成骨细胞作为对照组;对诱导后的细胞应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）进行鉴定。结果：体外分离、培养的hMSCs具有独特的细胞免疫学表型, 即CD73和CD105阳性, CD34和CD45 阴性。hMSCs与成骨细胞共同培养5 d后,即可见单个核细胞融合成多核细胞,TRAP 染色可见多数细胞胞浆呈酒红色,为诱导成功的破骨细胞。结论：hMSCs与人成骨细胞共同培养能诱导为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构

目的：培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据。方法：体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs,用5-氮杂胞苷（5-Aza,10 μmol•L^-1）体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构。结果：流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs。hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin。透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、粗面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接。结论：体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特性的心肌样细胞。     

体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的：研究在体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌细胞（CM）的分化。方法：体外分离培养扩增hMSCs,进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型CD34、CD44和CD45,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组;同时原代培养SD乳鼠的CM以模拟体外心肌微环境。选用生长良好、纯度达到95%的第5代hMSCs,与乳鼠原代培养的CM共培养,并进行心肌特异性标志cTnI的免疫组化鉴定。结果：体外分离纯化培养扩增出的hMSCs,不表达CD34及CD45,高表达CD44,其CD44阳性率平均为（93.26±2.48）％,与平行对照组［(3.42±1.09)%］ 比较差异有显著性(P<0.01)。hMSCs与CM共培养后,其形态逐渐向CM形态过渡,并表达心肌特异性抗体cTnI。结论：hMSCs在体外模拟的心肌微环境中可分化为CM,干细胞的分化具有环境依赖性。     

胎儿骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的从胎儿骨髓中分离培养纯化骨髓间充质干细胞(MSC),并进行细胞表面标志的检测,探讨MSC的培养方法。方法采用全骨髓培养、贴壁筛选法分离培养MSC,采用差速贴壁培养方法纯化细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志,并观察不同方法处理的培养界面对细胞贴壁和生长的影响。结果通过分离纯化培养,光镜下细胞形态以长梭形、不规则多角形为主;IV型胶原包被和Co60照射(照射量6GY)处理的培养瓶更利于MSC的贴壁、生长;流式细胞仪检测结果显示CD44( )、Stro-1( )、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)。结论采用贴壁筛选法和差速贴壁法结合可获得较高纯度的MSC,并且细胞生长良好,在体外具有较强的扩增能力。     

Targeted induction of differentiation of human bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells

A systematic method of isolating and culturing human bone mesenchymal stem cells （hMSCs）, and inducing them to differentiate into neuron-like cells in vitro was established. The hMSCs were isolated from bone marrow with the lymphocyte-separating medium, cultured and expanded in vitro, and induced after addition of compound neuro-revulsants. The morphological changes of hMSCs were observed, and the expression of surface markers in induced hMSCs was immunocytochemically identified during induction period. The hMSCs could be separated, cultured and expanded in vitro. After induction by compound neuro-revulsants for 48 h, the changes of neuron-like cells, such as cellular shrinkage and neurite growth, were observed in some cells. The immunochemical staining revealed nestin （＋） or NF （＋）, and GFAP （-）. It was concluded that hMSCs were successfully cultured and induced to differentiate into neuron-like cells.     

Biological Characteristics of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Cultured in Vitro

Some biological characteristics of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured in vitro were observed, hMSCs were isolated from bone marrow and purified by density gradient eentrifugation method, and then cultured in vitro. The proliferation and growth characteristics of hMSCs were observed in primary and passage culture. MSCs of passage 3 were examined for the purify by positive rate of CD29 and CD44 through flow eytometry. Human bone marrow MSCs showed active proliferation capacity in vitro. The purify of MSCs separated by our method was higher than 90%. It was concluded that hMSCs have been successfully cultured and expanded effectively. It provided a foundation for further investigation and application of MSCs。     

人骨髓间充质干细胞的分离及鉴定

［摘 要］ 目的：建立分离并鉴定人骨髓间充质干细胞（HMSC）的方法。 方法：联合应用Percoll（1.073 g•L^-1）密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离HMSC进行体外培养,利用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段对体外培养的HMSC进行鉴定。 结果：HMSC具有独特的表型特征,即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。细胞糖原反应（PAS）阳性、苏丹黑反应（SB）阴性。电镜观察结果提示细胞较幼稚。 结论：利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法可以分离HMSC,联合应用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段鉴定HMSC的方法有效。     

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

目的 通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响.方法 采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测.结果 分离培养的hMSCs CD105表达阳性, CD34表达阴性.重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs的转染率为81.14%, CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好.免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积.结论 腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究.     

