人脐静脉内皮细胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高与MCP-1表达的关系

目的探讨胞内S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)聚集损伤血管内皮细胞的分子基础,为阐明膳食高蛋氨酸摄入促进心血管疾病的病理机制提供实验依据。方法以永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,经不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)强效抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24,48或72 h后,利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定HUVEC内炎性分子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量,荧光定量-PCR法(qRT-PCR)检测MCP-1 mRNA的相对表达量,甲基化特异PCR法(MSP)分析MCP-1基因启动子甲基化状态。结果HUVEC经DZA处理后,与正常对照相比,胞内MCP-1的含量升高,mRNA的相对表达量上调,但其启动子甲基化方式并不发生改变。结论内皮细胞SAH升高上调MCP-1的表达可能是膳食高蛋氨酸摄入促进心血管疾病的分子机制,但这种作用与MCP-1基因启动子的甲基化状态无关。     

S-腺苷同型半胱氨酸升高与人脐静脉内皮细胞损伤及整体基因组甲基化的关系分析

目的:探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)升高对血管内皮细胞的损伤效应与整体基因组甲基化的关系。方法:以永生化的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,用不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24、48、72h,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,电子显微镜观察细胞器超微结构变化,反相高效液相色谱法(reversed phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定胞内SAH浓度,荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)测定Hcy的浓度,MTT法检测细胞生长增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,胞嘧啶延伸法检测整体基因组DNA甲基化水平。结果:HUVEC经DZA处理后,形态学上出现凋亡或坏死特征,培养基中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)浓度下降,胞内SAH含量升高,细胞的生长增殖能力降低并出现凋亡现象,整体基因组的甲基化水平降低。结论:SAH升高能导致血管内皮细胞的损伤,且这种作用与整体基因组甲基化水平有关,SAH可能是动脉粥样硬化形成过程中的潜在生物标志分子。     

动脉粥样硬化病人雌激素受体基因的甲基化与高同型半胱氨酸血症关系的研究

目的探讨动脉粥样硬化(AS)患者雌激素受体(ER-α)基因启动子区CpG岛的甲基化改变,及其与血总同型半胱氨酸(tHcy)水平的关系。方法82例研究对象分为AS组(54例),对照组(28例),所有入选对象均行颈部血管彩超检查。巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测研究对象ER-α启动子区CpG岛的甲基化状态,荧光生化法检测血tHcy水平,spearman等级相关分析甲基化程度与tHcy的相关关系。结果54例AS患者中有38例ER-α基因启动子区CpG岛甲基化,甲基化率为70.4%;28例健康对照者中有8例ER-α基因启动子区CpG岛甲基化,甲基化率为28.6%;两组甲基化率差异有显著性(P<0.05)。同时,AS组tHcy水平显著高于对照组(P<0.05),经spearman等级相关分析,ER-α基因启动子区甲基化程度与tHcy相关系数为r=0.809(P<0.05)。且随tHcy升高,AS病损程度亦递次加重。结论AS患者ER-α基因启动子区CpG岛高度甲基化,且甲基化程度与血tHcy浓度呈正相关,提示高Hcy血症很可能通过干扰ER-α基因的甲基化而促进AS的发生、发展。     

5-氮杂胞苷对宫颈癌细胞FHIT基因去甲基化及抑制增殖作用

目的:探讨5-氮杂胞苷对Hela宫颈癌细胞脆性组氨酸三联基因(Fragile histidine triad gene,FHIT)启动子去甲基化作用及对其增殖的影响。方法:采用低浓度和高浓度5-氮杂胞苷作用Hela宫颈癌细胞,分别采用BSP和RT-PCR检测处理前后FHIT基因启动子甲基化状态和mRNA表达,应用MTT法检测细胞增殖改变。结果:Hela宫颈癌细胞FHIT基因启动子表现高度甲基化状态(CG位点甲基化率为80%～100%),mRNA表达完全受到抑制,细胞呈指数增殖状态;低浓度5-氮杂胞苷作用后的甲基化率显著降低(10%～40%),细胞增殖速度降低;高浓度组FHIT基因启动子甲基化状态被完全逆转,mRNA表达明显高于低浓度组,细胞增殖速度显著低于正常组和低浓度组。结论:5-氮杂胞苷可逆转Hela宫颈癌细胞FHIT基因甲基化状态,使基因恢复表达而抑制细胞增殖,去甲基化和抑制增殖作用随5-氮杂胞苷剂量增加而增加。     

