低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化*

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。 目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O2)或低氧(体积分数3%O2)环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1 µg/L胶质源性神经营养因子。 结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

抗坏血酸联合胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的 研究抗坏血酸(AA)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.方法 从新生24h内的sD大鼠脑组织分离和培养神经干细胞,进行神经干细胞鉴定.第二代神经干细胞诱导培养基中分别给予AA或(和)GDNF,10d后终止诱导,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测.结果 各诱导组均检测到TH mRNA的表达;与对照组比较,AA及GDNF均能增加NSC向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05);与单独运用100μmol/LAA或10ng/mlGDNF组比较,联合诱导组可明显提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05).结论 AA和GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,两者联合诱导后分化作用得到进一步加强.     

胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景：在神经干细胞移植治疗帕金森病中,移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题,而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在。 目的: 探讨胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法:分离妊娠12 d小鼠胚胎腹侧中脑,经胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,离心过滤后机械方法传代培养5~7 d的神经球,分组进行诱导分化10~12 d,待80%细胞从神经球迁移出来,分化为单细胞时,进行免疫细胞化学鉴定及流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率。 结果与结论：神经球细胞表达巢蛋白抗原,能分化为神经元特异性烯醇化酶和胶原纤维酸性蛋白阳性细胞。胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β在体外能明显提高中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例,胶质源性神经营养因子诱导组、白细胞介素1β诱导组和两者联合应用均较空白对照组比例高,尤其是两者联合应用作用更显著,说明胶质源性神经营养因子、白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

胶质细胞源性神经营养因子对中脑多巴胺能神经元生物活性观察

胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)是一种新型强效多巴胺 (ＤＡ)能神经元营养因子 ,本实验用大鼠中脑原代培养细胞观察ＧＤＮＦ对ＤＡ能神经元的营养、保护和损伤修复作用 ,为其应用于帕金森病 (ＰＤ)治疗提供依据。材料和方法 :取Ｅ14ｄ大鼠胚胎中脑组织 ,制成细胞悬液 ,按每孔 1× 10 5接种于涂有Ｐｏｌｙ Ｌｙｓｉｎｅ的 48孔培养板。在细胞接种后不同时间添加重组人ＧＤＮＦ或甲基 苯基 吡啶离子 (ＭＰＰ )、6 羟基多巴胺 (6 ＯＨＤＡ)进行处理 ,通过酪氨酸羟化酶 (ＴＨ)免疫荧光染色观察ＴＨ阳性 (ＴＨ )细胞形态并计数每孔所…     

胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞与共培养多巴胺能神经元的存活

背景：目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。 目的：观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。 材料：3周龄Wistar大鼠、孕14 d Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。 方法：采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒。取孕14 d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1×109 vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1 h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平。设立3组：Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24 h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7 d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响。 结果：脂肪间质干细胞在pAd-GDNF转染24 h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72 h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P < 0.01)。对共培养7 d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488 nm和563 nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件。 结论：胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用。     

小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子保护多巴胺能神经元的实验☆

背景：目前尚未见骨髓间充质干细胞对活化的小胶质细胞特异性反应的报道,且有关骨髓间充质干细胞在特定微环境下如何维持多巴胺能神经元的存活也缺乏相应的实验证据。目的：观察骨髓间充质干细胞在活化的小胶质细胞刺激下保护多巴胺能神经元存活的作用。方法：取Wistar大鼠,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,体外培养并活化小胶质细胞,酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。实验分为5组：骨髓间充质干细胞组;小胶质细胞组;脂多糖+小胶质细胞组;骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组;分别取各实验组的培养上清,对中脑多巴胺神经元进行培养。单纯多巴胺能神经元组采用体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12进行培养。采用免疫荧光技术检测不同微环境对多巴胺能神经元存活的影响及不同微环境对骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子的影响。结果与结论：含有骨髓间充质干细胞的实验组胶质细胞源性神经营养因子的释放量均较相应的对照组高。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,单纯多巴胺能神经元组神经元的存活率为15%;小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为10%;骨髓间充质干细胞组多巴胺能神经元的存活率为35%;脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为5%;而骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率达到了28%,高于除骨髓间充质干细胞组外的其他各组(P < 0.05)。此外体外培养多巴胺能神经元存活率随培养时间延长下降,但含有骨髓间充质干细胞实验组的多巴胺能神经元存活率明显高于相应对照组。提示小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞上调胶质细胞源性神经营养因子表达,使得多巴胺能神经元免受毒素的损害,抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡。     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键。 目的：以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成。 材料：清洁级新生2 d龄KM小鼠15只,孕16 d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供。 方法：采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5 d的星形胶质细胞条件培养液,-20 ℃冻存待用。体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108 L-1密度接种,设立2组：对照组单纯加入含体积分数0.1为胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率。 结果：培养的神经球细胞表达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。诱导分化7 d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平。实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组（t=35.296,P < 0.01）。 结论：在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化。     

