氧化应激致自噬在光气诱导的急性肺损伤中的作用

目的：探讨大鼠光气暴露模型中肺组织氧化水平的变化,以及氧化应激是否通过调控自噬缓解光气诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)。方法：将50只大鼠分为对照组、光气染毒后6、12、24和48 h组。对照组大鼠鼻吸入空气,光气染毒组大鼠鼻吸入41mg/m³的光气,动态染毒30 min。检测相关指标后,选择染毒后12 h组作为本研究动物模型(后称光气组)。另将40只大鼠分为对照组(腹腔注射0.9%生理盐水)、光气组(41 mg/m³的光气染毒30 min)、RPM处理组(光气染毒后腹腔注射5 mg/kg的RPM)和RPM对照组(腹腔注射5 mg/kg的RPM)。再取40只大鼠分为对照组(腹腔注射0.9%生理盐水)、光气组(41 mg/m³的光气染毒30 min)、NAC处理组(光气染毒后腹腔注射200 mg/kg的NAC)和NAC对照组(腹腔注射200 mg/kg的NAC)。观察大鼠肺组织病理学改变;检测大鼠肺功能、肺湿质量、肺系数和肺泡灌洗液(BALF)总蛋白浓度;测定大鼠肺组织ROS水平、肺组织脂质过氧化水平、抗氧化酶(SOD、CA...     

氯气吸入致大鼠肺血管内皮细胞的线粒体损伤及红景天苷的干预作用

目的：观察氯气致大鼠肺损伤过程中,线粒体的结构与功能变化及红景天苷的干预作用,探讨红景天苷可能的保护机制。方法：36只雄性SD大鼠随机分为6组,分别为未染毒组（给予空气）,以及氯气染毒后0.5、1.5、3、6和9 h组,给予1 200 mg/m³氯气暴露处理5 min。另24只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为氯气暴露组、红景天苷干预组、红景天苷对照组和阴性对照组,氯气染毒条件同上,红景天苷干预组和红景天苷对照组在氯气染毒前30 min和染毒后15 min各给予1次300 mg/kg红景天苷灌胃,阴性对照组给予生理盐水灌胃。比色法检测各组大鼠肺泡灌洗液（BALF）和血清中乳酸脱氢酶（LDH）的活力;透射电镜下观察氯气暴露后3 h肺组织血管内皮细胞线粒体超微结构改变;定磷法检测肺组织Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶的活力,低温差速离心法分离并提取线粒体蛋白;Western blot法检测肺组织或线粒体中Tom 20、PINK1以及Parkin蛋白表达水平。结果：与未染毒组相比,氯气暴露0.5 h后,大鼠BALF中LDH活力显著升高（P < 0.05）;肺组织PINK1、Parkin、Tom20蛋白表达水平均显著升高（P < 0.05）,且Tom20蛋白表达在染毒后3 h最高（P < 0.05）;故选取染毒后3 h为干预时间点。透射电镜结果显示,氯气暴露后3 h,肺血管内皮细胞中线粒体明显肿胀,嵴数量减少或消失。与阴性对照组相比,氯气染毒后大鼠肺组织中PINK1、Parkin以及线粒体PINK1蛋白表达显著升高（P < 0.05）,线粒体Parkin蛋白表达显著下降（P < 0.05）;肺组织Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶以及血清LDH的活力均显著升高（P < 0.05）。红景天苷干预可显著逆转因氯气暴露引起的上述检测指标的异常表达（P < 0.05）。结论：氯气致大鼠急性肺损伤过程中,血管内皮细胞线粒体结构与功能受损,呈时间效应关系。红景天苷可能通过保护线粒体,改善氯气暴露引起的急性肺损伤。     

光气急性中毒机制的深入研究

光气是一种经典的化学战剂,也是化学恐怖袭击的重点选择对象。同时光气又是一种重要的化工原料,广泛应用于高分子材料、农药、医药、香料和染料等领域,在生产、储存、运输过程中的意外事故造成的光气泄漏,极大威胁人民生命财产安全,这些使得光气一直是各国学者的研究热点。光气中毒主要引起难治性肺水肿,死亡率极高,目前世界上没有有效的救治方法和药物,主要是由于对其中毒机制不清楚。我们实验室多年来一直从事窒息性毒剂肺损伤机制研究,近年来取得了一些发现性的成果,提出了光气的酸烧伤理论,同时就氧化损伤-呼吸爆发等机制进行了一定的研究,本文将就光气部分最新研究进展做一综述。     

