乳腺癌干细胞的富集及相关基因表达

目的 通过微球体培养富集乳腺癌干细胞,并检测其相关基因的表达. 方法 将MCF-7乳腺癌细胞进行第一代微球体培养,7 d后消化微球体获得单细胞悬液,取部分细胞进行第二代微球体培养,另一部分细胞则在胶原底物进行分化培养.于培养第11天收集第二代微球体细胞、分化细胞,采用流式细胞术进行干细胞比例分析;同时应用Real-time PCR技术检测β-catenin、CXCR4、SOX2、ALDH3A1 mRNA 表达. 结果 流式细胞分析显示,微球体细胞和分化细胞的侧亚群细胞比例分别为(7.36±0.54)%和(4.32±0.42)%(P<0.05),CD55high比例分别为(17.41±1.09)%和(4.47±0.33)%(P<0.05).Real-time PCR检测结果表明,微球体细胞与分化细胞相比,β-catenin、CXCR4、SOX2及ALDH3A1 mRNA表达分别上调了约1.5、5.0、4.0和5.7倍(P<0.01). 结论 微球体细胞富集了较高比例的乳腺癌干细胞,且β-catenin、CXCR4、SOX2、ALDH3A1 mRNA呈现高表达.     

乳腺癌干细胞的培养及鉴定

目的从乳腺癌患者的肿瘤组织中获得乳腺癌干细胞,并确定其生物学特性。方法收集乳腺癌患者的肿瘤组织,利用乳腺球悬浮培养法获得乳腺球细胞。用流式细胞仪检测细胞CD44以及CD24的表达,用Western印迹法检测细胞ALDH1,ESA以及Oct4的表达。将2×104、2×105和2×106三种细胞数的原代乳腺球囊细胞及贴壁细胞分别接种到NOD/SCID鼠的脂肪垫,观察其成瘤能力和肝肺转移情况。结果利用乳腺球悬浮培养的原代乳腺癌细胞中有62.36%呈CD44+/CD24-/low表型,且肿瘤干细胞标记物ALDH1,ESA以及Oct4的表达高于贴壁培养的原代乳腺癌细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。与贴壁细胞相比,悬浮培养富集的原代球囊细胞均有更强的成瘤和肝肺转移能力。结论利用乳腺球悬浮培养法可以从人乳腺癌组织中获得乳腺癌干细胞。     

乳腺癌干细胞标志物及乳腺癌干细胞治疗策略

乳腺癌干细胞(BCSCs)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞,在一定条件下可以分化成多种功能性细胞,对乳腺癌的发生具有始动作用。临床常规的放射治疗、化学治疗不能有效杀死BCSCs,并且因其具有高致瘤性、转移性、耐药性等特点,成为乳腺癌治疗失败和复发转移的根源。因此,探讨BCSCs的生物学特性和表型特征,有助于寻找有效靶向BCSCs的治疗技术和策略,从而提高乳腺癌的临床治疗效果。本文就BCSCs的标志物及其治疗方面的新进展进行综述。     

乳腺癌细胞凋亡及相关基因表达的预后研究

目的 对细胞凋亡及其相关基因在乳腺癌预后中的作用,以及它们的表达水平与乳腺癌生物学行为的关系进行研究。方法 运用ＴＵＮＥＬ法、免疫组化检测乳腺癌组织细胞凋亡水平以及凋亡相关基因ｂｃｌ－２、ｂａｘ、ｐ２７＾ｋｉｐｌ表达。结果 ９１例乳腺癌病例中,５６／９１（６１．５％）的病例凋亡指数较高,３５／９１（３８．５％）凋亡指数较低;ｂｃｌ－２高表达占２９．７％（２７／９１）,ｂａｘ高表达占３０．８％（２８     

乳腺癌干细胞研究进展

研究乳腺癌干细胞的自我更新及分子机制对于后期乳腺癌的治疗具有重要意义。本文对乳腺癌干细胞的发现与鉴定及临床应用等相关方面做了简要概述：乳腺癌细胞中有一群具有干细胞特性的细胞,这群细胞具有自我更新、多向分化等特点,同样也是乳腺癌复发及转移的主要原因;针对乳腺癌干细胞的靶向治疗是预防乳腺癌复发及转移的有效途径。     

