不同基因型丙型肝炎病毒RNA定量分析

目的　根据定量 PCR检测结果 ,了解血清不同基因型 HCV- RNA的含量 .方法　采用荧光定量 PCR和逆转录巢式定性 PCR同时检测 16 6例丙肝患者的血清 HCV- RNA,再进行酶切分型 .计算各型 HCV- RNA平均含量 .结果　定量 PCR阳性血清 (131例 ) HCV- RNA含量在 1× 10 4 .0 4～ 1×10 8.1 1拷贝· m L- 1 .HCV- 型 (10 6例 )、HCV- 型 (18例 )和 / 混合型 (3例 ) RNA平均滴度分别为 1× 10 6 .88± 2 .0 1拷贝· m L- 1 ,1× 10 5.79± 1 .82 拷贝· m L- 1 和 10 5.50± 1 .6 2 拷贝· m L- 1 .结论　定性和定量检测结果有很好的一致性 .HCV- 型病毒含量显著高于 HCV- 型 .     

散发性戊型肝炎临床特征和病毒血症的研究

目的 研究散发性戊型肝炎(hepatitis E,HE)的流行病学特点、临床特征,探讨戊型肝炎病毒血症特点.方法 对253例戊型肝炎患者进行回顾性分析,根据年龄、感染情况,将其分为老年组和非老年组、单纯感染组和重叠感染组;应用逆转录套式PCR法对38例单纯戊型肝炎的血清标本进行戊型肝炎病毒RNA(HEV RNA)检测,...     

戊型肝炎多重诊断模式的研究

目的探索一种基于ELISA和核酸定性检测技术的戊型肝炎多重诊断模式。方法对261份血清标本采用ELISA技术检测血清戊型肝炎病毒IgM抗体,采用巢式PCR技术对血清中戊型肝炎病毒核酸定性检测。结果 2份血清标本IgM抗体检测呈弱阳性和核酸检测均呈阳性,阳性率为1.0%。结论戊型肝炎病毒IgM抗体和核酸检测相结合的方法有助于戊型肝炎早期诊断和传染风险性评估。     

实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义

目的对实时荧光定量PCR测定的472例HBV-DNA结果进行分析,以探讨其临床价值。方法对472份临床血清标本用ELISA法进行定性检测,并依据乙肝两对半定性结果进行归类分组,再用实时荧光PCR定量检测。结果92份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有89份HBV-DNA为阳性,阳性率为96.7%,其PCR定量拷贝数为(3.23±1.45)×107/ml;168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有118份HBV-DNA阳性,阳性率达到70.2%,PCR定量拷贝数为(4.65±2.10)×105/ml;32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有11份HBV-DNA为阳性,阳性率为34.4%,PCR定量拷贝数为(1.92±1.54)×104/ml;62份HBsAb(+)的标本HBV-DNA阳性2例,阳性率为3.2%,PCR定量拷贝数为(5.45±1.14)×103;60份全阴性的标本HBV-DNA阳性1例,阳性率为1.7%,PCR定量拷贝数为(2.36±1.12)×104/ml。结论PCR定量测定HBV-DNA可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效观察。     

荧光定量PCR在乙肝检测中的应用

目的 :探讨 5‘ -核酸酶法荧光定量技术在乙肝检测中应用状况。方法 :采用荧光定量PCR方法 ,检测2 0份阳性对照考核批内及批间变异 ;采用 5 0份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+)的血清 ,结合肝功能及HBeAg滴度考核阳性率、病毒含量范围以反映病毒复制状况 ;对 5份本法检测阳性的标本 ,4℃保存 ,并隔日检测 ,确定最佳检测时间。结果 :批内CV为 4 1 % ,批间CV为 4 0 %。阳性标本为 4 6份 (92 % ) ,其中 4份肝功能正常 ;阴性标本为 4份 (8% ) ,其中 1份肝功能异常。病毒量有较大的变化范围 ,从 0 .1 1× 1 0 4～ 5 .1× 1 0 4CID/ml。阳性标本所测病毒量与HBeAg滴度相关系数为 0 .77。在 1 5d内隔日所测病毒量相近。结论 :本法应用于乙肝检测 ,有较好的特异性 ;定量结果能够反映病毒在体内的复制状况 ;病毒含量因患者而异 ;在严格操作条件下 ,本法有一定的重复性 ;正确保存标本时 ,在半月内均可以检测病毒     

