荧光定量PCR溶解曲线监测HIV感染者TCRα、β链CDR3谱系漂移技术的建立

目的建立荧光定量PCR(FQ-PCR)溶解曲线分析技术监测人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者外周血T细胞受体(TCR)α、β链CDR3谱系漂移。方法提取HIV感染者外周血单个核细胞中的总RNA,逆转录成cDNA,设计人32个TCRAV、26个TCRBV基因家族上、下游引物,FQ-PCR扩增HIV感染者TCRAV和TCRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的寡克隆增生,并与传统的CDR3检测技术基因扫描检测结果比较分析。结果 FQ-PCR溶解曲线分析技术与基因扫描检测结果一致,HIV感染者TCRα链和β链家族CDR3表达频率不一致,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但出现数量不等的寡克隆增生家族。结论 FQ-PCR溶解曲线法监测HIV感染者TCRα、β链CDR3谱系漂移技术操作简单,检测成本低,可以用来监测HIV感染者外周血T细胞TCRα、β链CDR3谱系漂移。     

从一例慢性嗜酸性粒细胞白血病发现克隆性增殖T淋巴细胞

利用TCRβV基因指纹图谱分析1例慢性嗜酸粒细胞白血病(CEL)患者的外周血T细胞克隆变化，了解与CEL疾病相关的T细胞受体(TCR)β可变区主要接触抗原的CDR3序列特征。用RT—PCR扩增CEL患者的外周血TCRβV1—24个家族的基因序列，在变性测序胶上电泳，形成TCRβV基因指纹图谱，切割克隆性增生的电泳条带进行测序分析。结果显示：TCRβV基因指纹图谱在βVl3．2家族中的分子量较小处出现一条明显扩增的条带，切割此条带并测序证实为单克隆性T细胞增殖，其CDR3的氨基酸序列为：SFSYEQY，其中SFSY基序为特异性保守序列，其它家族无异常改变。结论：该CEL患者TCRβVl3.2家族中出现了单克隆性增殖的T淋巴细胞群，可能是针对CEL恶性肿瘤细胞反应性增生的T细胞克隆。     

抗磷脂综合征识别相关抗原的T细胞克隆受体分析

为了了解识别抗磷脂综合征相关抗原的T细胞受体特征，用基因谱型图的方法分析一例抗磷脂综合征患者体内的T细胞特征。结果发现：优势T细胞呈寡克隆性增生；进一步分析2群主要T细胞克隆的T细胞受体（TCR）基因特征表明，其TCRβ链基因主要由TCRβV8和TCRβV23家族基因编码，T细胞接触抗原的TCRβVCDR3区氨基酸序列分别是：CASSLLVAGGPRAYNEQFFGPG和CASSLAGFGQPQHFGDG，其CDR3区模体YNEQFFGPG和QHFGDG与报道的特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮高度一致。结论：这些自身免疫病增殖的T细胞克隆可能识别同样的抗原。     

基因扫描分析B-CLL的TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性

利用RT-PCR扩增12例B-CLL外周血单个棱细胞的TCR Vβ基因24个亚家族的互补决定区3(CDR3)．以了解T细胞的表达情况。PCR产物进一步经基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果显示：12例BCLL共表达13个TCR Vβ亚家族T细胞，每例病人仅表达3—9个 Vβ亚家族，主要为Vβ3，Vβ6，Vβ7，Vβ17或Vβ19，9制病人的一个或两个Vβ3家族T细胞呈克隆性生长。提示B-CLL选择性地表达TCR vβT细胞。大部分B-CLL出现克隆性增殖T细胞，这可能是对白血痛细胞相关抗原的免疫反应。     

