体外高浓度葡萄糖培养及黄芪干预人外周血内皮祖细胞的数量和增殖与分化**☆

背景：内皮祖细胞数量及功能受损是糖尿病血管并发症发生发展的重要环节,黄芪对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用,可以有效保护血管内皮功能。 目的：观察高浓度葡萄糖及黄芪干预对人外周血内皮祖细胞数量、增殖及分化影响。 方法：不同浓度葡萄糖孵育内皮祖细胞24 h以及30 mmol/L葡萄糖孵育内皮祖细胞不同时间;内皮祖细胞经20 g/L黄芪预处理24 h后,再加入30 mmol/L葡萄糖培养24 h。 结果与结论：高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少内皮祖细胞的数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力(P < 0.05或0.01),给予黄芪预处理后,内皮祖细胞数量明显增加,增殖及向内皮细胞系分化能力明显增强(P < 0.05或0.01)。提示高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少外周血内皮祖细胞数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力,黄芪可以改善高葡萄糖对内皮祖细胞的损伤作用。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。 目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。 方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3 d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

猪外周血内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定

背景：内皮祖细胞是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,研究表明猪的心血管解剖结构较其他低等哺乳动物更接近于人类,用其建立心血管疾病模型更具临床意义。 目的：拟在体外建立猪外周血内皮祖细胞的分离培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-09/2008-05在美国纽约州布法罗大学心血管疾病研究中心和首都医科大学病理生理学教研室完成。 材料：12周龄健康成年猪6只,由布法罗大学实验动物中心提供。 方法：采集猪外周血,以梯度密度离心法分离血单核细胞,按3×107/孔密度接种于预先包被Ⅰ型鼠尾胶原的6孔培养板,每孔加入EGM-2内皮细胞生长培养液2 mL,贴壁法纯化扩增,取传至第2代细胞用于指标检测。 主要观察指标：采用免疫荧光染色和流式细胞仪检测内皮祖细胞表面抗原的表达,通过内吞DiI-acLDL和Matrigel血管形成实验进行细胞功能学鉴定,将第2~10代细胞按500个/孔接种后检验其克隆形成能力。 结果：猪外周血单核细胞体外培养7~10 d后,出现呈铺路石样的细胞克隆,表达内皮祖细胞表面抗原CD9,CD31,CD105,VE-Cadherin,VEGFR2和内皮源性一氧化氮合酶,部分细胞表达干细胞标志c-Kit,但不表达CD133和造血祖细胞标志CD45。细胞能内吞DiI-acLDL,在Matrigel上可以形成毛细血管样结构,且具有很强的克隆形成能力。第2,4,6,8,10代细胞克隆数及内皮祖细胞总数均基本相似（F =0.167,F=0.195,P > 0.05）。 结论：梯度密度离心联合贴壁法可成功从猪外周血中分离培养出内皮祖细胞,体外扩增后细胞增殖能力无变化。     

实验性牙移动大鼠外周血内皮祖细胞的培养

背景：观察血管内皮祖细胞在牙周血管改建中的作用规律对于研究正畸牙周改建机制具有重要意义。 目的：对牙移动大鼠外周血内皮祖细胞进行体外分离、培养及鉴定,探讨牙齿移动是否可动员骨髓内皮祖细胞进入外周血。 设计、时间及地点：细胞体外分离培养及生物学指标检测,随机对照动物实验。于2007-09/2008-04在吉林省口腔生物医学工程重点实验室完成。 材料：24只Wistar大鼠,随机分为实验组和对照组,每组12只。 方法：实验组建立大鼠牙移动模型,对照组置牵拉装置但不加力。加力第2天取两组动物外周血制作细胞涂片,检测其中CD133阳性细胞数。同时以Percoll密度梯度分离提取其外周血单个核细胞,培养至第12天,取两组细胞爬片进行相关指标检测。 主要观察指标：以免疫细胞化学染色和免疫荧光化学染色检测细胞表面标志物,荧光化学检测细胞吸收乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素1情况,MTT法检测细胞增殖情况。 结果：实验组细胞涂片中CD133阳性细胞率明显高于对照组（P < 0.05）。所培养细胞可同时吸收Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白、FITC标记的荆豆凝集素1,呈CD133、Ⅷ因子、CD34阳性。实验组细胞增殖活性高于对照组（P < 0.05）。 结论：实验初步证实了实验性牙移动可动员大鼠骨髓内皮祖细胞进入外周血。     

