CXCR4小干扰RNA对人大肠癌细胞SW480迁移能力的抑制作用

目的：探讨CXC族趋化因子受体4（CXC chemokine receptor4，CXCR4）小干扰RNA对人大肠癌细胞株SW480迁移能力的抑制作用。方法：将与CXCR4mRNA互补的小干扰RNA（siRNA）及阴性对照Non-silencingdsRNA以阳离子脂质体包埋后转染人大肠癌细胞株SW480，采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测转染后SW480细胞CXCR4mRNA表达的变化，采用Western blotting检测转染细胞CXCR4蛋白表达的变化，采用Transwell迁移实验检测大肠癌细胞SW480迁移能力的变化：结果：与正常对照组和Non—silencing dsRNA相比，siRNA各浓度组对SW480细胞CXCR4mRNA和蛋白的表达均有明显的抑制作用（P〈0．01），其抑制效应具有浓度依赖性（P〈0．01）。与正常对照组和Non—silencing dsRNA相比，siRNA各剂量组对肿瘤细胞迁移有明显抑制作用（P〈0．01），其抑制效应具有剂量依赖性（P〈0．01）；siRNA在终浓度为50、100和200nmol／L时对SW480细胞的迁移抑制率分别为20．5％、37．5％和52．9％。结论：CXCR4小干扰RNA通过下调CXCR4mRNA和蛋白的表达显著抑制人大肠癌细胞SW480的迁移，并呈剂量依赖性。     

VEGFR-3 siRNA对人结肠癌细胞黏附力和侵袭一眭的抑制作用

目的：探讨VEGFR-3对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的影响。方法：构建携靶向VEGFR-3基因siRNA（small interfering RNA）表达载体，转染人结肠癌LoVo细胞，半定量RT—PCR和Westernblotting检测转染前后LoVo细胞VEGFR-3mRNA和蛋白表达的变化，基质-黏附实验检测细胞转染后的黏附能力，细胞侵袭实验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变。结果：携靶向VEGFR-3基因siRNA的表达载体成功构建，RT—PCR检测转染siRNA后LoVo细胞VEGFR-3mRNA表达水平降低；Westernblotting检测转染siRNA后72hLoVo细胞VEGFR-3蛋白表达下降，其表达相对值由（1．26±0．19）降至（0．39±0．12）（P〈0．05）。转染siRNA72h后LoVo细胞的黏附能力显著下降[（0．626±0．047）vs（0．407±0．029），P〈0．05]；LoVo细胞穿膜细胞数（6．38±3．25）明显低于空白对照组（24．82±3．44）、非特异性对照组（23．58±3．73）（P〈0．05）。结论：siRNA能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应，下调VEGFR-3基因的表达，进而抑制LoVo细胞的黏附能力和侵袭性。     

siRNA抑制人高迁移率族蛋白1表达对前列腺癌PC-3增殖的影响

目的：研究小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制高迁移率族蛋白1（HMGB1）基因的表达对人前列腺癌细胞PC-3增殖的影响。方法：构建真核表达载体Pgenesil-1／HMGB1 siRNA，在脂质体Lipofectamina 2000的介导下转染前列腺癌PC-3细胞株，通过RT—PCR和Westerll Blot检测HMGB1的mRNA及蛋白质的变化；流式细胞仪检测细胞周期；噻唑蓝（MTT）检测细胞生长曲线观察转染后PC-3细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果：成功构建siRNA表达载体Pgenesil-1／HMGB1 siRNA，所获表达载体转染可使PC-3细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P〈0．05），并能有效抑制PC-3增殖活性（P〈0．05）。结论：应用siRNA干扰技术能有效的抑制HMGB1基因的表达，同时也可有效抑制癌细胞的体外增殖活性，为肿瘤的生物学治疗提供新思路。     