乳腺癌干细胞在无血清培养基K-SFM中的有效富集

摘要:CD24+/CD24-已被证实是乳腺癌干细胞的标记,该群细胞具有致瘤性、克隆形成及转移潜能。但在癌组织中或细胞系中含量极小,对其有效分离及纯化方法的缺乏已成为研究干细胞的主要障碍。本研究应用改良的无血清培养基K-SFM能在乳腺癌原代细胞及已建立的乳腺癌细胞系中体外有效富集CD24+/CD24-细胞群,对乳腺癌干细胞相关基因的检测显示Oct-4、ABCG2、Nanog和N-cadherin显著上调,而E-cadherin显著下调。 方法 1．乳腺癌细胞系培养 人乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR-3在含20 ng/ml 表皮生长因子(EGF; R and D Systems, Minneapolis, MN), 5 μg/ml 胰岛素, 0.4% 牛血清白蛋白 (Sigma, St. Louis, MO) 的K-SFM无血清培养基中培养,对照组为含10%小牛血清RPMI 1640培养基培养。37˚C、5%二氧化碳浓度下,恒湿培养箱培养。 2．乳腺癌组织标本原代培养 乳腺癌标本在离体30分钟内获取,进行机械分离,部分需酶消化。用30μm 柱状微孔过滤,制成单细胞悬液,以1000个/ml分别于RPMI-1640全培养基和K-SFM无血清培养基中培养。培养方法同上。 3．流式细胞分析与分选 收集上述方法培养的细胞系以及原代培养细胞,通过流式检测乳腺癌干细胞分子标记CD44+/CD24-/low,确定培养方法对于富集干细胞的有效性。同时通过荧光分选 (FACS),富集CD44+/CD24-/low样细胞制成单细胞悬液。 4．定量RT-PCR分析 收集流式细胞仪分选的K-SFM无血清培养基中细胞及对照分化细胞,提取RNA,通过实时定量 RT-PCR检测干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin的表达,以GAPDH作为内参。 结果 在MCF-7细胞系观察到微球体的形成,制成单细胞悬液,应用乳腺癌干细胞表面标记CD44+/CD24-/low标记,经流式细胞仪分选发现MCF-7中干细胞标记细胞占17.3%,较含血清培养基中干细胞比例（0.5%）增加了34.6倍;而 SKBR-3干细胞比例占17.4%,较对照组（0.9%）高28倍。且实时定量 RT-PCR检测显示该群细胞大量表达干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin。在人乳腺癌组织作原代培养也得出相似结论。     

乳腺癌干细胞相关miRNA的高通量筛选及miR-25介导自噬对乳腺癌干细胞的调控作用

目的探讨乳腺癌干细胞相关微RNA(miRNA)的高通量筛选及miR-25介导自噬对乳腺癌干细胞的调控作用。方法以MDA-MB-231乳腺癌干细胞为研究对象,通过干细胞成球实验、高通量芯片检测、生物信息学分析、乙醛脱氢酶(ALDH)流式检测、实时自噬活性监测及自噬相关蛋白表达的检测明确miRNA如何通过介导自噬影响乳腺干细胞自我更新能力。结果 miRNA微阵列芯片共筛选出131个差异miRNA,其中56个上调miRNA,57个下调miRNA。与非乳腺癌干细胞相比,一部分miRNA在乳腺癌干细胞上低表达,其中miR-25的表达在乳腺癌干细胞内显著下调约41%。差异的miRNA按照5个数据库(miRWalk、miRanda、miRDB、RNA22和Targetscan)来预测其靶基因,共获得4 565个靶基因。与紫杉醇单药组相比,紫杉醇联用3-甲基腺嘌呤或氯喹均导致成球直径缩小近1/2[(254±16)μm、(226±38)μm比(494±44)μm](均P <0. 05)。与空白对照组相比,紫杉醇组的微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ表达水平升高且p62表达水平降低;与Nc+紫杉醇组相比,Mimics+紫杉醇组的UNC-51样激酶1蛋白表达明显降低。结论 miR-25可能是介导自噬活性与乳腺癌干细胞之间的重要信号分子,其表达异常可能与其启动子区域DNA甲基化调控有关。     