MnCl2致人肺细胞线粒体功能的损伤

目的 探讨MnCl2导致的人肺细胞线粒体功能损伤,初步研究核呼吸因子1(NRF-1)在Mn导致线粒体功能损伤中的表达改变.方法 用不同浓度的MnCl2分别处理人支气管上皮细胞16HBE和人肺腺癌细胞A549,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活和线粒体酶活性,荧光分光光度法检测线粒体膜通透性转运孔(PTP)的开放程度和线粒体膜电位(△ψm)的变化;流式细胞仪分析细胞凋亡;Western blot法检测NRF-1及线粒体转录因子(mtTFA)的蛋白表达量变化.结果 MnCl2可导致16HBE和A549细胞存活下降,其半数抑制浓度(IC50)分别为1.91 mmol/L和1.98 mmol/L.MnCl2可抑制细胞线粒体总酶活性,且存在浓度效应关系,其中1.00 mmol/L MnCl2对16HBE细胞和A549细胞的线粒体总酶活性抑制率最高,分别为(52.8 ±5.4)%和(50.6±2.2)%.线粒体PTP开放程度随着MnCl2作用浓度的增加而增强,且同一浓度MnCl2作用时间增加,PTP开放程度增强.当PTP开放程度增大时,细胞△ψm降低,与对照组相比,0.25、0.50、1.00 mmol/LMnCl2处理16HBE细胞后,△ψm分别下降了(7.9±3.0)%、(26.2±2.2)%和(27.8±4.1)%;0.25、0.50、1.00 mmol/LMnCl2处理A549后,△ψm分别下降了(4.7±1.0)%、(14.9±2.4)%和(27.5±1.2)%.MnCl2可导致细胞凋亡率增加,当1.00 mmol/L MnCl2处理16HBE和A549细胞48 h后,细胞凋亡率分别为(12.3±1.9)%和(6.0±0.4)%.Western blot结果显示,MnCl2可导致16HBE和A549细胞中NRF-1和mtTFA蛋白的表达水平降低,与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MnCl2可诱导16HBE和A549细胞线粒体功能损伤,NRF-1蛋白表达降低,NRF-1可能参与Mn引起的线粒体功能损伤的过程.

Abstract：

Objective To explore the effect of MnCl2 on the mitochondrial function of human lung cells, and to study the changes of protein expression level of nuclear respiratory factor-1 ( NRF-1 ) in mitochondrial dysfunction induced by MnCl2. Methods The effects of MnCl2 on cell survival rate were assessed by the reductions of tetrazolium dye (MTT) in cultured cell lines 16HBE and A549 cells. All tested16HBE and A549 cells were incubated with different concentrations of MnCl2. The permeability transition pore ( PTP ) of mitochondria, mitochondrial membrane potential and the inhibition rate of mitochondrial enzymes as indicators of mitochondrial damage were measured by fluorescent spectrometry and MTT assay, respectively. Apoptosis was determined by flow cytometry. Protein levels of NRF-1 and mtTFA were measured by Western blot assay. Results MnCl2 decreased the survival rate of the two cell lines. The IC50 of 16HBE and A549 cells were 1.91 mmol/L and 1.98 mmol/L, respectively. MnCl2 caused a concentration-dependent decrease of mitochondrial enzymes and the inhibition rate of mitochondrial enzymes of the two cell lines induced by 1.00 mmol/L MnCl2 were (52.8 ±5.4)% and (50.6 ±2.2)%,respectively. The PTP opening increased in MnCl2-treated cells in a dose- and time-dependent manner.Compared with the control group, mitochondrial membrane potential in the two cell lines was decreased by MnCl2, by (7.9±3.0)%, (26.2±2.2)% and (27.8 ±4. 1)% in the 16HBE cells, and (4.7 ±1.0) %, ( 14.9 ± 2.4) % and (27.5 ± 1. 2) % in the A549 cells. Increased apoptosis rates of the two cell lines were induced by 1.00 mmol/L MnCl2, ( 12.3 ± 1.9) % and (6.0 ± 0. 4) %, respectively. The results of Western blot assay revealed that the protein levels of NRF-1 and mtTFA were decreased in manganese-treated cells in a dose-dependent manner, with a significant difference compared with that of the control cells (P ＜ 0. 05 ). Conclusion MnCl2 induces mitochondrial dysfunction in 16HBE and A549 cells, and decreases the expression level of nuclear respiratory factor-1 ( NRF-1 ), indicating that NRF-1 may play an important role in mitochondrial dysfunction.     