胶质细胞源性神经营养因子诱导骨髓基质细胞向多巴胺能神经元分化的观察

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在体外能否诱导骨髓基质细胞（BMSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化及可能机制。方法无菌条件下，抽取成年SD大鼠胫骨内骨髓组织，分离制备成单细胞悬液进行培养。将增殖传代至第5代的BMSCs随机分为GDNF诱导组和对照组。继续培养7d后，应用BrdU／GFAP、BrdU/NeuN和TH免疫荧光单标和双标技术检测BMSCs增殖和分化情况。结果两组BMSCs继续培养7d后，增殖仍然活跃，有部分细胞向神经元和胶质样细胞分化，呈Brdu，GFAP、BrdU/NeuN和TH阳性表达，但GDNF组的增殖力更强，向神经元和TH神经元分化的数量明显多于对照组（P〈0．05）。结论GDNF能促进BMSCs的增殖和诱导BMSCs分化成神经元和胶质样细胞，其中少部分可分化为TH神经元（即DA能神经元）。     

脑源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的影响

目的观察脑源性神经营养因子对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠模型黑质多巴胺能神经元的影响。方法选用Wistar种系大白鼠30只,体质量230~250g,随机分3组,通过左侧中脑黑质立体定向注射法,组1为生理盐水对照组(简称对照组)10只,注射相应量(5μL)的生理盐水;组2为注射6-OHDA制作帕金森病模型组(简称6-OHDA组)10只,注射6-OHDA,5μL(2μg/μL);组3为(6-OHDA+BDNF)组,在制成帕金森病模型后再向同侧中脑黑质注射BDNF 5μL(3μg/5μL),连续6d,1次/d。分别观察动物的旋转行为,免疫组化染色方法观察黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元的数量,高效液相法测定纹状体部多巴胺(dopamine,DA)含量的变化。结果单侧黑质内注入6-OHDA制成帕金森病大鼠模型后,6-OHDA组与对照组比较,产生旋转行为,(6-OHDA+BDNF)组在观察旋转行为时,症状明显改善;镜下见TH阳性神经元主要见于对照组的黑质致密部,数量为(42.3±7.56)个/μm2,模型组黑质致密部TH阳性神经元数明显减少为(2.41±1.07)个/μm2,(6-OHDA+BDNF)组黑质致密部TH阳性神经元数为(15.36+3.04)个/μm2;纹状体部多巴胺含量:生理盐水组为(11.4±1.2)μg/g,6-OHDA组(3.6±0.5)μg/g,(6-OHDA+BDNF)组(5.5±0.6)μg/g。结论 BDNF能改善6-OHDA所致的帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元数目的减少;明显抑制6-OHDA引起的纹状体部多巴胺含量降低;并可抑制6-OHDA对黑质多巴胺能神经元的毒性作用。     

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景：近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用。目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道。 目的：观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记。诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶。与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性。提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能。在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞。     

Cerebral dopamine neurotrophic factor promotes the proliferation and differentiation of neural stem cells in hypoxic environments