重型颅脑损伤患者外周血内皮祖细胞动态变化及意义

目的探讨重型颅脑损伤患者外周血内皮祖细胞（EPCs）水平的动态变化及其意义。方法收集我院收治的重型颅脑损伤患者58例（颅脑损伤组）、健康体检者22例（对照组）,采用流式细胞技术检测颅脑损伤组患者伤后1、4．7、14、21d及对照组外周血EPCs水平。结果与对照组相比,伤后1d,颅脑损伤组外周血EPCs水平无显著变化（P〉0．05）,伤后4d降至最低值（P〈0．05）;随后逐渐升高,伤后7d达最高峰（P〈0.05）,随后逐渐下降,伤后21d与对照组无显著差异（P〉0．05）。伤后1d外周血EPCs水平与入院时患者GCS评分呈正相关（RS=0．452,P〈0．05）;伤后7、14、21d外周血EPCs水平与伤后6个月GOS评分呈正相关（rs分别为0．423,0．469,0．455;P〈0．05）。结论外周血EPCs可作为重型颅脑损伤患者预后的一个重要评价指标。     

颈动脉粥样硬化患者外周血内皮祖细胞部分生物学功能改变及其意义

目的:观察颈动脉粥样硬化患者外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)生物学功能的改变,探讨EPCs在颈动脉粥样硬化发生发展中可能作用。方法:选择颈动脉粥样硬化患者和同年龄组正常人各20例,密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种在培养板内,培养7天后对贴壁细胞进行细胞化学分析和部分生物学功能测定。激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝血素Ⅰ(FITC-UEA-I)和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。胰蛋白酶消化后计数贴壁细胞观察EPCs黏附能力;改良的Boyden小室观察EPCs的迁移能力;MTT法检测EPCs增殖能力;体外血管生成实验观察EPCs体外生成血管能力。结果:颈动脉粥样硬化患者外周血EPCs黏附细胞数(35.15±6.55)较正常对照组(45.25±7.04)显著减少(P<0.01);EPCs的增殖能力(0.649±0.033)较正常对照组(0.680±0.022)显著降低(P<0.05);颈动脉粥样硬化患者外周血EPCs体外血管生成能力较正常对照组显著减弱,并且小管的复杂程度也较对照组降低。结论:颈动脉粥样硬化患者外周血EPCs的黏附、迁移、增殖和成血管能力明显受损。EPCs的生物学功能或许可作为颈动脉粥样硬化患者血管病变发生发展的一个生物学标志。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限。 目的：尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源。 方法：采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定。 结果与结论：脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示：CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明：(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示：CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%。结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化。     

参麦注射液对人外周血内皮祖细胞部分生物学的影响

目的观察参麦注射液对体外培养外周血来源内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）数量及增殖、迁移、粘附功能的影响。方法密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞，FITC-荆豆凝集素I（FITC-UEA-1）、DiL-乙酰化低密度脂蛋白（DiL-acLDL）荧光双染鉴定；单个核细胞培养4d后进行实验分组，分为对照组和参麦注射液治疗组，参麦注射液治疗组加入不同浓度参麦注射液（分别为0．01、0．1、0．15、0．3mg／L）培养48h，然后分别采用四氮唑溴盐比色法（MTT）、改良的Boyden小室和粘附能力测定来观察EPCs的增殖、迁移和粘附能力。结果不同浓度的参麦注射液对EPCs有不同作用，0．1、0．15mg／L主要表现为使EPCs功能增强，0．3mg／L时贴壁细胞数量减少及增殖、迁移、粘附功能减弱，0．01mg／L与未加药组比较无统计学意义。结论参麦注射液可影响培养EPCs的数量及其部分生物学功能。     

外周血内皮祖细胞数目和阿尔茨海默病关系研究

目的 研究AD患者外周血内皮祖细胞(EPCs)数目及脑血流速度、血小板计数等临床资料与认知功能的关系.方法 选择自2008年至2009年于天津医科大学总医院老年神经科就诊的患者78例,按照疾病种类分成3组:AD组(23例),血管性痴呆(VaD)组(25例),认知功能正常组(30例).采集患者一般临床资料,TCD检查评价大脑中动脉血流速度,颈动脉彩色TCD检查颈动脉内膜中层厚度(IMT),流式细胞仪检测外周血EPCs数目,简易精神状态量表(MMSE)评分测定认知功能.结果 3组患者间性别、年龄、体重指数、血压、血脂、血小板计数、IMT差异均无统计学意义(P＞0.05).AD、VaD组患者外周血中EPCs数目、MMSE评分、脑血流速度均较认知功能正常组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).排除常见危险因素的影响后,外周血EPCs数目与MMSE评分呈正相关(r=0.541,P=0.000).多元线性回归分析提示,AD组患者MMSE评分、体重指数,舒张压、血小板计数与外周血EPCs数目有关(P＜0.05).结论 AD患者外周血EPCs数目明显减少,其导致的脑血管修复能力下降、脑灌注不良可能与AD患者的认知功能障碍有关.