S-腺苷蛋氨酸和叶酸抑制同型半胱氨酸诱导的海马神经细胞凋亡

目的研究S-腺苷蛋氨酸和叶酸抑制同型半胱氨酸诱导的海马神经细胞凋亡作用及其相关机制。方法用同型半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸和叶酸处理体外培养的海马神经细胞,观察神经细胞的凋亡情况,以及凋亡相关蛋白的表达变化。结果用250μmol/L同型半胱氨酸作用4h可使神经细胞凋亡率显著升高,并呈时间依赖性。甲基供体S-腺苷蛋氨酸和叶酸可显著抑制同型半胱氨酸引起的神经细胞凋亡。同型半胱氨酸可显著促进凋亡相关蛋白P53、Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。S-腺苷蛋氨酸和叶酸可抑制同型半胱氨酸引起的凋亡相关蛋白表达的改变。结论S-腺苷蛋氨酸和叶酸可显著抑制同型半胱氨酸引起的神经细胞凋亡,凋亡相关蛋白表达的变化可能是S-腺苷蛋氨酸和叶酸作用的分子机制之一。     

叶酸拮抗高同型半胱氨酸血症大鼠Bcl-2基因低甲基化研究

目的探讨叶酸对蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症(Hhcy)大鼠主动脉组织Bcl-2基因甲基化水平影响。方法健康6周龄雄性wistar大鼠36只,体重(160±10)g,适应性喂养一周后随机分为对照组、高同型半胱氨酸组、叶酸干预组、每组12只。对照组给予AIN-93G配方饲料,高同型半胱氨酸组饲以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G配方饲料,叶酸干预组饲以含1.7%蛋氨酸和0.008%叶酸的AIN-93G配方饲料。喂养18周后,全自动生化仪测定血浆Hcy浓度、叶酸浓度和维生素B12浓度;免疫组化检测大鼠主动脉组织Bcl-2表达;巢式降落式PCR联合甲基化特异性PCR检测Bcl-2基因启动子区甲基化水平,荧光RT-PCR检测主动脉组织Bcl-2基因mRNA表达。结果 18周蛋氨酸饮食可以诱导大鼠高同型半胱氨酸血症(P<0.01),叶酸摄入可以拮抗血浆同型半胱氨酸水平升高(P<0.01);与对照组比较,高Hcy组大鼠主动脉组织Bcl-2阳性细胞数目增加,Bcl-2基因启动子区甲基化水平降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.05)。叶酸干预后,主动脉组织Bcl-2阳性细胞数目减少,Bcl-2基因启动启动子区甲基化水平高于高Hcy组(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达低于高Hcy组(P<0.05)。结论叶酸摄入可以拮抗高同型半胱氨酸血症大鼠主动脉组织Bcl-2低甲基化,使Bcl-2表达减弱,可能是其参与抗动脉粥样硬化形成的分子机制之一。     

鼻咽癌细胞株Syk基因启动子甲基化的研究

目的:探讨鼻咽癌细胞株Syk基因启动子甲基化与其mRNA和蛋白质表达情况之间的关系。方法:培养鼻咽癌细胞株CNE-1(高分化)、CNE-2(低分化)和永生化非癌性人鼻咽黏膜上皮细胞株(NP69),采用MS-PCR和Q-RT-PCR及Western Blot方法检测各细胞株中Syk基因的甲基化和Syk mRNA及Syk蛋白表达。结果:MS-PCR法检出CNE-1和CNE-2细胞Syk启动子甲基化率分别为36%±3.6%和62%±4.5%,而NP69未检测到甲基化;Q-RT-PCR法检出Syk mRNA在CNE-1和CNE-2的表达水平均低于NP69细胞,分别为42%±3.5%和28%±2%;WesternBlot法检出Syk蛋白在CNE-1和CNE-2的表达水平均低于NP69细胞,分别为36%±4.5%和16%±2.5%。均有统计学意义(P<0.01)。结论:在分化程度较低的鼻咽癌细胞中,Syk基因启动子甲基化程度较高,则Syk基因mRNA与蛋白的表达较低。Syk基因mRNA和蛋白的表达与Syk基因启动子甲基化程度呈负相关。     