HBsAg、HBsAb双阳性HBV感染者TCR β链CDR3克隆型分析

目的分析HBsAg和HBsAb双阳性乙型肝炎患者与其他HBV感染者间T细胞受体(TCR)组库β链互补决定区3(CDR3)克隆型差异性。方法以11例HBsAg和HBsAb双阳性乙型肝炎患者为病例组,10例自然痊愈(HBsAb~+)者为对照组1,10例HBsAg阳性但HBsAb阴性乙型肝炎患者为对照组2。用Illumina HiseqX10测序仪对全血DNA的CDR3序列进行高通量测序,建立CDR3免疫组库,并进行CDR3克隆型及多样性分析。结果病例组任意两样本CDR3克隆型重叠率为6.28%(0.25%,13.10%);对照组1为10.49%(6.20%,17.30%);对照组2为2.60%(0.13%,13.69%),病例组与对照组1相比差异有统计学意义(P=0.008),对照组1与对照组2组相比差异有统计学意义(P=0.001),病例组与对照组2相比差异无统计学意义。经过病例组与2个对照组分别比较得到:克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1频率病例组高于对照组1(P=0.029),克隆型TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7频率病例组低于对照组1(P=0.031)。病例组与对照组1相比,V基因型TRBV5-8频率差异有统计学意义(P=0.047);病例组与对照组2之间,有14种克隆型频率差异有统计学意义,V基因型TRBV28频率差异有统计学意义(P=0.028)。3组样本的TCRβ链CDR3多样性差异无统计学意义(P0.05)。结论克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1和TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7,V基因型TRBV5-8可能与HBsAg和HBsAb双阳性相关,而TCRβ链CDR3多样性与HBsAg和HBsAb双阳性无明显关系。     

慢性粒细胞白血病患者外周血初始T细胞水平和T细胞受体Vβ谱系利用特点

目的了解慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血初始(naive)T细胞的水平和T细胞受体(TCR)Vβ基因谱系利用和克隆性,从而了解CML患者的胸腺近期输出功能和TCRVβ亚家族T细胞增殖情况。方法采用实时定量PCR(TaqMan)方法检测20例CML患者外周血单个核细胞中T细胞受体重排删除环(Tcellreceptorrearrangementexcisioncircles,TREC)的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3+细胞中TREC水平。利用逆转录PCR和基因扫描分析其中14例患者外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族基因表达和克隆性。9名正常人外周血作为对照。结果CML患者外周血TREC含量(0.06±0.16/1000CD3+细胞)明显低于正常人(6.84±4.71/1000CD3+细胞,P<0.01)。14例CML患者外周血T细胞表达不同数量Vβ亚家族(1～12个),其中13例CML患者外周血中的一些Vβ亚家族出现克隆性T细胞,Vβ3,Vβ10,Vβ19,Vβ21和Vβ22亚家族的克隆性增殖多见。结论CML患者胸腺近期输出初始T细胞功能明显降低,但仍存在优势利用和克隆性增殖Vβ亚家族T细胞,提示尽管整体T细胞免疫功能低下,但对白血病细胞相关抗原仍具有一定特异性免疫反应的能力。     

应用TCRVβ基因谱分析血液病与免疫性疾病的T细胞克隆性

在T细胞受体(TCR)β基因重排过程中,其Vβ,Dβ和Jβ结合的多样化和N区核苷酸的随机插入(称为互补决定区3,CDR3)使TCR β链序列呈现高度多样性,故利用TCR Vβ亚家族的特异性引物检测CDR3的长度可以作为一种新的、特异的方法用于T细胞克隆性的分析。近期已有报道分析白血病、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、淋巴瘤、移植物抗宿主病、HIV感染、艾滋病(AIDS)、类风湿和系统性硬化症等病人的外周血T细胞克隆性。结果提出上述病人的TCR Vβ T细胞出现倾斜性分布和克隆性生长的情况。该研究对于了解机体对与疾病相关的抗原的免疫反应,以及探讨如何利用这种T细胞克隆性生长的特点改善临床上对相关疾病的生物学和免疫学的治疗有十分重要的意义。     

弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血T细胞受体Vα与T细胞受体Vβ亚家族T淋巴细胞的分布与克隆性增殖特点