成球培养法富集胰腺癌肿瘤干细胞的研究

目的研究成球培养法培养胰腺癌肿瘤干细胞的可行性。方法通过细胞成球培养体系富集胰腺癌肿瘤干细胞并进行培养,流式细胞术检测分析干细胞的表型特征。结果光镜下,成球培养细胞形态发生明显变化,细胞由贴壁时的多边形变成圆形,并形成肿瘤细胞微球。流式细胞仪检测发现,与普通细胞培养相比,成球培养体系富集的胰腺癌肿瘤干细胞干性相关基因CD24、CD44共表达水平明显升高。结论利用成球培养法能够富集得到CD24、CD44高表达的胰腺癌肿瘤干细胞。     

化疗后乳腺癌组织中干细胞微球体的分离、培养及鉴定

目的：对从接受新辅助化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织中分离出的化疗微球体（CMSs）进行培养和鉴定,为获取乳腺癌干细胞的新方法的建立提供理论依据。方法：①将获得的CMSs接种在添加生长因子的DMEM/F12培养基中,观察CMSs的生长情况;②通过单克隆形成实验检测化疗微球体细胞(CMSDCs)的克隆形成和自我更新能力;③CMSDCs贴壁培养在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,观察其分化能力;④免疫细胞化学检测CMSDCs及其分化细胞CK14、CK18和CK19的表达;⑤流式细胞术（FCM）检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+细胞的含量;⑥ 构建NOD/SCID小鼠移植瘤模型,观察CMSDCs的致瘤能力。结果：CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长,3 d后球体表面出现坏死的细胞层;CMSDCs可以连续传代形成新的CMSs,新生球体折光性强,表面无坏死层;在添加血清的培养基中的CMSDCs可以分化产生梭形的单层细胞;CMSDCs表达乳腺干细胞标记物CK19,不表达分化标记物CK14和CK18;CMSDCs和分化细胞中ALDH1+细胞的比例分别为为17.41%～23.57%和0.50%～1.28%;103个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠体内形成与原发肿瘤性质相同的移植瘤。结论：CMSs富含乳腺癌干细胞,与悬浮培养所获得的乳腺癌干细胞微球体类似,提示从化疗后的乳腺癌组织中分离癌干细胞微球体可能成为乳腺癌干细胞获取的新途径。     

胚胎干细胞系向造血干细胞定向分化的研究

目的：建立并稳定和优化诱导胚胎干细胞（ES）向造血干细胞定向分化的方法。方法：应用体外胚胎干细胞分化系统,观察了多种因素对原始细胞成集落细胞（BLast Colony-Forming,Cell,BL-CFC)形成集落的影响。结果;植入不同数量的3.5d胚体衍生的细胞与BL－CFC集落生成数量之间呈高度相关,大约每植入100个3.5d胚体衍生的细胞,能生成1.08-1.2个BL－CFC集落;20％与30％浓度的D4T条件培养液促BL－CFC集落生成作用的效率最高 ;单用D4T条件培养液,EPO或KL对BL－CFC集落的生长无明显促进作用（P＞0．05）;但单用VEGF对BL－CFC集落的生成有极显著的促进作用（P＜0．001）。但当这四种因素两两组合使用时,均比单用VEGF具有明显的促BL－CFC集落生成作用。在VEGF＋KL＋D4T合用的基础上加用EPO,则促BL－CFC集落生成作用大大增强,与其它各组,BL-CFC集落数极显著地增多（P＜0．001）。大约每植入100个3.5d胚体衍生的细胞,能生成1.5-1.6个BL－CFC集落。结论：影响BL－CFC生长的主要因素可能为VEGF;D4T条件培养液具有强大的协同作用;EPO和KL为诱导BL－CFC向造血细胞系分化的主要因素;3.5d胚体衍生的细胞比3.25d胚体衍生的细胞对各种刺激因子反应更敏感,生成BL－CFC的能力更强。原始细胞成集落细胞实验（BL－CFC）可能代表了最原始造血干细胞的检测方法。     

Enrichment of breast cancer stem cells using a keratinocyte serum-free medium

Background  Keratinocyte serum-free medium (K-SFM) is a defined medium used to support the growth of primary keratinocytes and embryonic stem cell. The aim of this research was to optimize enrichment of breast cancer stem cells (CSCs) using K-SFM.