槲皮素及其甲基化产物对大鼠肝细胞DNMTs蛋白表达与活性影响的研究

目的观察槲皮素及其甲基化产物(异鼠李素和柽柳黄素)对DNA甲基转移酶(DNMTs)表达和活性的影响。方法体外培养BRL大鼠肝细胞,以MTT法测定槲皮素甲基化产物和DNMTs活性抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza)对BRL细胞活力的影响;采用HPLC法测定细胞内S-腺苷蛋氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的含量;采用试剂盒法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的蛋白表达水平,DNMTs活性及细胞总DNA甲基化水平。结果根据MTT的结果,确定异鼠李素和柽柳黄素的处理浓度为5μmol/L,5-Aza的浓度为20μmol/L,处理时间均为24h。与对照组相比,槲皮素组细胞内SAH含量显著降低(P<0.05)。异鼠李素组细胞内SAM含量、SAM/SAH比值显著升高(P<0.05),柽柳黄素组细胞内SAM含量显著增加。与对照组比较,槲皮素组DNMT1表达显著降低(P<0.05);与槲皮素组和异鼠李素组比较,柽柳黄素组DNMT1则显著增加(P<0.05);与异鼠李素组比较,柽柳黄素组DNMT3b表达显著增加(P<0.05)。与对照组比较,5-A...     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(HVSMCs)5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响。方法正常人脐动脉血管平滑肌细胞体外培养,在培养基中加入临床高Hcy血症相关浓度及极高浓度的Hcy(0、30、100、200、500和1000μmol/L),并孵育72h,以MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态,采用RT-PCR测定MTHFR mRNA的表达水平。结果不同浓度Hcy处理人血管平滑肌细胞后,其MTHFR基因启动子区域出现去甲基化,甲基化水平明显降低。RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加。结论Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化,并使MTHFR mRNA表达增加。     

云锡矿工肺癌组织DAPK基因表达及其甲基化异常

目的探讨云锡矿工肺癌组织DAPK基因的蛋白表达及其甲基化异常。方法收集云锡矿工肺癌组织50例及10例正常肺组织。采用免疫组化检测DAPK蛋白表达,采用原位细胞凋亡检测法检测细胞凋亡,采用甲基化特异性聚合酶链反应检测DAPK基因启动子甲基化。结果50例癌组织中,38?PK蛋白表达阴性,36%检测到DAPK基因启动子异常甲基化,DAPK蛋白表达与细胞凋亡有关(P<0·05),DAPK基因启动子异常甲基化与DAPK蛋白表达呈负相关(P<0·05)。结论①云锡矿工肺癌组织中DAPK基因表达减少或缺失;②云锡矿工肺癌发生发展可能与DAPK基因异常甲基化有关。     

过氧化物酶体增殖物激活受体基因甲基化与子痫前期的相关性分析

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)基因启动子的甲基化水平及基因表达情况与子痫前期之间的相关性。方法选取2016年11月-2017年8月在甘肃省妇幼保健院产科分娩的67例子痫前期患者为观察组,56例正常分娩产妇为对照组。应用甲基化特异度聚合酶链反应(MSP)法和RT-PCR技术分析PPARα基因启动子区Cp G位点的甲基化水平及其mRNA表达情况。结果观察组患者外周血和胎盘组织PPARα基因63位点的甲基化程度明显低于对照组,差异均有统计学意义(均P0. 05)。观察组患者胎盘的PPARα基因mRNA表达量明显高于对照组,其外周血中蛋白浓度也显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P0. 05)。胎盘组织和外周血的甲基化率呈显著正相关关系(r=0. 84,P0. 01)。结论 PPARα基因启动子区域Cp G位点低甲基化变化与子痫前期具有相关性。子痫前期发病可能与母体自身密切相关。     

HIF1α通过启动ALKBH5调控整合素蛋白αν表达的机制研究

目的探索缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF1α)启动N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)去甲基化酶ALKBH5改善子宫内膜容受性分子标志物整合素蛋白αν(integrin αν, ITGAV)表达的内在机制。方法利用人子宫内膜癌Ishikawa细胞, 低氧以及干扰HIF1α条件下实时荧光定量PCR(real time quantity PCR, RT-PCR)或Western blotting检测ALKBH5的表达;过表达或干扰ALKBH5表达后, RT-PCR或Western blotting检测对ITGAV基因和蛋白表达的影响;荧光素酶报告基因系统分析miR-136-5p靶向ITGAV mRNA表达;RNA pull-down分析及m6A甲基化检测ALKBH5与miR-136-5p竞争性结合ITGAV mRNA上甲基化位点序列。结果低氧条件下HIF1α时间依赖性促进ALKBH5蛋白在Ishikawa细胞中的表达。过表达ALKBH5后, ITGAV的表达水平升高(P<0.001), Ishikawa细胞...     