目的 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者外周血T淋巴细胞表达的T细胞受体(TCR)Vα与TCR Vβ亚家族基因谱系及克隆性增殖情况.方法 选取2006年4～5月及7月,于广州医科大学附属第一医院肿瘤血液科收治的3例DLBCL患者作为研究对象,并纳入研究组;选取同期于本院体检的3例健康个体纳入对照组.本研究遵循的程序符合广州医科大学附属第一医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,分组征得受试对象本人的知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.两组受试对象性别与年龄等一般临床病历资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05).通过本院检验科采集研究组与对照组血液10 mL,采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增两组受试者外周血T淋巴细胞中29个TCRVα与24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区(CDR)3,采用基因扫描分析两组RT-PCR产物的CDR3序列及其长度.回顾性分析研究组和对照组的临床数据:对比分析TCR Vα与TCR Vβ亚家族基因在两组受试者T淋巴细胞中的表达情况,以及分析研究组T淋巴细胞克隆性增殖的特点.结果 ①与对照组外周血T淋巴细胞表达全部的29个TCR Vα与24个TCR Vβ亚家族基因不同,研究组3例DLBCL患者外周血T淋巴细胞表达TCR Vα亚家族基因成员的数量为20～22个,表达TCR Vβ亚家族基因成员的数量为9～17个.②3例DLBCL患者均存在寡克隆、双克隆或克隆性增殖趋势的T淋巴细胞,其中克隆性增殖T淋巴细胞表达TCR Vα亚家族基因成员主要为TCR Vα6、Vα8、Vα14、Vα15、Vα21、Vα22、Vα23及Vα25.克隆性T淋巴细胞表达TCR Vβ亚家族基因成员主要为TCR Vβ1、Vβ3、Vβ13、Vβ15及Vβ16.表达TCR Vα6、Vα8、Vα14、Vα15、Vα23及TCR Vβ13、Vβ15亚家族基因的T淋巴细胞均全部为克隆性增殖T淋巴细胞.TCR Vα6、Vα23亚家族T淋巴细胞与TCR Vβ3、Vβ13亚家族T淋巴细胞呈明显克隆性增殖,基因扫描分析所得图形接近单克隆图形.结论 DLBCL患者外周血TCR Vα与TCR Vβ亚家族T淋巴细胞均呈优势利用及克隆性增殖的特点.     

一例慢性移植物抗宿主病患者TCR Vβ T细胞分布和克隆性的研究

目的　了解非血缘关系骨髓移植后慢性移植物抗宿主病 (cGVHD)患者的T细胞受体(TCR)VβT细胞的分布和克隆性。方法　应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增 1例非血缘关系骨髓移植后cGVHD患者的外周血单个核细胞的TCRVβ 2 4个亚家族的CDR3,了解患者TCRVβT细胞的分布情况 ,PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性。结果　患者存在 8个TCRVβ亚家族T细胞 ;其中Vβ2、Vβ3、Vβ8和Vβ13亚家族为克隆性增殖T细胞。 结论　患者外周血出现不均匀性 (即倾斜性 )分布和克隆性生长TCRVβ家族T细胞 ,它可能与cGVHD的发生有关。     

异基因造血干细胞移植患者外周血TCR Vβ亚家族克隆性增殖动态变化及其与GVHD的关系

本研究观察异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者外周血T细胞受体（TCR）Vβ亚家族克隆性增殖的动态变化,分析T细胞的克隆性演变与GVHD的关系。利用RT-PCR方法扩增70例次allo-HSCT后患者（其中17例次出现GVHD）外周血单个核细胞中24个TCRVβ基因的互补决定区3（CDR3）,PCR产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,确定T细胞的克隆性。结果表明：移植患者T细胞增殖一般都经历由单克隆向多克隆演变的过程,在移植后60-90天时,逐渐由单克隆转为单克隆和多克隆表达大致各占一半。120天以后,无GVHD患者大多转为多克隆性表达;而GVHD患者受免疫抑制剂和GVHD的影响,直到1年以上仍有部分呈单克隆表达趋势。GVHD患者发生GVHD或靶器官受累最明显的时候,外周血TCRVβ亚家族的表达主要呈现单/双克隆的表现,而经过免疫抑制治疗病情好转后,部分患者出现由寡克隆表达转为多克隆增殖趋势。结论：移植后早期患者尤其是合并GVHD的患者,T细胞呈克隆性增殖和T细胞受体的倾向性利用;随着造血和免疫的恢复,TCRVβ亚家族表达重新恢复趋向正常的多克隆性演变。     