Methods  A K-SFM was used to enrich CSCs from two breast cancer cell lines and a primary culture of breast cancer. RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) was used as a control. CSCs were identified with flow cytometry using CD44⁺/CD24^– as molecular markers. The expression of a variety of CSC markers (Oct-4, ABCG2, Nanog, N-cadherin, and E-cadherin) was analyzed with real-time PCR.

Results  Much higher percentage of CSCs was achieved with K-SFM: 17.3% for MCF-7 cells, 17.4% for SKBR-3, and 20.0% for primary breast cancer culture. Less than 1% CSC was achieved using RPMI-1640 supplemented with 10% FCS. In comparison to the CSCs obtained with RPMI-1640, CSCs in the K-SFM expressed higher levels of Oct-4, ABCG2, Nanog and N-cadherin, and lower level of E-cadherin.

Conclusion  K-SFM is an optimal culture medium to maintain and to enrich breast CSCs.

     

MicroRNAs in breast cancer and breast cancer stem cells and their potential for breast cancer therapy

The discovery of the first miRNA,lin-4,in Caenorhabditis elegans initiated a new era of miRNA biology.Since then,thousands of miRNAs have been identified and annotated,many of which have been shown to play roles in a variety of biological processes,including development,differentiation,apoptosis,proliferation,and cell death.1 Furthermore,growing evidence indicates that miRNA deregulation is a critical cause of cancer formation.The biogenesis,function,and potential application of miRNAs have become active areas of research.With the development of molecular biological technologies,such as northern blotting with radio-labeled probes,cloning,quantitative PCR,serial analysis of gene expression (SAGE)-based techniques,bead-based profiling methods,and oligonucleotide microarrays,2 it is possible to conduct miRNA research precisely and comprehensively.     

E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用

目的研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B--OLV)对乳腺癌干细胞的作用。方法E1B--OLV感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞(实验组),常规培养MCF-7细胞作为对照组。两组细胞分别行流式细胞仪(FCM)分析CD44 CD24-细胞的表型比例。两组细胞同时行微球体培养,观察微球体形成的大小及数量,计算微球体形成率(MFE),用FCM分析微球体CD44 CD24-细胞的比例。结果实验组MCF-7细胞的CD24-、CD44 和CD44 CD24-比例分别为43.90%、63.26%和22.19%,对照组为6.74%、88.30%和2.30%。实验组中微球体成球时间早于对照组,球体体积大于对照组,MFE高于对照组(1.26%和0.9%);实验组和对照组微球体中CD44 CD24-细胞的比例分别为38.08%和23.35%。结论ElB--OLV在短期内杀死MCF-7细胞,但主要是乳腺癌分化细胞,可能促进了乳腺癌干细胞的生长,加快了其自我更新和分化速率。     

基于基因芯片的乳腺癌干细胞miRNAs检测分析

目的 利用流式细胞仪(FACS)细胞分选技术从乳腺癌细胞株MCF-7中分选乳腺癌干细胞,并利用基因芯片进行其miRNAs表达谱分析.方法 利用已知的乳腺癌干细胞的表面分子标志(CD44 ESA CD24-/low),以相应的荧光标记抗体对细胞加以标记,FACS细胞分选获得乳腺癌干细胞,NOD-SCID移植瘤实验进行干细胞功能鉴定;分别提取细胞总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNAs基因芯片杂交,获得乳腺癌干细胞miRNAs表达谱.结果 从MCF-7中分选到约1%的CD44 ESA CD24-/low细胞,NOD-SCID移植瘤实验表明其具有干细胞特性,基因芯片杂交获得20个乳腺癌干细胞相关miRNAs,其中4个为低表达,16个为高表达.结论 乳腺癌干细胞具有自身特征性miRNAs,为进一步从干细胞层面研究乳腺癌发病机制及靶向治疗打下基础.     