GM-CSF in combination with IL-4 induce the malignant transformation of the bone marrow-derived human adult mesenchymal stem cell

Objective: In this study we examined the effect of GM-CSF in combination with IL-4 on the bone marrow derived human adult mesenchymal stem cells (hMSCs). Method: The hMSCs were isolated and cultured with GM-CSF and IL-4 for one month, and then we isolated the single colony of transformed cells and characterized the phenotype of them by morphology, surface marker expression and in vivo tumorigenesis. Result: After one month culture, the transformed mesenchymal cells exhibited the morphology and phenotype similar to tumor cells, causing multiple fast growing lung deposits when injected into immunodeficient mice. Conclusion: Cytokines-driven malignant transformation of hMSCs may be a useful model for studying signaling pathways initiating malignant transformation of hMSC.     

体外成骨诱导增加人骨髓间充质干细胞刺激PBMCs增殖

目的初步观察人骨髓间充质干细胞(human bonemarrow derivedmesenchymal stem cell,hMSCs)及其成骨分化后代的免疫原性,为异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞研究提供理论基础.方法应用Percoll密度梯度离心法从人骨髓中分离、培养细胞hMSCs;将第3代hMSCs及其体外诱导成骨3周的分化后代分别与人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)混合培养,观察上述细胞对PBMC的刺激指数.结果Percoll(1.073g/ml)分离培养的原代hMSCs为均匀一致的梭形,呈漩涡样排列.其在体外成骨诱导3周时Von-Kossa染色见细胞间质有大量的钙盐沉积,免疫细胞化学检测见到大多数细胞骨钙素表达阳性.混合细胞培养结果显示:不同细胞数量的hMSCs对PBMCs的刺激指数(stimulation index,SI)均小于2;而1×104、5×103、103的hMSCs-Osteo对PBMCs的刺激指数大于2.结论hMSCs的免疫原性较低,在体外不能刺激PBMCs增殖.但hMSCs的成骨分化后代的免疫原性增加,一定数量细胞在体外能够刺激PBMCs增殖,其在异基因宿主体内可能引起免疫排斥反应.本实验结果提示:异基因骨髓间充质干细胞要作为骨组织工程种子细胞,必须克服免疫方面的障碍.     

人骨髓基质干细胞克隆对脐血造血干细胞体外扩增作用的研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞的克隆化培养及其对体外造血干细胞扩增的影响。方法：取正常肋骨分离骨髓，制备单个核细胞贴壁培养，约5d后取集落样生长的梭形细胞扩增培养，传代、将分选的脐血造血干／祖细胞接种到克隆培养的人骨髓基质干细胞及其他培养条件液上，比较不同培养条件及不同代次骨髓基质干细胞对造血干／祖细胞扩增能力及集落形成能力的影响。结果：人骨髓基质干细胞能扩增达20代以上，经流式细胞仪检测证实基质干细胞，单纯细胞因子组和细胞因子加基质干细胞组能有效扩增造血细胞，而后者有维持长期造血的作用。结论：该克隆培养方法能有效扩增骨髓基质干细胞，培养的细胞有体外支持长期造血的作用。     

人骨髓间充质干细胞与汗腺细胞共同培养诱导细胞表型转化的初步研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)在体外与损伤的人汗腺细胞(human sweat gland cells, hSGCs)共培养时的转化情况.方法体外分别分离培养和扩增hMSCs和hSGCs,用二步免疫细胞化学法检测hMSCs和hSGCs抗原表达情况.用5 μmol/L的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)对培养的hMSCs进行连续培养标记.待原代培养的hSGCs达70%融合后,给予47℃高温处理40 min造成热损伤体外模型,37℃冷却1-2 h,然后加入(1-2)×105 BrdU标记的hMSCs共同培养,2周后,以抗癌胚抗原(CEA)和抗BrdU单克隆抗体作为一抗,采用免疫细胞化学双染法检测共培养的细胞.结果 hMSCs 和hSGCs均呈克隆样生长, hMSCs表达CD44和CD105,不表达CD34和CEA;hSGCs表达CK7、CK8、CK19、CEA.用BrdU 标记hMSCs 阳性率可达90%,hSGCs经高温损伤后,大多数细胞的细胞间连接消失.共培养2周后,部分细胞同时表达CEA和BrdU,并有多核现象.细胞染色示双染细胞可达1%～5%,多核细胞且核染色不同的细胞约为0.01%～0.05%,多核细胞与其他双染细胞相比,细胞明显的宽大扁平.结论在损伤的微环境下,hMSCs可以向hSGCs转化,其机制可能是细胞分化、细胞融合甚至是核融合.     

骨髓间充质千细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化,鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC,由门静脉注入肝移植受体,取肝组织冰冻切片,观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC,并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d,可在体外传代20代以上,具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100％。荧光显微镜观察。可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高,生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.