HLA class I–associated expansion of TRBV11-2 T cells in multisystem inflammatory syndrome in children

Multisystem inflammatory syndrome in children (MIS-C), a hyperinflammatory syndrome associated with SARS-CoV-2 infection, shares clinical features with toxic shock syndrome, which is triggered by bacterial superantigens. Superantigen specificity for different Vβ chains results in Vβ skewing, whereby T cells with specific Vβ chains and diverse antigen specificity are overrepresented in the T cell receptor (TCR) repertoire. Here, we characterized the TCR repertoire of MIS-C patients and found a profound expansion of TCRβ variable gene 11-2 (TRBV11-2), with up to 24% of clonal T cell space occupied by TRBV11-2 T cells, which correlated with MIS-C severity and serum cytokine levels. Analysis of TRBJ gene usage and complementarity-determining region 3 (CDR3) length distribution of MIS-C expanded TRBV11-2 clones revealed extensive junctional diversity. Patients with TRBV11-2 expansion shared HLA class I alleles A02, B35, and C04, indicating what we believe is a novel mechanism for CDR3-independent T cell expansion. In silico modeling indicated that polyacidic residues in the Vβ chain encoded by TRBV11-2 (Vβ21.3) strongly interact with the superantigen-like motif of SARS-CoV-2 spike glycoprotein, suggesting that unprocessed SARS-CoV-2 spike may directly mediate TRBV11-2 expansion. Overall, our data indicate that a CDR3-independent interaction between SARS-CoV-2 spike and TCR leads to T cell expansion and possibly activation, which may account for the clinical presentation of MIS-C.     

Characterization of T cell repertoire in patients with graft-versus-leukemia after donor lymphocyte infusion.

The clinical efficacy of donor lymphocyte infusions (DLI) in patients with relapsed chronic myelocytic leukemia after allogeneic bone marrow transplantation has been demonstrated in several recent studies. Although it is presumed that allogeneic T cells mediate this graft-versus-leukemia (GVL) effect, the influence of DLI on the T cell compartment of recipients has not been determined. To characterize the immunologic effects of DLI and to identify T cell changes selectively associated with the GVL response, we analyzed the T cell receptor (TCR) repertoire in four patients with relapsed chronic myelocytic leukemia who achieved a complete remission after infusion of CD4+ lymphocytes from HLA-identical sibling donors. Only one of the four patients developed clinically significant graft-versus-host disease (GVHD) after infusion of donor lymphocytes. TCR repertoire was examined after PCR amplification of 24 Vbeta gene subfamilies in serial samples obtained over a 1-yr period before and after DLI. Results were compared to 10 normal donors. Before DLI, all four patients were found to have abnormal TCR Vbeta repertoire in peripheral T cells, associated with a large number of clonal and oligoclonal patterns. Abnormal TCR patterns persisted for at least 3 mo after DLI, but thereafter gradually began to normalize. By 1 yr after DLI, all patients demonstrated almost complete normalization of Vbeta repertoire with polyclonal representation within almost all Vbeta gene subfamilies. We also examined changes in the TCR Vbeta repertoire associated with the disappearance of Ph+ cells. In each patient, we were able to identify the expansion of at least 1 Vbeta gene subfamily that coincided with the time of the cytogenetic response. In one patient who was studied in greater detail, CDR3 size analysis of serial samples after DLI indicated that these changes were associated with the appearance of clonal T cells. This finding was confirmed through CDR3 sequence analysis and use of CDR3 clone-specific oligonucleotide probes. A putative GVL clone identified by this technique was not detectable in either donor or patient T cells before DLI, but persisted in peripheral T cells for approximately 1 yr. These experiments therefore provide evidence for the clonal expansion of allogeneic T cells that may be selective mediators of antileukemia activity without also mediating graft-versus-host disease.     