雌激素受体启动子异常甲基化作为白血病早期诊断分子标志物的实验研究

目的 探讨雌激素受体基因启动子区异常甲基化作为白血病早期诊断分子标志物的可能性.方法 应用MSP和RT-PCR检测40例急性白血病患者(未治疗)外周血雌激素(ER)受体启动子甲基化及其表达状态,Western-blot检测白血病细胞株以5'-Aza-Dc去甲基化前后蛋白表达的差异.结果 6种白血病细胞株以5'-Aza-Dc去甲基化后ERα蛋白表达明显增强,97.5%的急性白血病患者ERα-A启动子呈甲基化状态并导致其表达异常.结论 白血病细胞的雌激素受体基因启动子(ERα-A)存在异常甲基化现象并导致其基因表达沉默,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示ERα-A基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标志物.     

p38α丝裂原活化蛋白激酶在食管鳞癌细胞Eca109中的功能研究

目的 探讨p38α丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在食管鳞癌细胞Eca109中的可能作用.方法 构建p38α特异性的shRNA干扰载体,瞬时转染Eca109细胞,运用qRT-PCR、免疫印迹分别检测p38α干扰后在mRNA、蛋白水平上的沉默效果;运用MTT和流式细胞仪检测p38α干扰后Eca109细胞增殖,细胞周期和凋亡的变化;运用细胞划痕实验检测p38α干扰后细胞迁移能力的改变.作为平行反向验证,转染含有p38α全长cDNA的真核过表达质粒,运用免疫印迹检测p38α过表达后在蛋白水平上的表达效果;运用MTT和流式细胞仪检测p38α过表达后细胞增殖,细胞周期和凋亡的变化;运用细胞划痕实验检测p38α的变化后细胞迁移能力的改变.结果 p38α基因在受干扰后,测定其蛋白水平表达水平(22.970±2.857)较空质粒组(35.658 ±2.286)降低,差异具有统计学意义(t=-4.475,P＜0.01).观察Eca109细胞的增殖变化,发现干扰48 h后吸光度值(0.951±0.086)大于对照组细胞(0.811 ±0.012)(t=3.20,P＜0.05),表明Eca109细胞增殖加快.观察细胞周期和凋亡变化发现,干扰48 h后凋亡率(17.400±5.495)较空质粒组(1.000 ±0.721)增加(t=40.06,P＜0.01);干扰72 h后细胞迁移速度(0.034±0.031)较空质粒组(0.278±0.021)加快(t=-5.79,P＜0.01),表明浸润能力增加.p38α在过表达后,检测到其内源性p38α蛋白表达水平(41.170±2.357)高于对照组(35.658±2.286)(t=4.41,P=0.005);48 h过表达组吸光值(0.472±0.089)与对照组细胞吸光值(0.811±0.012)相比,细胞增殖受到抑制(t=-7.50,P＜0.01),细胞生长活动在G1期受阻(t=4.80,P＜0.01),并且其细胞凋亡(32.233±1.457)高于空质粒组(1.000±0.721)(t=17.20,P＜0.01),细胞迁移[(0.770±0.054) mm]较空质粒组[(0.278±0.021) mm]减慢并且浸润受到抑制(t=11.00,P＜0.01).结论 p38dMARK抑制食管鳞癌细胞Eca109的发生发展过程.     