Previous research found that cerebral dopamine neurotrophic factor(CDNF) has a protective effect on brain dopaminergic neurons, and CDNF is regarded as a promising therapeutic agent for neurodegenerative diseases. However, the effects of CDNF on the proliferation, differentiation, and apoptosis of neural stem cells(NSCs), which are very sensitive to hypoxic environments, remain unknown. In this study, NSCs were extracted from the hippocampi of fetal rats and cultured with different concentrations of CDNF. The results showed that 200 nM CDNF was the optimal concentration for significantly increasing the viability of NSCs under non-hypoxic environmental conditions. Then, the cells were cultured with 200 nM CDNF under the hypoxic conditions of 90% N_2, 5% CO_2, and 5% air for 6 hours. The results showed that CDNF significantly improved the viability of hypoxic NSCs and reduced apoptosis among hypoxic NSCs. The detection of markers showed that CDNF increased the differentiation of hypoxic NSCs into neurons and astrocytes. CDNF also reduced the expression level of Lin28 protein and increased the expression of Let-7 mRNA in NSCs, under hypoxic conditions. In conclusion, we determined that CDNF was able to reverse the adverse proliferation, differentiation, and apoptosis effects that normally affect NSCs in a hypoxic environment. Furthermore, the Lin28/Let-7 pathway may be involved in this regulated function of CDNF. The present study was approved by the Laboratory Animal Centre of Southeast University, China(approval No. 20180924006) on September 24, 2018.     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响*★

目的：获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础，实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响。 方法：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料：清洁级雄性成年SD大鼠3只，由中国医科大学实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织，胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞，传至第4代克隆球直径约为200 μm时，滴加DMEM/F12 + 2% B27 + 20 μg/L表皮生长因子+ 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 + 条件培养液（细胞原代培养第7天的上清液的过滤液），进行单细胞克隆培养，传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子+脑源性神经生长因子组。空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12，其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周，表皮生长因子浓度为20 μg/L，脑源性神经生长因子浓度为50 μg/L。③实验评估：传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定。计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率，检测神经干细胞向神经元的分化情况。 结果：①单细胞克隆培养后，克隆球细胞表达巢蛋白，诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较，表皮生长因子组有所降低；脑源性神经生长因子组、表皮生长因子+脑源性神经生长因子组均明显提高（t=2.309~2.779，P < 0.05），且后者提高幅度尤为显著（t=2.309，P < 0.05）。 结论：表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例。     

Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究

目的探讨联合过表达核受体相关因子1(Nurr1)基因的小胶质细胞(MG)和神经干细胞(NSC)共培养对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。方法原代培养SD大鼠神经干细胞和小胶质细胞,并过表达Nurr1基因。CCK-8法检测Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率的影响。Transwell系统共培养神经干细胞和小胶质细胞,实验分为NSC组、NSC+MG组和N(NSC+MG)组。ELISA检测共培养后第3天、第6天和第9天各组脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性神经营养因子(PDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达变化;RT-PCR和Western Blot检测各组第9天酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)DAT和Nurr1的表达变化;细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化,并对TH和DAT阳性细胞计数,计算各组神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。结果原代培养小胶质细胞以及神经干细胞并成功过表达Nurr1基因。CCK-8法检测结果表明,Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率无明显影响。ELISA检测结果表明,N(NSC+MG)组在不同时间点神经营养因子(BDNF、PDNF和GDNF)表达量明显高于其他各组(P0.05)。RT-PCR和Westen Blot检测结果表明,N(NSC+MG)组TH、DAT和Nurr1的表达水平明显高于其他各组(P0.05)。细胞免疫荧光鉴定结果表明,N(NSC+MG)组TH阳性细胞率明显高于其他各组(P0.05)。结论Nurr1基因可促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞共培养可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化。     

外源性Ang Ⅱ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的在体外成功分离培养并扩增神经干细胞（NSCs）的基础上,研究外源性血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对NSCs向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法（1）分离培养新生1d SD大鼠脑组织NSCs,免疫细胞学方法测定NSCs特异性标志物神经上皮干细胞蛋白（Nestin）表达及其分化为神经元、神经胶质细胞的能力;（2）按培养液中Ang Ⅱ的浓度不同,分5个浓度（100、200、400、600、800nmol/L）对第二代NSCs进行诱导分化。10d后采用免疫细胞学方法检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶（TH）和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,半定量RT-PCR（SQ-PCR）测定分化细胞中TH mRNA的相对表达量。结果外源性Ang Ⅱ诱导提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率,TH mRNA相对表达量亦增加,以Ang Ⅱ浓度为400nmol/L及600nmol/L的诱导效果最明显,TH阳性细胞率分别为10.77%和11.34%,TH mRNA相对表达量分别为（0.4023±0.0515）和（0.3971±0.0319）,两组间比较无统计学意义（P〉0.05）;其中400nmol/L Ang Ⅱ组分化细胞中GFAP阳性细胞率高于对照组,有统计学意义（P〈0.05）。结论外源性AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化,在400～600nmol/L浓度范围内AngⅡ的诱导效能更显著;AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化的机制可能与同时促进星型胶质细胞（AS）分化有关。     

