环介导等温扩增技术检测粪便幽门螺杆菌方法的建立及应用

目的:建立一种快速、简单的检测粪便幽门螺杆菌的环介导等温扩增方法(loop-medi atedisotherma lamplification,LAMP)。方法:针对幽门螺杆菌的16SrRNA基因设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),优化反应条件后,对方法的敏感性、特异性进行评估,并评估检测粪便模拟标本的敏感性。结果:使用LAMP方法可以在2h内得到检测结果,加入染料后阳性结果为绿色,电泳后有明显的阶梯状条带。幽门螺杆菌的基因组DNA检测敏感性为12pg,是普通PCR的10倍,对模拟粪便标本进行检测,检测限为102CFU/mL。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌的检测结果均为阴性。结论:本研究建立的检测幽门螺杆菌的LAMP方法敏感性高、特异性强,操作简单,不需要特殊设备,是一种很有前景的检测方法。     

快速检测大肠埃希菌LAMP方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)反应快速检测大肠埃希菌的方法。方法 根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)上大肠埃希菌的lacZ(登录号:M74750)基因序列,设计4条特异引物(2条内引物,2条外引物),对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化,采用琼脂糖电泳及肉眼观察结果。结果 将提取的13株细菌DNA进行LAMP反应,仅大肠埃希菌得到阳性结果,LAMP检测下限为15cfu/mL。结论 LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

环介导等温扩增技术快速检测沙眼衣原体

目的建立一种新的简单、快速检测沙眼衣原体(CT)的环介导等温扩增(LAMP)技术。方法采用Primer Explorer V4软件,针对CT隐蔽性质粒基因保守区域设计4重引物(2重内游引物,2重外游引物),并对LAMP反应体系和反应条件进行优化,评价其敏感性和特异性,将其与实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对临床样本的检测结果进行比较。结果建立的LAMP技术特异性高,与其他常见菌株检测无交叉反应;敏感性高(100拷贝/μL)。用建立的LAMP技术与实时荧光定量PCR对90例临床样本进行检测,检测结果为阳性40例、阴性50例,二者符合率为100%。结论成功建立了检测CT隐蔽性质粒基因的LAMP技术,为CT的快速检测提供了新的手段。     

环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌

目的建立一种检测副溶血性弧菌（Vp）快速且特异的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法针对副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃保温约60min,完成对副溶血性弧菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green Ⅰ染色、电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株副溶血性弧菌和12株非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性;将副溶血性弧菌菌液作一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测,比较两者敏感性。结果1株副溶血性弧菌出现LAMP扩增反应：通过肉眼、SYBR Green Ⅰ染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,酶切证实了LAMP产物的特异性;12株非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增。LAMP检测tlh基因的特异性和敏感性与普通PCR相同,LAMP检测tlh基因的检测下限为15cfu／mL。结论建立了一种快速、敏感、特异的副溶血性弧菌检测方法,适合日常监测及快速检测的需要。     

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。     

环介导等温扩增快速检测生殖支原体的应用研究

目的建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测生殖支原体(Mg)的方法并探讨该方法在临床诊断中的应用价值。方法培养生殖支原体,提取病原体DNA,设计Mg pdhD基因LAMP引物,优化并建立LAMP检测Mg的方法。分析LAMP法检测Mg DNA的灵敏度,并与PCR法进行对比。分析LAMP法检测Mg DNA的特异性。结果 LAMP法可在1h内实现Mg DNA的可视化检测,检测限为10fg,灵敏度高于PCR法(0.1pg)。LAMP法检测20例经确诊的Mg感染临床样本,结果均为阳性,对淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及大肠埃希菌的检测结果均为阴性。结论 LAMP检测Mg快速、简便、灵敏度高且特异性强,检测不需任何设备,借助荧光笔肉眼直接判读,有望成为社区及基层医院广泛开展的新方法。     