光气致小鼠肺组织细胞凋亡相关基因的表达

目的：研究光气染毒肺水肿小鼠肺组织Bax、c-Fos、c-Jun、Caspase-3和Fas的表达。方法：10只BALB/c小鼠随机分为对照组和光气染毒组,每组5只。正常对照组以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9 mg/L的光气,染毒时间为5 min。染毒后4 h,取小鼠肺脏,用4%的多聚甲醛固定。原位杂交和免疫组化测定肺组织Bax、c-Fos、c-Jun,Caspase-3和Fas的表达。Westen blot测定Fas蛋白的表达。结果：光气染毒组肺水肿小鼠肺组织Bax、c-Fos、c-Jun、Caspase-3和Fas基因的表达较对照组明显增高（P〈0.05）,且Fas蛋白的表达也升高（P〈0.05）。结论：光气可能通过Fas/FasL通路诱导肺上皮细胞发生凋亡。     

胎儿输卵管上皮细胞线粒体的体视学研究

为了探讨线粒体在胎儿输卵管上皮细胞发育中的变化特征，应用体视学方法检测了胎龄１６～３６周胎儿输卵管上皮细胞线粒体的体密度、数密度、平均体积、表面积密度、表面积体积比、平均表面积。结果显示，胎龄２０周前，峡部上皮细胞线粒体的体密度与３０周后的近似（Ｐ＞００５），即大于２０～２９周的（Ｐ＜００５），２０周前峡部线粒体平均体积和平均表面积均较大，而３０周后数密度和表面积密度较大。壶腹部上皮细胞线粒体体密度、平均体积、数密度在３０周前不同孕期间较接近（Ｐ＞００５），３０周后出现明显改变。伞部线粒体体密度、数密度在２０～２９周期间增大（Ｐ＜００５）。峡部和壶腹部线粒体体密度分别在２０周前及３０周前较大，伞部线粒体体密度仅在２０～２９周较大，上述结果表明线粒体占上皮细胞体积之比因部位和孕期而异，提示胎儿输卵管上皮细胞发育的部位差异和阶段性     

维生素E与硫辛酸对光气损伤的抗氧化作用探讨

背景与目的:观察维生素E或/和硫辛酸对光气损伤小鼠的抗氧化作用,为临床救治光气中毒提供实验资料.材料与方法:确定小鼠在光气中毒后体内发生了一定程度的氧化损伤,然后分组给予维生素E或/和硫辛酸,应用全自动血球分析仪进行血液学分析,采用荧光法测定动物肝脏与肺脏MDA.结果:维生素E(6 mg/kg)或/和硫辛酸(0.8 mg/kg)对光气引起的全血WBC、PLT降低有促进恢复作用,对肝脏与肺脏MDA的升高有一定的抑制作用,维生素E单用组效果显著,维生素E与硫辛酸复合组效果最差.结论:维生素E对光气导致的脂质过氧化的抗氧化作用优于硫辛酸,维生素E与硫辛酸复合组效果不及单用.     

急性硒中毒后小鼠肝细胞线粒体损伤的时间形态学研究

对急性二氧化硒中毒所致肝细胞线粒体损伤进行时间形态学定量研究,以发现其敏感时间点,为临床合理地使用硒制剂提供基础资料.雄性BALB/C小鼠60只,随机分为正常对照组与染毒组,每组30只.每组再随机分为6个时间组,每隔4小时各一组,每组5只.染毒组小鼠以口服LD50量腹腔注射二氧化硒(SeO2).两组均在1小时后处死.应用体视学方法对肝细胞线粒体的体密度(Vv)、比表面(δ)、表面积密度(Sv)、平均体积(V)和数密度(N、)进行测算.硒中毒后小鼠肝细胞线粒体与对照组相比,δ除0400组外,其他时间组则明显减小(P＜0.05),最低值出现在1200;V除0800组外,其他时间组普遍增大,其中1200组明显增大(P＜0.05).N在1200、1600和2000组与对照组相比明显减少(P＜0.05),其他时间组与对照组相比则未见显著性差异(P＜0.05);而体密度和表面积积密度则无明显改变.硒中毒可直接导致肝细胞线粒体的损伤,表现为线粒体体积增大,比表面及数量减少,从而导致其功能降低.硒中毒时其线粒体损伤变化表现为夜间较轻,白天较重.0400h可能为肝细胞线粒体的不敏感时间点;而1200h可能是其硒中毒的最敏感时间点.为以后更好地认识和预防硒中毒提供了基础病理资料.     