Differentiation of embryonic versus adult rat neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro*☆

BACKGROUND：It has been reported that the conversion of neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro can be increased through specific cytokine combinations. Such neural stem cell-derived dopaminergic neurons could be used for the treatment of Parkinson’s disease. However, little is known about the differences in dopaminergic differentiation between neural stem cells derived from adult and embryonic rats. OBJECTIVE： To study the ability of rat adult and embryonic-derived neural stem cells to differentiate into dopaminergic neurons in vitro. DESIGN： Randomized grouping design. SETTING： Department of Neurosurgery in the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. MATERIALS： This experiment was performed at the Surgical Laboratory in the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University （Guangzhou, Guangdong, China） from June to December 2007. Eight, adult, male, Sprague Dawley rats and eight, pregnant, Sprague Dawley rats （embryonic day 14 or 15） were provided by the Experimental Animal Center of Sun Yat-sen University. METHODS： Neural stem cells derived from adult and embryonic rats were respectively cultivated in serum-free culture medium containing epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor. After passaging, neural stem cells were differentiated in medium containing interleukin-1α, interleukin-11, human leukemia inhibition factor, and glial cell line-derived neurotrophic factor. Six days later, cells were analyzed by immunocytochemistry and flow cytometry. MAIN OUTCOME MEASURES： Alterations in cellular morphology after differentiation of neural stem cells derived from adult and embryonic rats; and percentage of tyrosine hydroxylase-positive neurons in the differentiated cells. RESULTS： Neural stem cells derived from adult and embryonic rats were cultivated in differentiation medium. Six days later, differentiated cells were immunoreactive for tyrosine hydroxylase. The percentage of tyrosine hydroxylase positive neurons was （5.6 ± 2.8）% and （17.8     

Differentiation of embryonic versus adult rat neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro

BACKGROUND:It has been reported that the conversion of neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro can be increased through specific cytokine combinations. Such neural stem cell-derived dopaminergic neurons could be used for the treatment of Parkinson’s disease. However, little is known about the differences in dopaminergic differentiation between neural stem cells derived from adult and embryonic rats. OBJECTIVE: To study the ability of rat adult and embryonic-derived neural stem cells to differen...     

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景：神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞，培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元，从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。 目的：以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂，观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级孕14~17 d的SD大鼠10只，诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品，胎牛血清为杭州四季青产品。 方法：孕鼠处死后取出胚胎，剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞，锥虫蓝染色计数，调整细胞密度为2×106，添加B27及碱性成纤维细胞生长因子，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养，待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组，诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清+20 μg/L脑源性神经营养因子共培养，血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。 主要观察指标：在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5 d后，行神经元免疫组化鉴定，流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3 d的两组细胞，RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。 结果：原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球，形态规则，立体感强；悬浮生长的克隆球经诱导分化后，逐渐失去其球状的立体外观，邻近克隆球发出的突起可相互连接，3 d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达，诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较，诱导组神经元阳性细胞率显著升高（χ2=16.0，P < 0.05）。与未分化的神经干细胞比较，诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高，且前者升高幅度明显强于后者（F=21.7，P < 0.05）。 结论：脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化，可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景：调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供。 方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 µm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养。传代的神经干细胞分成4组：空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 µg/L脑源性神经营养因子、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 µg/L脑源性神经营养因子,培养1周。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例。 结果：单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t =3.409~7.558,P < 0.05),且联合组升高幅度尤为显著。 结论：适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用。