鉴别29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌聚合酶链反应方法的建立及应用

目的建立鉴别29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌IctrA/I基因变异区序列,设计合成PCR引物,分别用于扩增29E群、X群和Z群等3个血清群脑膜炎奈瑟菌。并将该方法应用于41份疑似脑膜炎奈瑟菌菌株标本的检测。结果3对引物分别能够特异性PCR扩增29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌菌株的IctrA/I基因,扩增片段大小分别为667 bp、525 bp和667 bp,3个血清群之间以及与其他血清群脑膜炎奈瑟菌之间未出现交叉PCR扩增。41份疑似脑膜炎奈瑟菌菌株标本中,29E群和X群PCR阳性的标本分别有7份和2份,未检测出Z群菌株。结论本研究建立的PCR方法能准确、特异地鉴定29E群、X群和Z群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

人细小病毒B19的环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的建立一种简单、快速的核酸检测新方法,即环介导等温扩增方法(LAMP)来检测人细小病毒B19的核酸。方法从GenBank中获得B19病毒VP2基因序列,利用PrimerExplorer V3软件在序列保守区域设计LAMP引物,同时对试验中的几个重要参教进行优化,并评价其敏感性和特异性。结果LAMP检测方法的敏感性高于PCR方法,并且对B19病毒的检测具有特异性。结论建立了环介导等温扩增快速检测方法,此方法灵敏性高、特异性强,不仅适用于实验室检测,更能够广泛用于临床检测。     

环介导等温扩增技术便捷检测淋病奈瑟菌porA基因

目的设计一种特异度和灵敏度高的环介导等温扩增(LAMP)系统,用于淋病奈瑟菌便捷检测。方法选取淋病奈瑟菌porA基因特定序列,设计一套适合LAMP技术的引物。用LAMP技术和PCR同时检测2018年1月至2019年1月该院32例淋病性宫颈炎和88例非淋病性宫颈炎患者的宫颈拭子标本淋病奈瑟菌阳性检出率。所得数据配对设计,采用McNemar检验比较两种技术阳性检出率的差异,再分别用Fisher检验比较灵敏度和特异度差异。结果 LAMP技术的阳性检出率高于PCR技术,差异有统计学意义(P0.05);LAMP技术灵敏度(96.88%)高于PCR(78.13%),差异有统计学意义(P0.05);二者特异度均为100.00%。结论 LAMP技术可在水浴条件下,于50min内通过目测试剂颜色变化准确检出淋病奈瑟菌,有效提升女性淋病患者阳性诊断率,降低漏诊率。     

荧光环介导恒温扩增技术检测嗜肺军团菌方法的建立

目的探讨利用环介导恒温扩增技术(LAMP)建立可以准确快速检测嗜肺军团菌的方法。方法选取嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、副溶血性弧菌菌株,根据嗜肺军团菌毒力mip基因的6个特殊区域,使用Primer Explorer Version 4软件设计LAMP引物(mip-1、mip-2、mip-3),提取病原菌基因组DNA进行LAMP,评价其特异性、最低检测限和稳定性。结果筛选出mip-3引物在测定嗜肺军团菌的LAMP反应体系中扩增约10min出峰且峰值较高;非嗜肺军团菌菌株没有扩增反应;LAMP检测限可达100fg/μL;mip-3引物在10次重复检测中几乎同时出峰,稳定性良好。结论建立的LAMP检测方法具有特异性强、稳定性高特点,能快速、准确检测出嗜肺军团菌,具有较大的推广及应用前景。     

海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因,根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物;对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增,并做特异性比较;对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释,提取DNA后进行灵敏度的检测,并与常规PCR作比较;构建含vvhA基因片段的重组质粒,作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果,而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增,其他样品均为阴性,无假阳性和假阴性结果,表明引物的特异性较好,加入钙黄绿素和电泳结果相一致;针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10CFU,是常规PCR(每个反应4×10~2 CFU)的10倍,呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍,PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,特别适合用于现场和床旁的快速检测。     