氯化镉致人肝癌细胞SMMC-7721线粒体损伤作用

目的：研究氯化镉对人肝癌细胞SMMC-7721线粒体的损伤作用。方法：分别用5、10、20、30、40μmol/L氯化镉作用体外培养的SMMC-7721细胞24h,实验同时设对照组。采用形态学方法检测其线粒体的结构完整性,用分光光度法检测线粒体钙离子转运能力,采用琼脂糖凝胶电泳法检测线粒体DNA损伤。结果：随着氯化镉的浓度升高,存活细胞数降低,细胞内的线粒体数量减少;氯化镉处理组细胞线粒体钙离子转运能力下降,并可见线粒体DNA损伤条带。结论：氯化镉可以引起人肝癌细胞SMMC-7721线粒体及线粒体DNA损伤。     

光气对小鼠MDA、GSH和SOD的影响

背景与目的 :研究小鼠光气染毒后不同时间对肺脏、血清和肝脏的氧化损伤。材料与方法 :40只雄性小鼠 ,随机分为4组。正常对照组小鼠以空气为对照 ,染毒组小鼠给予11.9mg/L剂量的光气 ,时间为5min,染毒后2、4、8h,测定各组小鼠肺脏、血清和肝脏的丙二醛(Malondialolehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量、总超氧化物歧化酶(TotalSuperoxideDismutase,T_SOD)活力。 结果 :随着光气染毒后时间的增加 ,小鼠肺脏、血清和肝脏的MDA含量升高 ;肺脏的T_SOD活力升高 ;肺脏和肝脏的GSH含量在染毒后2h降低。 结论 :光气染毒可引起小鼠肺脏、血清和肝脏的氧化损伤。     

药物极性对肺癌细胞线粒体功能的影响

目的：探讨药物极性对肺癌细胞线粒体功能的影响。方法：体外培养肺癌细胞至指数生长期,加入20.0μmol/L的亚硒酸钠、全反式维甲酸、亚硒酸钠并全反式维甲酸。以MTT法检测吸光度,流式细胞仪检测细胞周期,透射电镜观察线粒体改变,判断药物极性对肺癌细胞线粒体功能的影响。结果：药物作用24～96h,亚硒酸钠与全反式维甲酸组吸光度差异有统计学意义,P〈0.05。药物作用48h,S期比例增加伴有G0/G1期增多或减少,G2/M期逐渐减小直至曲线峰消失。处理组细胞周期中各期的变化与空白对照及阴性对照组相比差异有统计学意义,P〈0.05。20.0μmol/L全反式维甲酸加药48h后线粒体数量增加,形状大小不一,双层膜和内嵴清晰。20.0μmol/L亚硒酸钠加药48h后线粒体外形结构不清,有的线粒体肿胀。20.0μmol/L二者联合加药48h后,线粒体内嵴减少缩短,有电子密度高的不定形物质沉淀。结论：亲脂性药物全反式维甲酸可与肺癌细胞线粒体结合增强其功能,水溶性药物亚硒酸钠不易与肺癌细胞线粒体结合而抑制其功能。二者对肿瘤细胞线粒体的作用值得进一步研究。     

A549细胞系中自噬泡与线粒体形态的初步定量研究

目的探讨发生自噬的细胞中自噬泡的特点及自噬泡与细胞中线粒体形态特征参数间的关系,分析自噬泡膜来源于线粒体膜的可能性。方法将A549细胞培养后收集1～5×106个,常规固定、包埋及超薄切片,在透射电镜下观察。由随机取样的原则选择细胞进行照相。应用CMIAS多功能真彩色图像分析系统测定细胞、线粒体及自噬泡等结构的截面积和截面数目等参数,根据自动测量结果将细胞分为3组。结果 3组细胞内自噬泡总截面面积的平均值明显不同;3组间自噬泡体积密度的平均值之间存在统计学差异(P=0.03)。3组细胞内线粒体数目及线粒体总截面面积的平均值呈相应下降。结论由于3组细胞内线粒体和自噬泡总截面面积的平均值变化趋势相反,推测部分自噬泡的膜可能来源于线粒体的膜。     

Long term radiological features of radiation-induced lung damage

Purpose

To describe the radiological findings of radiation-induced lung damage (RILD) present on CT imaging of lung cancer patients 12?months after radical chemoradiation.