白血病过继免疫治疗时外周血T淋巴细胞诱导培养后的克隆性变化

本研究分析白血病细胞免疫时自体树突细胞（DC）和多种细胞因子诱导外周血淋巴细胞后T细胞克隆性的变化。采集21例化疗缓解后行细胞免疫治疗的白血病患者的骨髓和外周血,加入细胞因子培养,获得树突细胞（DC）和激活T细胞。用RT—PCR扩增代表T细胞克隆性的T细胞受体β链可变区（T—cellreceptorβvariable region,TCRBV）,用TCRBV基因扫描的方法观察培养前后T细胞克隆的特征性变化;对T细胞克隆的TCRBV进行序列分析。流式细胞术（FCM）检测CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD56＋和CD4＋CD25str＋FOXP3＋,确定其细胞毒T细胞、辅助T细胞、调节T细胞和NK—T细胞的比例变化。结果表明：临床缓解后的白血病患者的T细胞呈寡克隆分布,分属在24个TCRBV家族中一些TCRBV基因家族的淋巴细胞克隆消失,仅少数保持多克隆分布,其中TCRBV24基因家族均为克隆性的分布（100％）。分析患者的TCRBV24基因序列特征时发现,3例在CDR3区共用motifVAG,2例共用GGG,表明这些TCRBV24有可能识别同一抗原,其中1例（例5）患者除TCRBV24在CDR3区有motifGGG外,TCRBV8也有GGG,也可能会识别同一抗原。外周血淋巴细胞经过13天的体外抗原和细胞因子培养后,培养前出现的一些寡克隆以及克隆完全缺失的状态随即出现了明显变化,培养后都出现完整多克隆分布。将培养前后T细胞进行流式细胞术分析显示,培养后淋巴细胞数目为培养前的3．38±1．20倍,CD3＋数培养前为（71．1±11．8）％细胞,培养第13天后为（95．4±3．2）％,明显增加;C1M＋数培养前为（26．7±11．4）％,培养第13天后为（27．0±13．1）％,无明显变化（P〉0．01）;CD8＋数培养前为（35．7±12．9）％,培养第13天后为（55．5±13．8）％,明显增加（P〈0．01）;CD3＋CD56＋数培养前为（3．1±1．6）％,培养第13天后为（9．8±6．1）％,增加2倍多（P〈0．01）;CIM＋CD25str＋FOXP3＋数培养前为（0．12±0．1）％,培养第13天后为（0．22±0．18）％（P〈0．01）。结论：T淋巴细胞诱导培养方法的主要作用是促进CTL和NK细胞增殖,缓解后白血病患者体内淋巴细胞群往往呈寡克隆增殖,一些克隆会共用同样的TCRBVCDR3模体,识别同样的抗原,细胞因子联合诱导与DC共培养后淋巴细胞恢复多克隆免疫状态,产生以CTL和NK—T为主的效应细胞。     

单倍体相合骨髓移植小鼠GVHD靶器官的器官特异性T细胞受体克隆谱型的分子特征

本课题通过单倍体相合骨髓移植小鼠模型,研究GVHD靶器官的器官特异性T细胞受体谱型特点,以及GVHD靶器官克隆性T细胞的TCRBV CDR3分子特征。建立单倍体相合异基因移植小鼠GVHD模型,应用RT—PCR扩增小鼠肝脏、皮肤、回肠等组织移植前后TCRBV20个家族的基因序列,通过基因扫描判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质。对于寡克隆表达的TCRBV家族在长泳道测序胶上电泳,对部分单克隆条带测序,得到一组肝脏、皮肤、回肠在移植后不同时间与GVHD相关的TCRBV CDR3的分子。结果表明：单倍体相合骨髓移植小鼠在移植后14天临床开始出现典型的GVHD表现。移植后受鼠肝脏、皮肤、远端回肠等均出现典型的GVHD病理表现,在其T细胞受体谱型图上出现了分属TCRBV家族的单克隆或寡克隆增生的T细胞。肝脏、皮肤、回肠等GVHD的靶器官中部分克隆性增生的T细胞TCRBV CDR3分子存在一些C’末端保守的CDR3氨基酸基序（motif）。结论：单倍体相合异基因移植后发生GVHD的组织可出现T细胞单克隆及寡克隆增生,GVHD相关T细胞克隆共用一些保守的TCRBV CDR3基序,识别类似的抗原。     