T7体外转录siRNA靶向干扰Pim-2效应观察

[目的]观察T7RNA聚合酶介导体外转录合成siRNA靶向干扰Pim-2基因表达的效应。[方法]利用T7RNA聚合酶介导的体外转录合成靶向Pim-2的siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ．将其转染入人结肠癌细胞株SW480。利用RT-PCR和Western blot观察Pim-2基因在RNA和蛋白质水平的表达变化。[结果]与对照细胞相比，转染siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ48h后，Pim-2基因mRNA的抑制率分别为65.4％（P〈0．05），46．2％（P〈0．05）和56．1％（P〈0．05）；转染72h后，Pim-2基闵蛋白表达抑制率分别为61．6％（P〈0．05），45．8％（P〈0．05）和55．6％（P〈0．05）。[结论]T7体外转录合成siRNA，能有效而特异地抑制人原癌基因Pim-2的表达．     

小干扰RNA抑制CXCR4基因表达对人肺癌细胞体外侵袭力的影响

目的：研究趋化性细胞因子受体CXCR4小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对人肺癌细胞体外侵袭力的影响。方法：利用T7 RNA聚合酶体外合成CXCR4特异性siRNA，用脂质体转染A549细胞。于转染后72h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平，用Western印迹方法检测CXCR4蛋白质水平，用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力的变化，通过MTT法测定细胞增殖能力，用FCM法检测细胞周期的分布情况。结果：转染CXCR4 siRNA 72h后，CXCR4 mRNA及蛋白质水平明显下调，细胞的体外侵袭力减弱，增殖活性降低，细胞周期分布无明显改变。结论：特异的siRNA能够有效下调CXCR4基因，降低人肺癌细胞体外侵袭能力。     

GSK-3β对子宫内膜样腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的：研究糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthasekinase，GSK-3β）对子宫内膜样腺癌已分化细胞株Ishikawa、HEC-1-A及未分化细胞株KLE增殖和侵袭能力的影响。方法：用GSK-3β小分子干扰RNA（GSK-3β siRNA）转染上述3种细胞株，采用Western印迹法检测GSK-38蛋白及凋亡相关蛋白caspase-3的表达；Brdu掺入实验检测细胞增殖率；FCM法检测细胞周期及凋亡率；Transwell侵袭试验检测对细胞侵袭、运动能力的影响；明胶酶谱法检测细胞分泌基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的情况。结果：转染GSK-3β siRNA后，3种细胞株中GSK-3β蛋白的表达均低于对照组（P〈0．05）；Ishikawa、HEC-1-A细胞Brdu掺入率降低，S期细胞数比例减少，凋亡率增加，caspase-3表达上调；细胞侵袭能力降低，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。但是KLE细胞株与对照组相比，增殖和侵袭能力均无明显差异（均为P〉0．05）。结论：GSK-3β能促进已分化的子宫内膜样腺癌细胞株Ishikawa、HEC-1-A的增殖和侵袭；但是对未分化的KLE细胞株的增殖和侵袭能力无明显影响。     

HMGA1基因小分子RNAi对卵巢癌转移抑制的实验研究

目的：探讨高迁移率蛋白家族A1（high mobility group A1,HMGA1）基因小分子干扰RNA对卵巢癌转移抑制的机理。方法：RT—PCR一步法检测3种不同的卵巢癌细胞株中HMGA1、E钙黏蛋白mRNA的表达水平;设计并合成HMGA1 siRNA,转染H08910PM细胞：半定量RT—PCR分析法观察HMGA1 siRNA转染对E钙黏蛋白mRNA表达的逆转作用,及对卵巢癌细胞株体外侵袭、运动的抑制作用。结果：RT—PCR半定量分析结果显示：OVCAR-3细胞中HMGA1 mRNA表达量相对较低（0．64±0．13）,而E-钙黏蛋白mRNA仅在OVCAR-3细胞中有表达;H08910PM细胞稳定转染HMGA1 siRNA后,转染组、对照组HMGA1 mRNA表达水平分别为0．16±0．08、0．47±0．11（P〈0．01）,E钙黏蛋白mRNA表达水平分别为0．38±0．07、0．09±0.05（P〈0．01）;体外运动实验显示,跨膜细胞数转染组明显低于对照组（P〈0．05）;重组细胞基底膜侵袭实验显示,穿透基底膜细胞数转染组明显低于对照组（P〈0．01）。结论：HMGA1基因与卵巢癌转移密切相关,HMGA1基因siRNA可上调卵巢癌细胞中E钙黏蛋白的表达,抑制卵巢癌细胞的运动和侵袭,为卵巢癌转移的基因治疗提供新的靶点。     