四川省德阳地区散发性戊型肝炎临床特点及病毒基因型

目的了解四川省德阳地区戊型病毒性肝炎病毒基因型的分布情况及其临床特点。方法对154例急性戊型病毒性肝炎患者的血清生化学、抗HEV-IgM及HEV-IgG进行检测,并将患者血清进行RNA抽提和PCR扩增。对PCR扩增阳性的病例进行双向测序,应用Clustal X和MEGA软件对参考病毒株和样本病毒株的核苷酸序列进行比对并进行基因分型。结果 154例急性戊型肝炎患者中,男111例(72.1%),女43例(27.9%),男/女为2.58/1,平均年龄为(45.6±16.3)岁,20~59岁年龄段的患者的例数占总体的77.9%。92例住院患者中有49例为单纯戊型肝炎患者,其中2例(4.1%)发生急性肝衰竭并死亡;有42例戊型肝炎合并慢性HBV感染患者,其中11例(26.2%)患者发展为慢加急性肝衰竭,10例(23.8%)患者死亡,二者间肝衰竭的发生率及病死率的差异有统计学意义(P<0.05)。154例戊型肝炎患者的血清标本中检测出HEV RNA(+)34例(22.1%),其核苷酸序列间同源性为76.6%~98%。所检测的病毒株与基因Ⅳ型参考病毒株的同源性最高(76.6%~95.9%)。序列比对及基因分型结果表明该34例患者所感染的戊型肝炎病毒均为基因Ⅳ型。结论戊型肝炎合并慢性HBV感染者较单纯戊型肝炎患者更易重症化,本地区HEV基因型以Ⅳ型为主。     

血清中不同基因型丙型肝炎病毒RNA含量的测定

目的了解血清中不同基因型丙型肝炎病毒HCVRNA的含量。方法用实时荧光定量RTPCR和逆转录型特异性引物PCR同时检测21例费城酒精依赖丙肝患者的血清HCVRNA拷贝数并分析HCV基因型。结果21份血清标本中,有17份为HCVRNA阳性。这些阳性血清的HCVRNA含量波动范围在104.60～106.20拷贝/ml。检测到1a和1b两种HCV基因型,其中1a型7例,RNA平均滴度为105.28±0.75拷贝/ml,1b型(9例)RNA平均滴度为105.28±0.28拷贝/ml。结论定性和定量检测结果有极佳的一致性,酒精依赖丙肝基因型1a和1b血清中HCV含量无显著性差异。     

南海官兵所驻岛礁甲、乙、丙和戊型肝炎病毒调查研究

目的了解我国南海官兵所生活岛礁的甲、乙、丙和戊型肝炎病毒分布情况。评估感染风险度,制定预防措施。方法 (1)上礁前,采集158名将上岛守礁官兵血清样本,进行常规肝炎病毒检测。(2)无菌采集上述158名上岛礁3个月后官兵的血液样本和礁上物体表面生理盐水样本390份,共548份。收集后保存于-20℃冰柜中,立即随补给船送回实验室进行乙型肝炎病毒DNA和甲、丙、戊型肝炎病毒RNA检测。结果 (1)158名守礁官兵上礁前检出血清甲肝抗体(lgG)阳性5人(3.16%);乙肝病毒表面抗原、丙肝和戊型肝炎抗体检测均为阴性。(2)上礁3个月以后,158份血清样本检出甲肝抗体阳性7份(4.43%),其中lgG阳性5份,lgM阳性2份(甲肝RNA为阳性);乙肝DNA检测有2份阳性(1.27%)。丙肝和戊型肝炎病毒RNA均为阴性。390份礁上的物体表面样本:检出甲、丙、戊肝病毒RNA阳性分别为24份(6.15%)、3份(0.77%)、2份(0.51%);乙肝病毒DNA阳性5份(1.28%)。结论守礁官兵所驻岛礁生活环境中存在甲、乙、丙、戊肝传染源,卫生部门要提高认识,有效地控制传染源,培养官兵良好的生活习惯,切断传染途径,预防守礁官兵病毒性肝炎传播和流行,并制定相应的病毒性肝炎流行治疗预案,配备治疗药品。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙肝病毒DNA的临床意义

目的　研究荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)检测血清中乙型肝炎病毒 (HBV)DNA的临床意义。方法　用FQ -PCR诊断试剂盒 ,以完全闭管式的PCR和荧光探针技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法 ,检测了 489份临床血清标本。结果　 132例HBsAg、HBeAg、抗 -HBc均阳性的标本 ,HBVDNA也全部阳性 ,平均HBVDNA拷贝数为 2 .83× 10 8·ml-1。 85例HBsAg、抗 -HBe和抗 -HBc均阳性的标本 ,检出HBVDNA 6 1例 (72 % ) ,平均拷贝数 7.9× 10 5·ml-1;HBV血清标志物均阴性的 74例标本 ,HBVDNA也全阴。结论　FQ -PCR可以检测HBV的感染和复制情况     