Retrovirus-mediated gene transfer in primary T lymphocytes: influence of the transduction/selection process and of ex vivo expansion on the T cell receptor beta chain hypervariable region repertoire

We have initiated a phase I/II clinical trial, involving the use of herpes simplex thymidine kinase gene (HS-tk)-expressing donor primary T cells, in order to modulate the graft-versus-host disease (GvHD) occurring after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The preparation of gene-modified T cells (TkTCs) required a 12-day ex vivo culture comprising an initial OKT3 and IL-2 stimulation, a retrovirus-mediated transduction, and a 7-day selection step in the presence of G418 and IL-2. The low transduction efficiency as well as the culture conditions may significantly alter the diversity of the T cell repertoire. We therefore examined the T cell repertoire of HS-tk-expressing T cell samples from 11 different donors by the Immunoscope method. This method analyzes the hypervariable region of the T cell receptor beta chain (TCRBV) by amplifying the complementarity-determining region 3 (CDR3) and determining size diversity. In all examined samples (four of which were infused into patients), all TCRBV subfamilies were represented with, however, a significant skewing within a minority of subfamilies. Kinetic studies demonstrated that this skewing appeared between day 7 and day 12, with dates of appearance variable from one subfamily to another. In addition, the repertoire analysis of two different culture products, harvested and produced at different times from the same donors, suggested that some repertoire abnormalities could be donor specific. Quantitative analysis revealed no major modifications in gene usage, even in skewed TCRBV subfamilies, with a few clonal expansions concerning a limited number of TCRBV subfamilies. Importantly, identical abnormalities were found in control cells grown in parallel under similar conditions but not transduced or selected, thus demonstrating that these abnormalities were not related to the transduction or the selection process, but rather to the ex vivo culture. The initial stimulus used for T cell activation is a major source of TCRBV perturbation, since replacing the OKT3 + IL-2 stimulus by CD3 + CD28 monoclonal antibody-coated beads prevented the occurrence of alterations. Overall, the HS-tk-expressing T cells used in our clinical trial exhibit limited TCR repertoire skewing that is not due to the transduction/selection procedure. However, future T cell gene transfer protocols for clinical trials should be designed to take into account or possibly prevent such T cell repertoire alterations.     

乙型肝炎病毒感染者CD8^＋T淋巴细胞T细胞抗原受体Vβ基因互补决定区3克隆化特征的研究

目的研究乙型肝炎病毒感染者CD8^＋T淋巴细胞T细胞抗原受体（TCR）Vβ基因互补决定区3（CDR3）克隆化特征。方法选用20例乙型肝炎感染者及20例同期健康体检者,应用多引物聚合酶链反应（PCR）方法同时扩增TCRVβ基因CDR3区多个片段,高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测克隆化特征。结果乙型肝炎病毒感染者CD8^＋T细胞TCR Vβ9和Vβ14克隆化明显高于正常对照组,分别为70．0％vs 25．0％、85．0％vs 30．0％（P〈0．01）。结论乙型肝炎病毒感染者存在CD8^＋T细胞TCR Vβ9和Vβ14克隆性变化。     

血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义

目的检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者外周血血浆游离DNA免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体γ(TCRγ)基因克隆性重排,并探讨其在监测微小残留病变(MRD)中的临床意义。方法提取63例NHL患者血浆游离DNA并以Globin基因确定其存在,通过PCR方法检测IgH(VH FR3-JH)和TCRγ(Vγ-Jγ)克隆性基因重排,与病理组织学检查进行比较。并随访患者以监测和检测MRD。结果 63例中有49例[30例B细胞NHL(B-NHL)和19例T细胞NHL(T-NHL)]初诊、难治或复发的患者血浆游离DNA提取成功。30例确诊的B-NHL患者中IgH基因单克隆重排阳性27例(90%),19例确诊的T-NHL患者中TCRγ基因单克隆重排阳性14例(74%);其病理活检标本基因重排结果分别为87%和74%(P0.05)。另14例(9例B-NHL,5例T-NHL)临床缓解患者中,仅1例(B-NHL)提取出血浆游离DNA并检测到IgH基因单克隆重排。随访治疗缓解的患者共56例,其中24例患者血浆游离DNA基因重排持续阴性,2年存活率达83%;27例患者血浆游离DNA基因重排缓解时呈阴性随后转阳,5例患者缓解后始终能检测到血浆游离DNA基因重排,其2年存活率分别为26%和20%(P0.05)。结论 NHL患者血浆中可以检测出肿瘤源性的血浆游离DNA;NHL患者血浆游离DNA IgH、TCRγ基因重排的检测简单、方便,与病理活检标本检测具有相同的临床意义。在MRD的监测中,利用血浆游离DNA检测单克隆性重排具有一定的早期预测复发的作用。     

人TIM-1和TIM-3 mRNA实时SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立实时SYBR Green I定量RT-PCR检测人TIM-1和TIM-3mRNA的方法。方法从人外周血单个核细胞提取的总RNA中逆转录扩增人TIM-1和TIM-3的cDNA,将将纯化的人TIM-1和TIM-3的扩增产物分别与pMD18-T Simple载体进行连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。结果建立了TIM-1和TIM-3基因基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为103-107拷贝。阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性相关系数分别为1.00和1.00,扩增效率分别为1.070和1.023,批内及批间变异系数5%。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰。结论我们成功建立检测人TIM-1和TIM-3的实时荧光定量PCR方法,为进一步研究人TIM-1和TIM-3功能奠定基础。     

急性髓系白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖分析

本研究探讨AML患者在初发、治疗缓解后、复发等不同疾病状态下外周血T细胞TCRVB亚家族表达及T细胞克隆性增殖的情况,分析不同白血病细胞负荷对患者外周血T淋巴细胞数量及功能．尤其是对抗白血病功能的影响。应用RT-PCR扩增11例AML白血病患者不同疾病状态下及3名正常供者外周血的TCRBV24个家族的基因序列,通过基因扫描（genescan）的方法判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质,比较不同疾病状态下白血病患者外周血T细胞的Vβ亚家族的应用、克隆性增殖、T细胞的复杂性以及T细胞免疫表型的变化。结果表明：11例AML白血病患者初诊时外周血T细胞均表达部分TCR Vβ亚家族,经体外诱导后TCR Vβ亚家族表达增加;完全缓解期患者外周血T细胞TCRVβ亚家族数量明显增多,但未达到完全正常;4例患者在复发时TCR Vβ亚家族表达数量明显下降;11例患者中有9例在初诊时外周血有1至2个TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖,缓解期克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞有增加趋势,在多数病例观察到部分Vβ亚家族T细胞在初发、缓解、体外诱导扩增以及复发时仍维持克隆性增殖状态;AML白血病患者初发及复发时T细胞CDR3复杂性明显降低,呈偏态分布,而疾病缓解时T细胞复杂性有所改善。结论：AML白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族呈限制性表达;在大多数病例中无论是疾病初发抑或缓解及体外诱导、甚至在疾病复发时均可观察到克隆性T细胞的存在;在部分病例中某些Vβ亚家族在上述不同疾病状态下始终维持克隆性增殖状态,部分Vβ亚家族的克隆性增殖同白血病细胞的存在相关;在疾病状态下,AML白血病患者外周血T细胞的复杂性有所降低,而疾病缓解后可部分恢复。