基于 LAMP技术针对溶藻弧菌 gyrB基因快速检测方法的建立

目的　应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）建立针对溶藻弧菌gyrB 基因的 快速检测方法。方法　以溶藻弧菌标准株（ATCC-17749）和溶藻弧菌野生株（WT）为研究对象,通过在线生物学软件（http:// primerexplorer.jp/e/）设计针对溶藻弧菌gyrB 基因的LAMP 引物,利用恒温水浴进行等温扩增,优化反应条件,建立快 速检测方法。结果　①经2g/dl 凝胶电泳结果显示反应温度为61℃时扩增产物成像效果较60℃,62℃和63℃明显,为 适宜反应温度;②在61℃条件下反应60 min 和90 min 凝胶电泳成像效果差异不大,反应时间为60 min 能满足扩增需要; ③利用同一体系对临床6 种其它常见致病菌进行等温扩增时未出现阳性条带,提示整个体系特异度较好;④采用模板稀 释法验证该LAMP 体系检测的灵敏度为10-4mg/L。结论　建立了基于LAMP 技术针对溶藻弧菌gyrB 基因的快速检测方 法, 具有良好的特异度和敏感度,对快速检测溶藻弧菌有重要意义。     

环介导等温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的初步评价

目的评价环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术在结核分枝杆菌诊断中的应用价值。方法收集246份疑似肺结核患者的痰标本,分别进行涂片镜检,罗氏培养以及实时定量PCR和LAMP法检测。结果涂片镜检,罗氏培养实时定量PCR和LAMP法对结核分枝杆菌的检出率分别为30.89%,45.53%,54.47%,57.32%。以罗氏培养结果作为金标准,LAMP法诊断的敏感性为96.19%（101/105）,特异性为76.87%（103/134）,两种方法检测结果的一致性是Κ=0.71,两法具有很好的吻合性。以实时定量法为标准,LAMP法的敏感性为90.07%（127/141）,特异性为93.33%（98/105）,两法检测结果的一致性是κ=0.83,P〈0.001。结论 LAMP法检测结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,与罗氏培养和RT-PCR有着较高的吻合性,很适合作为临床检测项目开展。     

LA MP结合示差脉冲伏安法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立及临床应用

目的：利用环介导恒温扩增（LAMP）技术结合示差脉冲伏安（DPV）法,建立快速检测肺炎克雷伯菌的方法,并将其应用于小儿腹泻病原菌分析。方法通过基因比对与引物设计,建立针对肺炎克雷伯菌的LAMP 检测方法。采用LAMP 技术对肺炎克雷伯菌和其他8种干扰菌以及对不同浓度肺炎克雷伯菌进行扩增,结合DPV法评价其特异性及灵敏度。将200份腹泻患儿的粪便标本同时采用LAMP方法与培养法进行检验,对比2种方法检测肺炎克雷伯菌的阳性率。统计近2年该院门诊及住院小儿腹泻病例,初步分析其常见腹泻致病菌种类及比例。结果设计出针对肺炎克雷伯菌的LAMP 检测方法,该法只针对肺炎克雷伯菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性,LAMP法最低检测限为10 CFU/mL,显示出较高的灵敏度。200份腹泻患儿粪便标本,采用LAMP法与培养鉴定法检测的肺炎克雷伯菌阳性率差异无统计学意义（P＞0．05）。近2年内该院小儿腹泻粪便标本中共检出致病菌709株,主要病原菌分别为志贺菌（34．23％）、大肠杆菌（15．40％）、铜绿假单胞菌（12．96％）、弗劳地枸橼酸杆菌（7．82％）、沙门菌（6．36％）、白色念珠菌（6．11％）、肺炎克雷伯菌（4．40％）、产气荚膜梭菌（3．67％）、变形杆菌（3．42％）、其他菌（5．63％）。结论设计出了针对肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该法具有良好的特异性和较高的灵敏度,能够用于肺炎克雷伯菌的快速检验。     