广西首次在急性胃肠炎病例中检出GⅠ型诺如病毒

目的研究南宁市某医院门诊急性胃肠炎病例中GⅠ型诺如病毒的感染状况。方法应用荧光定量RT—PCR法对2007年1月-2008年12月南宁市某医院门诊腹泻病例标本进行GⅠ型诺如病毒RNA检测,并对GⅠ型阳性标本进行测序验证。结果在所检测的696份粪便悬液标本中,检出4份GⅠ型阳性,经核酸测序证实为GⅠ型诺如病毒。结论在广西的急性胃肠炎病例中存在GⅠ型诺如病毒感染。     

戊型肝炎病毒抗原基因片段及其组合表达质粒的构建

目的：选择及组合戊肝病毒（ＨＥＶ）抗原基因片段,进行表达与免疫学特性研究。方法：根据已公布的ＨＥＶ序列,选择三段优势抗原表位,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增基因片段,产物以单独或经甘氨酸连接肽串联组合的方式克隆到载体ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ中,经ＤＮＡ序列分析后,将构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行表达,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析初步考察其免疫学特性。结果：构建的六个重组质粒在大肠杆菌中获得了不同程度的表达,表达的目的蛋白具有与戊型肝炎患者阳性血清特异性结合的能力。结论：ＨＥＶ抗原片段及其组合在大肠杆菌中得到了高效表达,并为优良诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供了基础。     

温州3044例献血者戊型肝炎病毒血症及基因分型的研究

目的了解温州市无偿献血者戊型肝炎病毒血症及基因分型的情况。方法对2008年2～10月浙江省温州市中心血站的无偿献血者进行整群抽样,检测抗HEV IgG以及IgM抗体,并对抗HEV IgM阳性的标本进行RT-PCR检测,经测序后分析其基因型及序列同源性。结果3044例无偿献血者中,HEV IgG阳性率为33.28%（1013/3044）,IgM阳性率为0.92%（28/3044）。对28例HEV IgM阳性标本进行PCR检测共发现3例核酸阳性,核酸总体阳性率为0.1%,其中2例为基因Ⅳ型感染,1例为基因Ⅰ型感染。结论无偿献血者中存在一定比例的HEV病毒携带者,有必要对现有血液筛查策略下输血途径传播戊肝的风险进行评估。     

安庆市商品猪戊型肝炎病毒的分子流行病学调查

 目的 了解安徽省安庆市商品猪戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）的流行病学特征。方法 2009年3月26日、6月20日、9月15日和12月8日分别在安庆市安庆屠宰场收集商品猪胆汁100份,共400份,并按采样时间将400份商品猪胆汁标本分为A、B、C、D4组。用巢氏RT PCR方法对HEV ORF2区域内150-nt序列进行扩增,测序后参照GenBank下载的参考序列作系统进化分析。结果 400份猪胆汁中有22份（5.5%）检测出HEV RNA,其中A~D各组的HEV携带率分别为9.00%、6.00%、3.00%、4.00%,各组间的HEV携带率差异无统计学意义（χ²=4.04,ν=3,P=0.26）。系统进化分析结果显示,检测到的猪HEV病毒株均属于基因4型,与1、2、3和4型参考病毒株的核苷酸同源性分别为80.40%~95.78%、82.10%~95.72%、77.31%~96.76%和89.51%~96.71%。基因4型样本病毒株内部又归为a或d两个亚型,且以a型为主。结论 安庆市商品猪的HEV携带率较高,基因4a型为该地区商品猪HEV的主要基因型,未煮熟的猪肉制品存在着食用安全隐患。     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。     

一株急性散发性戊型肝炎病毒基因结构及核苷酸同源性分析

目的：分析一株长春地区散发戊型肝炎病毒（HEV）的基因结构和核苷酸同源性。方法：采用RT-nPCR方法检测HEV RNA，应用全自动测序仪进行序列测定。结果：所获得的HEV-CCC220全长7 193bp，编码2 397个氨基酸，由5′-UTR（nt 1-9）、3′-UTR（nt 7152-7193）和3个开放读码框架（ORF_s）组成。与HEV Ⅳ型核苷酸同源性明显高于HEVⅠ～Ⅲ型，全基因序列核苷酸同源性为83.2 %～85.0%；与ORF₂间300　nt和98　nt部分基因序列核苷酸同源性分别为85.0%～93.9%和80.6%～86.7%。结论：长春地区散发性HEV-CCC220属HEV Ⅳ型，ORF₂间300nt部分核苷酸序列可以代替全基因序列进行HEV基因型分析。     