同型半胱氨酸、半胱氨酸在动脉粥样硬化发病机制中作用的对照研究

目的以动脉粥样硬化(As)病灶中的主要细胞类型—血管平滑肌细胞为模型,对比研究同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)在致As发病效应上的异同,以期为Hcy作为As独立危验因子的分子机制提供有比较的证据。方法体外培养人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs),用不同浓度的Hcy和Cys作用于细胞24h后:(1)用分光光度比色法测定细胞中SOD和MDA的含量;(2)流式细胞术检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR方法检测caspases-3 mRNA的表达;(3)MTT法测定细胞的增殖率;(4)用1000μmol/LHcy和Cys分别作用VSMCs24、48和72h后,MS-PCR法检测ERα启动子区甲基化的状态,半定量RT-PCR法检测ERα mRNA的表达。结果(1)Hcy可导致细胞内MDA、SOD呈剂量依赖性增加,Cys使MDA、SOD增加的效应远弱于Hcy(P<0.01)。(2)流式细胞术、caspases-3 mRNA的表达和MTT试验的结果显示,Hcy、Cys对血管平滑肌细胞凋亡率和增殖率的影响差异不太明显。(3)Hcy显著增加ERα基因启动区的甲基化修饰,并使ERα mRNA的表达进行性减少。Cys不影响ERα启动子区的甲基化状态,对ERα mRNA表达的影响也远小于Hcy。结论氧化应激对DNA甲基化修饰的影响可能在Hcy致As发病的机制中占据着重要的地位,这也可能是Hcy和Cys在As发病机制中作用不同的重要原因。     

S-腺苷甲硫氨酸对阿尔茨海默病小鼠淀粉样蛋白生成的影响

目的探讨S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM),对自发阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的APP/PS1双转基因小鼠淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)生成的影响。方法 7月龄APP/PS1双转基因AD小鼠10只,随机分为2组,每组5只,均饲喂叶酸缺乏饲料。干预组(SAM),每日灌胃400μl SAM溶液(13.2 mg/kg bw);对照组(Cont)每日灌胃400μl双蒸水。干预60 d后分别检测两组肝脏SAM、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH);脑组织海马区Aβ沉积,淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老素1(presenilin 1,PS1)蛋白表达,DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)活性及APP、PS1基因启动子的甲基化水平。结果 SAM干预60 d后,SAM组小鼠脑海马区Aβ沉积及PS1蛋白表达均低于Cont组(P0.05);与Cont组相比,肝脏SAM水平与细胞甲基化潜能升高,脑组织中DNMTs活性升高,促进APP、PS1基因启动子甲基化(P0.05)。结论补充SAM可减少AD转基因小鼠脑海马区Aβ沉积,其可能机制是:SAM作为甲基供体,可增高AD小鼠甲基化潜能与DNMTs活性,降低PS1蛋白表达,从而抑制海马区Aβ沉积。     

高同型半胱氨酸致神经管畸形的研究进展

神经管畸形(NTDs)是新生儿最常见的中枢神经系统缺陷之一,神经管闭合经过神经板形成、神经板塑形、神经板卷褶和神经褶融合四个阶段,此过程涉及遗传和环境两大危险因素。高同型半胱氨酸血症(HHcy)通过氧化应激、Ca²⁺超载、降低S-腺苷甲硫氨酸(SAM)/S-腺苷高半胱氨酸(SAH)比值等使胚胎整体DNA低甲基化,通过组蛋白修饰、基因多态性和甲硫氨酸合酶(MTR)等导致神经管闭合相关基因高表达,并激活相关信号通路(如Wnt/β-catenin信号通路和PI3K/AKT信号通路),破坏细胞增殖和凋亡之间的平衡,影响神经管正常发育,最终导致NTDs的发生。本文介绍HHcy与上述几种机制之间的关联,并进一步阐述HHcy对NTDs发生发展的影响,为临床上诊断和预防NTDs提供更为明确的理论依据。     

错配修复基因启动子甲基化对食管癌发生的作用

目的探讨食管癌组织中错配修复基因1(hMLH1)启动子区甲基化状态及与食管癌发生、发展的关系。方法应用甲基化特异性PCR和免疫组织化学链霉菌抗亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S—P法)，检测92例人食管癌组织中hMLH1启动子甲基化状态及蛋白表达。结果92例食管癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化有30例，占32．6％。HMLH1基因启动子区甲基化与食管癌的临床病理无明显相关性；hMLH1基因蛋白表达阳性率为76．1％；hMLH1基因蛋白表达阴性的22例病例中，17例发生了甲基化(77．6％)；而70例hMLH1基因蛋白表达阳性者中，只有13例发生甲基化(18．6％)。结论食管癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化与hMLH1基因蛋白表达缺失密切相关，是导致其错配修复功能缺陷的重要原因之一，hMLH1基因启动子区甲基化可能在食管癌的发生和发展过程中发挥重要作用。