姜黄素对急性肺动脉栓塞大鼠肺损伤及CFTR表达的影响

目的：观察姜黄素对急性肺栓塞大鼠肺损伤的保护作用及对CFTR表达的影响。方法：大鼠分为假手术组,模型组,姜黄素（150mg/kg）﹢APE组。制备左肺动脉结扎模拟急性肺动脉栓塞模型。进行血气分析,检测AFC及肺湿干比,real-time PCR方法检测肺组织的CFTR的表达。结果：与模型组比较,姜黄素升高PaO2水平,减轻AFC下降趋势,及减少肺湿干比的增加。姜黄素能提高肺组织的CFTR的表达。结论：姜黄素对急性肺动脉栓塞大鼠的急性肺损伤有保护作用,并上调CFTR的表达。     

小鼠光气染毒对肺脏细胞的凋亡作用

背景与目的:小鼠原代肺Ⅱ型细胞的分离、培养方法的建立,探讨光气对肺水肿小鼠的肺脏细胞凋亡的诱导作用.材料与方法:12只二级BALB/c小鼠,雄性,随机分为2组:正常对照组(6只)和染毒组(6只).正常对照组小鼠以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9 mg/L剂量的光气,时间为5 min.染毒后4 h,分离、培养肺Ⅱ型细胞,电镜观察两组小鼠肺Ⅱ型细胞、肺Ⅰ型细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和纤毛细胞凋亡情况.结果:单宁酸染色和电镜鉴定培养细胞为小鼠原代肺Ⅱ型细胞;小鼠给予11.9 mg/L的光气染毒5 min,电镜显示光气染毒肺水肿小鼠原代肺Ⅱ型细胞出现凋亡小体,肺Ⅱ型细胞核染色质呈现月牙型,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和纤毛细胞均出现凋亡征象.结论:建立了小鼠原代肺Ⅱ型细胞的分离、培养方法,证明光气染毒可造成肺水肿小鼠肺脏细胞发生凋亡.     

Nuclear oxidative damage correlates with poor survival in colorectal cancer

Oxidative DNA damage results from DNA adducts such as 8-oxo-7, 8 dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG), which is a pro-mutagenic lesion. No known association between 8-oxo-dG, disease progression and survival exists in colorectal cancer (CRC). We examined levels of 8-oxo-dG in sporadic CRC to determine its relationship with pathological stage and outcome. A total of 143 CRC patients and 105 non-cancer patients were studied. Nuclear and cytoplasmic 8-oxo-dG was assessed using immunohistochemistry. Double immunofluorescence using 8-oxo-dG and manganese superoxide dismutase (MnSOD) antibodies localised cytoplasmic 8-oxo-dG. Apoptosis was detected using TUNEL. Nuclear staining levels were similar in tumour tissue and matched normal mucosa in both epithelial (P=0.22) and stromal (P=0.85) cells. Epithelial cytoplasmic staining was greater in tumour tissue (P<0.001). Double immunofluorescence localised cytoplasmic 8-oxo-dG to mitochondria. Epithelial and stromal nuclear 8-oxo-dG decreased with local disease spread, but highest levels were found in distant disease (P<0.01). Survival was related to epithelial nuclear and stromal staining in normal mucosa (P<0.001) and tumour (P<0.01) but was unrelated to cytoplasmic staining. Normal control cells in tissue from cancer patients with high levels of 8-oxo-dG failed to undergo cell death. 8-oxo-dG may be an important biomarker of disease risk, progression and survival for CRC patients.     

单味龙血竭对急性放射性肠损伤的防护作用

目的:回顾性分析中药龙血竭预防急性放射性肠损伤的临床疗效。方法:2007年-2013年我院盆腔肿瘤术后放疗患者296例。预防组（157例）给予龙血竭胶囊口服（6～8粒/次,3次/d,与放疗同步）;对照组（139例）给予思密达口服（1包/次,3次/d,与放疗同步）。观察两组急性放射性肠损伤发生的时间、程度,并观察服用龙血竭后的不良反应发生情况。结果:预防组和对照组急性放射性肠损伤发生时间分别为放疗开始第12~30天（平均25天）和第2~35天（平均13天）,预防组发生时间明显晚于对照组。预防组和对照组急性放射性肠损伤总发生率、Ⅱ-Ⅳ级急性放射性肠损伤发生率分别为14.65%、32.37%和5.10%、15.83%,统计学分析均具有显著性差异（χ2=13.09,χ2=9.32,P＜0.01）。两组均未出现严重急性放射性肠损伤（Ⅳ级）。结论:龙血竭防治急性放射性肠损伤发生时间晚、发生率低、程度轻,临床预防效果满意。