快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的建立可用于粪便中艰难梭菌快速检测的环介导恒温扩增(LAMP)方法。方法针对艰难梭菌毒素A基因,设计引物。采用LAMP对艰难梭菌和其他腹泻干扰菌及不同浓度艰难梭菌的扩增检测,对其特异性和灵敏度进行评价。同时采用LAMP和荧光定量PCR对100例疑似艰难梭菌感染的临床腹泻患者粪便进行检测,对两种方法进行比较。结果 LAMP对艰难梭菌及6种腹泻干扰菌的检测,只针对艰难梭菌有扩增,显示了较好的特异性。LAMP最低检测限为10CFU/mL,灵敏度较高。对100例临床粪便标本LAMP检测结果与荧光定量PCR比较差异无统计学意义(P>0.05,χ2=0.1429)。结论本研究建立的粪便中艰难梭菌的LAMP快速检测方法特异性好、灵敏度较高、操作简便,适用于艰难梭菌的临床快速检测及现场检测。     

E.coli O157：H7 LAMP检测方法的建立

目的建立检测E.coli O157：H7环介导的等温扩增方法（LAMP）。方法选取E.coli O157：H7的rfbE基因设计LAMP引物,优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157：H7 LAMP体系具有良好的特异性,用该体系对9属13种41株菌进行检测,结果只有E.coli O157：H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带,非E.coli O157：H7均未产生扩增产物,灵敏性为2.7×101CFU/mL。样品及培养基对反应体系没有影响或影响很小。对76份样品进行了检测,E.coli O157：H7 LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%,2h内即可完成检测。结论本研究建立的E.coli O157：H7的LAMP法不但解决了分子生物学检测对实验室仪器设备的高要求问题,而且检测方法简便、快捷,非常便于基层实验室和现场检测使用。     

Development and clinical validation of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Neisseria meningitidis

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is an innovative technique that allows the rapid detection of target nucleic acid sequences under isothermal conditions without the need for complex instrumentation. The development, optimization, and clinical validation of a LAMP assay targeting the ctrA gene for the rapid detection of capsular Neisseria meningitidis were described. Highly specific detection of capsular N. meningitidis type strains and clinical isolates was demonstrated, with no cross-reactivity with other Neisseria spp. or with a comprehensive panel of other common human pathogens. The lower limit of detection was 6 ctrA gene copies detectable in 48 min, with positive reactions readily identifiable visually via a simple color change. Higher copy numbers could be detected in as little as 16 min. When applied to a total of 394 clinical specimens, the LAMP assay in comparison to a conventional TaqMan® based real-time polymerase chain reaction system demonstrated a sensitivity of 100% and a specificity of 98.9% with a κ coefficient of 0.942. The LAMP method represents a rapid, sensitive, and highly specific technique for the detection of N. meningitidis and has the potential to be used as a point-of-care molecular test and in resource-poor settings.     

LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血靶点表皮生长因子受体(EGFR)基因L858R位点突变的快速筛查方法。方法在Genebank上查找EGFR 21号外显子(L858R)的DNA序列,利用Primer Explorer V4软件设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并对其特异性和敏感性进行评价。采集11例临床病理诊断为NSCLC患者外周血血浆,以聚合酶链反应(PCR)扩增结果为标准,对建立的LAMP方法的准确性进行验证。结果采用自行设计的LAMP引物及构建的反应体系可特异性扩增EGFR L858R位点突变阳性DNA,检测敏感性为0.1%,特异性达到100%。LAMP法在11例EGFR L858R位点突变阳性的NSCLC患者血浆标本中检测到9例阳性。结论成功建立了LAMP检测人外周血浆EGFR基因突变方法,诊断敏感性、特异性和准确性均较高,可荧光目测判读检测结果,是一种简单、快速的EGFR基因突变筛查方法。