Abstract：

Objective To study such clinical characteristics as number of circulating endothelial progenitor cells (EPCs), cerebral blood flow velocity (CAFV) and platelet count in patients with Alzheimer' s disease (AD). Methods A total of 78 patients were recruited from the outpatient and inpatient departments of our hospital. Patients with AD (n=23), patients with vascular dementia (VaD,n=25) and healthy elderly controls with normal cognition (n=30) were enrolled after matching for clinical data, carotid intima-media thickness (IMT) and Mini Mental State Examination (MMSE). The CAFV was examined with transcranial Doppler (TCD). Peripheral blood EPCs were counted by flow cytometry.Results No statistical significant differences were noted between patients with AD and VaD, and controls on gender, age, body mass index, blood pressure, total cholesterol, triglycerides, platelet and IMT (P＞0.05). Compared with those in control group, the number of circulating EPCs and scores of MMSE and CAFV in patients with AD and VaD were significantly decreased (P＜0.05). After the adjustment of traditional risk factors, thc number of circulating EPCs had a positive correlation with the scores of MMSE (r=0.541, P=0.000). Liner regression analyses showed that body mass index, diastolic pressure,platelet and scores of MMSE were positively correlated to the circulating EPCs number in patients with AD (P＜0.05). Conclusion The reduction of number of circulating EPCs, decreasing the repair capability of cerebrovasculars and inducing poor cerebral perfusion, plays important roles in the cognitive dysfunction of patients with AD.     

丁苯酞对急性缺血性卒中患者外周血内皮祖细胞的影响

目的 观察丁苯酞(NBP)治疗对急性缺血性卒中患者外周血内皮祖细胞(EPCs)水平及美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的影响;探讨其疗效及潜在机制.方法 筛选首次发病48 h内入院的急性缺血性卒中患者96例,按随机数字表分为NBP治疗组(NBP组)及安慰剂组.NBP治疗30 d为1个疗程.流式细胞仪检测CD34 +/CD133 +/KDR+标记细胞作为EPCs标志.分别检测入院当天(基线期)、治疗第7天、第14天和第30天外周血EPCs水平;并分别于上述时间点及病程90 d时进行NIHSS评分.结果 NBP组第7天、第14天、第30天时EPCs数量较基线期显著增加(均为P＜0.05);且明显高于同期安慰剂组(分别为P＜0.05、P＜0.001、P＜0.001).NBP组第7天NIHSS评分较基线期无明显改善(P ＞0.05);NBP组第14天、第30天NIHSS评分均明显低于基线期(均为P＜0.05)及同期安慰剂组(P ＜0.05、P＜0.001).NBP组第90天NIHSS评分较第30天有进一步降低(P＜0.05).发病后3个月内NBP组缺血事件稍低于安慰剂组(P＞0.05).两组随访期内均无严重不良事件发生.结论 NBP治疗可显著改善急性缺血性卒中神经功能评分,可能通过提高外周血EPCs水平,改善预后,且安全性良好.     

Human peripheral blood endothelial progenitor cells synthesize and express functionally active tissue factor

Introduction

Endothelial progenitor cells are circulating cells able to home to sites of vascular damage and to contribute to the revascularization of ischemic areas.We evaluated whether endothelial progenitor cells synthesize tissue factor, a procoagulant protein also involved in angiogenesis.

Materials and Methods

Endothelial progenitor cells were obtained from the peripheral blood mononuclear fraction of normal donors and cultured in endothelial medium supplemented with specific growth factors. The procoagulant activity expressed by cells disrupted by freeze-thaw cycles was assessed by a one stage clotting assay. Tissue factor mRNA expression was evaluated by RT-PCR.

Results

Endothelial progenitor cells do not express procoagulant activity in baseline conditions. However, lipopolysaccharide induces the expression of procoagulant activity. The effect is dose-dependent and reaches statistical significance at 100 ng/mL lipopolysaccharide. Inhibition with an anti-tissue factor antibody and amplification of cDNA with primers based on the tissue factor sequence confirm the identity of this activity with tissue factor. The kinetics of tissue factor expression by endothelial progenitor cells is identical to that of human umbilical vein endothelial cells showing maximal activity within 4 hours, and then decreasing; in contrast, tissue factor expression by mononuclear cells lasts for longer times. Both 5,6-dichloro-beta D-ribofuranosyl-benzimidazole and cycloheximide prevented the expression of procoagulant activity. Stimulation of endothelial progenitor cells with tumor necrosis factor-α did not elicit any detectable procoagulant activity.