磁探针标记乳腺癌干细胞的实验研究

目的 研究超顺磁性氧化铁(superparamgnetic iron oxides,SPIOs) 标记乳腺癌干细胞及其生物学特性.方法 乳腺癌干细胞分离、鉴定及培养;用Feridex(一种SPIOs)标记乳腺癌干细胞,制备磁标记乳腺癌干细胞;利用MTT、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记的乳腺癌干细胞生物学特性进行研究.结果 在原代培养的乳腺癌细胞中分离出乳腺癌干细胞.Feridex与乳腺癌干细胞共同孵育后,Prussian blue染色及透射电镜均显示乳腺癌干细胞胞浆中含有氧化铁颗粒.随Feridex浓度的增高(15～25μg/mL),Feridex对乳腺癌干细胞存活、繁殖能力的影响差异无统计学意义(P>0.05).当Feridex的浓度大于35μg/mL时,影响其存活和繁殖(P<0.05).结论 本实验利用Feridex作为磁标记探针,对乳腺癌干细胞进行成功磁标记,为进一步利用核磁共振(MRI)对乳腺癌干细胞活体追踪奠定实验基础.     

人乳腺癌MCF-7细胞系中肿瘤干细胞的富集与鉴定

采用无血清培养液(SFM)悬浮细胞聚球法体外培养人乳腺癌MCF-7细胞系,第5、10、15天拍照,观察干细胞球的生成。悬浮培养第5天可以开始观察到悬浮细胞球形成,细胞球形成效率为(0.6±0.5)%,第10天时细胞球形成效率为(2.4±1.2)%,比第5天时明显增多,培养第15天时细胞球形成效率达到(3.8±1.8)%,MCF-7悬浮成球细胞中侧群细胞(SP)细胞含量为(3.9±1.4)%,高于常规培养的MCF-7贴壁细胞(1.1±0.5)%(P<0.05),采用无血清悬浮细胞聚球培养法可以从MCF-7细胞系中简便、高效地富集乳腺癌干细胞。     

曲古菌素A抑制乳腺肿瘤干细胞的自我更新

目的研究组蛋白乙酰化酶抑制剂曲古菌素A对乳腺肿瘤干细胞自我更新的影响;初步研究其抑制乳腺肿瘤干细胞自我更新的机制。方法悬浮培养乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7和SKBR3,用不同浓度曲古菌素A处理悬浮培养乳腺癌细胞7 d,用0.1%DMSO作对照;用次级细胞球形成率和乳腺癌细胞初级细胞球细胞中肿瘤干细胞即CD44+/CD24-细胞群的百分比评价曲古菌素A对乳腺癌干细胞自我更新的影响;乳腺癌细胞初级细胞球细胞中CD44+/CD24-细胞群的百分比用流式细胞仪检测,凋亡细胞百分比用Annexin-V法在流式细胞仪检测,Nanog、Sox2和Oct4 mRNA的表达用定量PCR法检测。结果100 nmol/L和500 nmol/L曲古菌素A均能部分抑制4个乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞的自我更新,但10 nmol/L不行;500 nmol/L曲古菌素A诱导乳腺癌细胞初级细胞球细胞凋亡;曲古菌素A能下调乳腺癌细胞初级细胞球细胞Nanog和Sox2 mRNA的表达。结论曲古菌素A能部分抑制乳腺癌干细胞的自我更新,其机制与其能下调乳腺癌初级细胞球细胞Nanog和Sox2表达相关联,提示临床可用低浓度组蛋白乙酰化酶抑制剂和其他抗癌药物联用以便获得较好的乳腺肿瘤干细胞自我更新抑制效果,胚胎干细胞核心转录因子Nanog和Sox2可能作为肿瘤治疗的新靶标。