RNAi对骨肉瘤细胞株HMGA1基因表达及侵袭力抑制的实验研究

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术对骨肉瘤细胞株(MG-63)中HMGA1基因表达和侵袭力的影响.方法:采用单细胞克隆技术,从MG-63中分离培养出高表达HMGAl的骨肉瘤细胞株,将细胞分成3组,通过PU6mRFP载体进行转染:实验组,转染HMGA1的小干扰RNA(siRNA);阴性对照组,转染HMGA1的无关序列;细胞对照组为未转染的MG-63细胞.转染细胞株后,荧光检测转染效率;用实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别从mRNA和蛋白质水平检测siRNA对HM-GA1表达的影响;Transwell趋化侵袭实验观察转染后细胞株侵袭能力的变化.结果:荧光检测转染效率,实验组为(55.68±6.74)%,阴性对照组为(49.87±4.33)%;细胞对照组观察不到明显的荧光细胞.实验组HMGA1 siRNA转染骨肉瘤细胞后,明显下调细胞中HMGAl mRNA及蛋白的表达,与转染时间和转染浓度相关;阴性对照组和细胞对照组在转染前后HMGAl基因的mRNA及蛋白质表达均无明显变化.实验组细胞株穿过侵袭膜的细胞数明显低于阴性对照组和细胞对照组,P<0.01.结论:HMGAl siRNA可以下调骨肉瘤细胞中HMGAl mRNA及其蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞侵袭能力.     

特异性小干扰性RNA降低骨桥蛋白基因表达对肝癌细胞侵袭性的影响

目的 应用RNA干扰技术降低细胞内骨桥蛋白的表达水平,研究骨桥蛋白对人肝癌细胞侵袭性的影响。方法 体外化学合成骨桥蛋白序列特异性双链RNA,转染高转移肝癌细胞株HCC-LM3,用实时定量PCR和Western blot检测骨桥蛋白的表达。通过生长曲线、克隆形成和Matrigel侵袭实验,观察肝癌细胞恶性生物学行为的改变。结果 骨桥蛋白特异性小干扰性RNA（siRNA）转染组的HCC-LM3细胞,骨桥蛋白mRNA水平下降79％,蛋白水平下降81％。体外实验表明,与空白对照组及非特异性siRNA转染组相比,骨桥蛋白特异性siRNA转染组HCC-LM3细胞克隆形成数目下降,穿过人工基底膜的细胞数减少（P〈0．05）。结论 降低骨桥蛋白的表达可显著抑制肝癌细胞的侵袭转移能力。     

可溶性FasL联合survivin RNA干扰诱导肺腺癌细胞凋亡

目的：探讨可溶性FasL（sFasL）联合survivin RNA干扰对肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法：构建survivin特异RNA小干扰表达载体，DNA测序，转染A549细胞。G418（geneticin）筛选稳定表达survivin RNA小干扰细胞株，荧光实时定量RT-PCR、免疫印迹（Western blot）和免疫组化法检测survivinm RNA和蛋白表达。sFasL作用于转染后细胞，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测细胞活性和凋亡率。结果：成功构建survivin-siRNA表达载体，筛选出稳定表达单克隆细胞。SurvivinmRNA和蛋白表达分别下降76．4％（P〈0．01）和84．5％，免疫组化也显示survivin下调。sFasL联合survivinRNA干扰细胞，光密度值在各时间点较siRNA组、sFasL组和对照组均明显降低（P〈0．01），抑制率增加；凋亡率较siRNA组、sFasL组和对照组明显增加（P〈0．01）。结论：SurvivinRNA干扰表达载体可降低survivin的表达。sFasL联合survivinRNA干扰较单用sFasL或survivin RNA干扰能更有效地抑制肺腺癌细胞A549增殖，促进凋亡。