Partial nucleotide sequencing of hepatitis E viruses detected in sera of patient s with hepatitis E from 14 cities in China

目的：调查从中国病人血清中分离的戊型肝炎美丽（HEV）基因型。方法：应用聚合酶链反应法（PCR）和直接测序法对从中国14个城市检测到的45株HEV开放读码框架2（ORF2）的部分基因序列（nt6461-6860及nt5994-6294）进行分析。结果：45株HEV中,41株（91％）与缅甸株属同一个基因型,与中国代表株HEV核苷酸序列的同源性均在98％以上。仅4株与3个HEV原型株差异较大,与缅甸株/中国株同源性为77％-80％,与墨西哥株的同源性为74％-76％,与新发现的美国株/猪（US/Swine）HEV的同源性为74％-77％;基因进化树分析表明,该4株HEV可能为一新基因型的2个不同亚型,它们与原型墨西哥株、缅甸株和美国株/猪HEV明显不同。结论：中国戊型肝炎患中,多数国原型株HEV,仅少数感染新基因型HEV。     

不同基因型戊型肝炎病毒重组蛋白的抗原性分析

目的：探讨不同基因型和亚型戊型戊型肝炎病毒（HEV）重组蛋白氨基酸序列的变化对HEV抗原性的影响。筛选出最佳的HEV抗原用于戊型肝炎的免疫诊断。方法：用已知序列的HEV基因工程表达蛋白作为包被抗原,对已知血清标本进行酶联免疫吸附试验测定。结果：6种不同抗原对30份正常献血者血清无抗原性,对17份急性戊型肝炎病人血清和5份实验感染动物血清均呈阳性反应,但血清抗体滴度的高低与所有抗原的基础型有关,尤其是受到该抗原第76位氨基酸变化的影响。结论：多基因型HEV抗原混合物是HEV免疫诊断的最佳抗原。     

戊型肝炎患者肝组织中HEV抗原的检测研究

目的：用抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单克隆抗体和抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单链可变区抗体研究急性戊型肝炎的免疫病理学,探讨二者在临床病理诊断中的应用价值。方法：（１）以杂交瘤技术制备的抗－ＨＥＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ,ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）作为第一抗体,用免疫组化ＬＳＡＢ法检测急性戊型肝炎患者肝组织中的ＨＥＶ抗原。（２）用抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单链可变区抗体以间接酶标法检测肝组织内的ＨＥＶ抗原。结果：用抗－ＨＥＶ单克隆抗体从１４例急性戊型肝炎肝标本中检出９例ＨＥＶ抗原阳性者（６４．２８％）,其中８例阳性标本用抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单链可变区抗体检测ＨＥＶＡｇ均为阳性。ＨＥＶ抗原在肝细胞浆表达以胞浆弥漫型为主,尚可见膜型表达。ＨＥＶ抗原阳性细胞集中分布有病变明显区,伴淋巴细胞浸润,病变较轻区也可见随机散在分布,部分     

江苏省某地区人源与猪源戊型肝炎病毒的检测和部分序列分析

目的:调查了解江苏省某农村地区人源与猪源戊型肝炎病毒(HEV)的相关性?方法:应用逆转录-巢式聚合酶链法(RT-PCR)对同一地区内一般人群中HEV IgM阳性者?急性戊型肝炎患者血标本和生猪胆囊标本进行HEV RNA检测,并对HEV RNA 阳性标本进行克隆测序和序列分析?结果: 一般人群中检出的HEV基因1?4型比例相近,临床散发性戊肝病例绝大部分为HEV-4型病毒感染所致(95.24%);生猪胆汁标本PCR阳性率为12.11%,猪源HEV基因分型均为HEV-4型;分离于人和生猪的HEV-4型病毒高度同源,同源性81%~97%?结论:该地区人群HEV基因分型以HEV-4型为优势毒株;猪源HEV均为基因4型;人源和猪源的HEV-4型病毒高度同源,猪是当地HEV主要宿主动物之一?     

戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖

目的 探索戊型肝炎病毒（HEV）敏感细胞及体外培养条件。为HEV体外研究提供基础。方法 用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化。超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞（包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞（非洲绿猴肾细胞Vero)。通过细胞病变观察,RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果 KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7-9d出现细胞病变,11-13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela,Vero细胞未见细胞病变,分别于2-4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论 在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感。本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。