Conclusions

Endothelial progenitor cells can be stimulated by lipopolysaccharide to synthesize tissue factor. This protein might be involved in thrombotic phenomena and might contribute to endothelial progenitor cells related neovascularization.     

他汀类药物对内皮祖细胞的相关作用

背景：他汀类药物作为临床上广泛应用的降脂类药物,其不同剂量与疗程对于内皮祖细胞有着不同的近期及远期作用。 目的：综述国内外他汀类药物对内皮祖细胞作用的现状和进展。 方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1995-01/2009-11关于内皮祖细胞和他汀类药物的文章,在标题中以“内皮祖细胞,他汀类药物”或“endothelial progenitor cells,statins”为检索词进行检索。选择文章内容与内皮祖细胞及他汀类药物有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到843篇文献,根据纳入标准选择关于内皮祖细胞及他汀类药物的19篇文献进行综述。 结果与结论：他汀类药物对于内皮祖细胞有多重的作用。在短期治疗和低剂量的情况下,对心血管疾病有保护作用,增强内皮祖细胞各方面功能;在长期、大剂量应用他汀类药物后,造成其数量减少,抑制了血管生成,这对于抑制肿瘤血管发生有一定的研究价值。     

人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化的实验研究

目的探讨人外周血内皮祖细胞和单个核细胞分离培养、诱导向内皮祖细胞分化的方法与鉴定。方法采取人外周血抗凝,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血中的内皮祖细胞和单个核细胞,于体外以细胞因子诱导单个核细胞向内皮祖细胞分化,用免疫荧光法和流式细胞仪分离鉴定单个核细胞向内皮祖细胞分化的细胞特异性标志。结果外周血内皮祖细胞和单个核细胞共同培养3d大部分贴壁密集生长,培养6d梭形细胞增多,培养12d收获细胞进行鉴定。Dil标记乙酰化低密度脂蛋白摄取率为(70.00±11.21)%,AC133,CD31,CD34,血管内皮生长因子受体鄄2和血管性假血友病因子免疫荧光染色阳性。流式细胞仪分类计数,AC133、CD31、CD34和血管内皮生长因子受体鄄2阳性细胞分别为95.80%、87.60%、1.27%和96.40%。结论外周血循环中的内皮祖细胞和单个核细胞共同培养,诱导后者分化的内皮祖细胞具有祖细胞特性且诱导分化率高。     

外周血内皮祖细胞数量变化与颅内动脉瘤的生成

背景：动脉内膜损伤是动脉瘤发生的始动因素,内皮祖细胞能修复受损的动脉内膜。 目的：建立大鼠颅内动脉瘤模型,探讨动脉瘤大鼠内皮祖细胞数量变化及意义。 方法：40只SD大鼠随机分为两组,正常组作为正常对照,不给予任何干预。模型组大鼠手术结扎双侧肾动脉后支以及左侧颈总动脉,术后喂食含8%氯化钠鼠粮。于2周,1,2,3个月末测量大鼠内皮祖细胞变化,并与3个月末测量各组大鼠血压及动脉瘤大小,RT-PCR检测willis环相关基因表达。 结果与结论：模型组大鼠内皮祖细胞数目于2周后就开始下降,与正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05),一直持续到3个月末(P < 0.01)。模型组大鼠动脉瘤壁基质金属蛋白酶9表达明显高于正常组正常大鼠(P < 0.01),而内皮型一氧化氮合酶明显低于正常(P < 0.05)。结果提示循环内皮祖细胞数量降低可能是动脉瘤生成的一个重要因素。     

远志皂苷元促进人神经前体细胞系的体外增殖

Senegenin,an effective component of Polygala tenuifolia root extract,promotes proliferation and differentiation of neural progenitor cells in the hippocampus.However,the effects of senegenin on mesencephalon-derived neural progenitor cells remain poorly understood.Cells from a ventral mesencephalon neural progenitor cell line(ReNcell VM) were utilized as models for pharmaceutical screening.The effects of various senegenin concentrations on cell proliferation were analyzed,demonstrating that high senegenin concentrations(5,10,50,and 100 μmo/L),particularly 50 μmol/L,significantly promoted proliferation of ReNcell VM cells.In the mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway,senegenin significantly increased phosphorylation levels of extracellular signal-regulated kinases.Moreover,cell proliferation was suppressed by extracellular signal-regulated kinase inhibitors.Results suggested that senegenin contributed to in vitro proliferation of human neural progenitor cells by upregulating phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase.