基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价

目的 基于多重聚合酶链反应（PCR）建立一种快速方便的检测副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的方法。方法 结合副溶血弧菌大流行菌群的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法。用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价。并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定。结果 副溶血弧菌大流行菌群有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带。而其他细菌扩增结果呈阴性。检测灵敏度可达到105 CFU/ml。对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌大流行菌群,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性。结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高。为副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持。     

引起一起食物中毒的副溶血性弧菌的同源性分析

目的应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对引起一起食物中毒的副溶血性弧菌(VP)分离株作同源性分析,为VP引起的食物中毒溯源及流行病学研究提供科学的技术支持。方法对7份患者肛拭、5份厨师肛拭、5份留样食品以及8份环境样本进行VP分离鉴定、血清学分型、毒力基因检测及PFGE分析。结果分离自患者肛拭样本(4株)和食品(水产品)样本(2株)的VP血清型均为O3:K6型,毒力基因检测显示跨膜转录激活蛋白基因(tox R)阳性、耐热直接溶血素基因(tdh)阳性、耐热相关溶血素基因(trh)阴性。分离自食品(蔬菜)样本(2株)的VP血清型为O4:K2型,毒力基因检测显示tox R阳性、tdh阴性、trh阴性。患者与食品(水产品)分离株的PFGE分型图谱一致,具有高度同源性。结论此次食物中毒为O3:K6型VP污染水产食品所致。PFGE技术具有很强的菌株同源性分析能力,对于掌握病原菌流行规律具有重要意义。     

一起引起食物中毒副溶血性弧菌的检测

2008年7月杭州市下城区某员工食堂暴发一起由副溶血性弧菌(VP)引起的食物中毒事件,采集中毒患者粪便标本、厨师肛拭子标本和食物加工环节涂抹物标本共25份。经常规鉴定,共检出11株VP(10株来自患者粪便、1株来自食物加工环节涂抹物)。对11株VP进行血清分型和耐药性检测发现,11株VP血清型均为O3:K6型;神奈川溶血试验(KP)阳性;生物学性状和药敏试验结果均一致。采用聚合酶链反应(PCR)方法对11株菌进行种属特异基因(R72H)和毒力基因(tdh、trh)检测,同时应用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)进行分型和聚类分析,11株菌的VP种属特异基因(R72H)均为阳性,毒力基因复合PCR结果,tdh(434bp)阳性,trh(250bp)阴性;11菌株经PFGE聚类分析得到3种带型,聚类分析相似性百分比为93%。     

浙江省宁波地区腹泻患者中副溶血性弧菌检测与分析

目的 了解腹泻患者中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)携带、消长情况,建立分子溯源方法,发现流行优势型,分析疾病诱发因素,为控制副溶血性弧菌引起的食物中毒提供依据。 方法 腹泻患者中副溶血性弧菌分离采用筛检法;采用API生化鉴定系统进行菌株鉴定;用血清凝集试验对菌株进行血清分群;药敏试验采用K-B法;利用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)进行分子分型;聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细菌毒力基因。 结果 从6216份腹泻患者标本中检出副溶血性弧菌901株,占检出致病菌的63.45%。副溶血性弧菌生物学性状典型,对氨苄西林等青霉素类抗生素的耐药率高,但对其他大多数抗生素敏感。480株副溶血性弧菌分成6个血清群,O∶3血清群占72.71%,为流行优势群。根据PFGE图谱带型变化可分为19个不同的型别,其中食物中毒来源的菌株PFGE带型集中。tdh毒力基因阳性的副溶血性弧菌396株,阳性率为70.71%;trh毒力基因阳性的副溶血性弧菌79株,阳性率为14.11%;tdh、trh毒力基因均阳性的副溶血性弧菌18株,阳性率为3.21%;tdh阳性的副溶血性弧菌中有365株神奈川试验阳性,占73.14%。 结论 宁波地区腹泻患者由副溶血性弧菌引起的比例较高,O3血清群为优势血清群。PFGE分型方法准确性、特异性高、重复性好、结果容易判读,分型效果更为明显,食物中毒来源的菌株带型集中,可用于确定菌株间的聚集性关系,提示传染源和传播途径,明确食物中毒是否为同一起暴发事件。患者中分离到的副溶血性弧菌大多数为带毒株,具有致病能力,与海产品和环境株不同,可用-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等抗生素作为临床治疗用药。     

广东省江门市一起副溶血弧菌食物中毒分离株的病原学特征分析

目的 分析广东省江门市2017年某公司发生的一起副溶血弧菌食物中毒分离株的血清型别、耐药表型和分子特征。方法 对该起食物中毒事件分离到的15株副溶血弧菌进行血清学分型,抗生素敏感性检测,耐热直接溶血毒素基因（tdh）、耐热相关溶血毒素基因（trh）、GS-PCR和orf8基因的PCR检测,脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型分析。结果 15株副溶血弧菌分离株经生化鉴定、血清学鉴定为O3:K6型;抗生素敏感性分析显示,所有菌株均对氨苄西林和头孢唑啉耐药,对其他抗生素敏感;毒力基因PCR检测结果显示,所有菌株均为tdh+trh-型菌株,并且携带GS-PCR和orf8基因;14株病例分离株和1株食物分离株经限制性内切酶（NotⅠ、SfiⅠ）酶切后的PFGE指纹图谱高度相似,仅存在2条带的差异。结论 该起食物中毒的病原体为O3:K6型副溶血弧菌,携带tdh、GS-PCR和orf8基因,具有共同的耐药表型和遗传特征,此次食物中毒事件由2种克隆群的副溶血弧菌引起。     

一起O3:K6型副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学检测

目的 检测食物中毒患者粪便或肛拭子、剩余食物、调味品、食物加工环节涂抹物分离的病原菌的生物学特性,确定食物中毒的病原.方法 参照GB/T4789--2003方法,对检出的副溶血性弧菌(vP)做血清分型、耐药性、种属特异基因和毒力基因[tdh(耐热溶血素)和砌(耐热相关溶血素)]检测.结果 从153份粪便或肛拭子样品中检出74株VP,并从调味品和加工环节涂抹物及垃圾桶内的剩余食物(猪头肉)中各检出1株VP,血清型均为03:K6型,神奈川溶血阳性(KP),77株VP聚合酶链反应(PCR)扩增都出现相同VP种属特异基因(320 bp)条带,77株副VP毒力基因复合PCR结果,tdh(434 bp)阳性,trh(250 bp)阴性.结论 本次食物中毒是由具较强毒力的03:K6型VP污染引起的.     

肠道门诊分离副溶血弧菌的毒力及耐药特征分析

目的了解肠道门诊分离的副溶血弧菌的抗生素耐药性和毒力基因的携带情况。方法收集分离自2014～2016年首都医科大学附属北京友谊医院肠道门诊腹泻患者粪便的副溶血弧菌,分析其流行病学特征,采用Kirby-Bauer纸片法检测其对16种抗生素的耐药性,采用荧光PCR检测耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)的携带情况。结果从临床标本中分离出副溶血弧菌122株,阳性检出率为4.5%。毒力基因检测显示,44.3%菌株tdh单一阳性,4.9%菌株trh单一阳性,11.5%菌株tdh和trh均阳性,39.3%菌株未检出tdh和trh。药敏试验结果显示,副溶血弧菌对氨苄西林、链霉素和磺胺异口恶唑的耐药率高,分别为70.5%、59.8%和60.7%,对头孢吡肟、卡那霉素和环丙沙星敏感度下降,头孢吡肟从83.3%下降到55.2%,卡那霉素从44.4%下降到12.0%,环丙沙星从66.7%下降到29.9%,对萘啶酸、氯霉素、强力霉素、复方新诺明等均敏感。34.4%的菌株为多重耐药菌,以对链霉素、磺胺异口恶唑、氨苄西林耐药最为常见。结论肠道门诊分离的副溶血弧菌tdh+trh+和tdh-trh-的菌株比率增加,对抗生素的敏感性下降,应加强副溶血弧菌的病原学监测,指导临床合理用药。     

食源性腹泻副溶血弧菌分离株调查分析

目的 分析食源性腹泻患者副溶血弧菌（VP）季节分布及感染患者年龄特征、毒力基因、血清学分型.方法 对2014年1月至2016年12月急性腹泻患者粪便分离的125株副溶血弧菌进行常规培养、血清分型及PCR毒力基因检测.结果 副溶血弧菌感染发生有明显的季节性,夏秋季高发,尤以6～10月份为高峰期.感染患者中21～30岁占37.6％,31～40岁占24.8％.分离得到17个血清型,其中O3：K6占59.2％.经单重PCR进行毒力基因检测显示：tdh＋/trh-分离株所占比例为88.0％,tdh-/trh-分离株为6.40％,检测到2株携带（tdh＋/trh＋）基因.结论 湖州地区副溶血性弧菌感染发生呈明显的季节分布特征,且感染的患者以青壮年居多,优势血清型为O3：K6;多数菌株携带tdh＋/trh-毒力基因.     

一起O3:K6型副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学检测

目的检测食物中毒患者粪便或肛拭子、剩余食物、调味品、食物加工环节涂抹物分离的病原菌的生物学特性，确定食物中毒的病原。方法参照GB／T4789-2003方法，对检出的副溶血性弧菌（VP）做血清分型、耐药性、种属特异基因和毒力基因[tdh（耐热溶血素）和trh（耐热相关溶血素）]检测。结果从153份粪便或肛拭子样品中检出74株VP，并从调味品和加工环节涂抹物及垃圾桶内的剩余食物（猪头肉）中各检出1株VP，血清型均为O3：K6型，神奈川溶血阳性（KP），77株VP聚合酶链反应（PCR）扩增都出现相同VP种属特异基因（320bp）条带，77株副VP毒力基因复合PCR结果，tdh（434bp）阳性，trh（250bp）阴性。结论本次食物中毒是由具较强毒力的O3：K6型VP污染引起的。     

多菌型副溶血性弧菌共感染引起集中事件调查分析

目的 分析一起副溶血性弧菌（VP）集中感染事件的菌株特征,明确该起感染事件的性质。方法 在2017年9月,广西某乡镇发生一起疑似食源性疾病暴发,现场采集13例患者肛拭子,分离到10株VP,利用O和K诊断血清对分离株进行玻片凝集实验分型,采用TaqMan水解探针荧光PCR检测分离株毒力相关tlh、tdh、trh和ORF8基因,并分别用Not Ⅰ和Sfi Ⅰ两种酶进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型,导入Bionumerics 6.6软件进行聚类分析。结果 10株VP有5种血清型,6株为O3∶K6,其余4株血清型分别为O4∶K8、O1∶KUT、O2∶KUT和O10∶K19。所有菌株tlh基因均呈阳性,而trh基因呈阴性;6株O3∶K6血清型菌株和1株O4∶K8血清型菌株tdh基因均呈阳性;其余3株tdh基因呈阴性。经Bionumerics 6.6软件聚类分析,Not Ⅰ和Sfi Ⅰ酶切PFGE有8种型别,同为O3∶K6血清型的6株菌可分为4种型别。综合以上3个指标进行分析,该事件分离的10株菌中仅2株菌完全相同。结论 该起集中暴发事件由多种血清、不同PFGE型别的致病和非致病性VP多菌型共感染引起。     

2013-2018年浙江省杭州市腹泻样本中O4血清群副溶血弧菌分子特征分析

目的 分析浙江省杭州市腹泻样本中O4血清群副溶血弧菌分子特征。方法 对2013—2018年杭州市腹泻样本中分离的1 061株副溶血弧菌进行血清凝集分析,采用qPCR方法检测其中147株O4血清群副溶血弧菌的耐热直接溶血素（tdh）、耐热相关溶血素（trh）、不耐热溶血素（tlh）和toxRS/new基因,并用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法进行分子分型。结果 血清型为O4∶KUT(87.07%, 128/147)、O4∶K8(10.20%, 15/147)和O4∶K9(2.72%, 4/147)的菌株均为tdh+trh-tlh+toxRS/new-基因型。根据PFGE图谱,菌株可以分成PA（以2016年后分离的菌株为主）和PB(2013—2018年菌株)2个簇,分别包含15和16个不同带型。其中O4∶K8菌株均处于PA簇,O4∶K9菌株均处于PB簇,O4∶KUT菌株分布于PA和PB簇中。结论 近年来杭州市分离自腹泻患者的O4∶KUT血清型菌株存在2个流行克隆群。其中PB簇O4∶KUT菌株持续存在,PA簇O4∶KUT菌株在2016年出现并引起本地散在暴发,该型别菌株有成为地区流行克隆群的可...     

北京市顺义区三起关联性副溶血弧菌食源性疾病暴发事件的识别与分析

目的分析3起由副溶血弧菌（VP）导致的食源性疾病暴发事件，利用国家致病菌识别网（China PIN）对其进行关联性分析。方法收集2018年8月北京市顺义区3起食源性疾病暴发事件的流行病学资料，采集可疑食品、环境和病例样本48份，进行菌株分离和鉴定，对分离的VP菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型，获得的指纹图谱通过致病菌识别网进行比对分析。结果3起暴发事件中，共从12份病例样本和3份可疑食品样本中分离出15株O3:K6血清型VP，其种特异性基因和毒力基因检测结果为:toxR+/tdh+/trh-，根据PFGE指纹图谱可以将15株VP分成2个簇，每个簇中的指纹图谱相似度为100%。 2个指纹图谱簇之间的相似度为93.94%；且与2014 — 2017年本地区China PIN分子分型数据库中分离自腹泻病例的VP菌株带型不成簇。结论VP引起的3起食源性疾病暴发事件由共同的传染源导致，China PIN在食源性疾病暴发识别、溯源和关联性分析中有良好的应用前景。     

2010年杭州市下城区水产品中 副溶血性弧菌的污染调查

目的 调查杭州市下城区各大农贸市场水产品中副溶血性弧菌(VP)的污染情况。 方法 2010年采集下城区各大农贸市场水产品100份,按国标方法进行VP的分离与鉴定;对分离出的VP做血清分型,耐药性检测,并采用PCR法检测其种特异性基因(R72H)和毒力基因(tdh、trh)。 结果 共分离到24株VP,种特异性基因R72H全为阳性,其中2株毒力基因tdh阳性、trh阴性,其余22株tdh和trh均为阴性。 结论 虽然本次分离到的VP绝大部分都不携带tdh、trh毒力基因,但VP是历年来本辖区内引起食物中毒的主要病原菌,故仍有必要加强对水产品中VP的监测管理。     

副溶血性弧菌病原学和分子流行病学流行特征研究进展

副溶血性弧菌是导致我国细菌性食物中毒事件的首要原因.临床分离株和环境分离株的病原学特征有着明显的差异.临床分离株以O3:K6血清型为主,tdh和(或)trh基因携带率较高,一般在80%以上,脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因图谱具有明显的优势图谱,并且与血清分型具有一致性.而环境分离株(包括食品)多无优势血清型和优势PFGE图谱,tdh和(或)trh基因携带率远低于临床分离株,多在6%以下.各地临床分离株的耐药性差异较大,但对氨苄西林等早期药物耐药率均较高.环境分离株较临床分离株的耐药性更为严重和复杂.     

一起多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒脉冲场凝胶电泳分析

目的 对一起食物中毒检出的3种血清型副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP),采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行同源性分析,以明确其传染源。 方法 参照 WS 271-2007等标准,进行副溶血性弧菌分离、生化和血清学鉴定、KP试验、药敏试验、毒力基因检测、PFGE分子分型,利用BioNumerics 软件对PFGE 分型图谱进行聚类分析。 结果 17份样品均检出副溶血性弧菌,血清型可分3个型别,以O3:K6为优势血清型,占70.59%,O2:K3和 O2:K28 两血清型所占比例不一。PFGE分子分型,按100%相似度可分6个基因型别,XC12001型为优势型别,占58.82%, XC12002~XC12006型所占比例不一,聚类分析显示XC12001和XC12002型、XC12004和XC12005型相似度较高。17株副溶血性弧菌药敏结果基本一致,对氨苄西林和阿莫西林耐药率高达100%。10株O3:K6型副溶血性弧菌只携带tdh毒力基因,其余菌株tdh、trh1、trh2毒力基因全部阴性。 结论 此起食物中毒是以O3:K6血清型为主的不同克隆群副溶血性弧菌混合感染所致,PFGE可有效应用于食物中毒溯源分析及分子流行病学研究。