抗体人源化技术研究进展

人源化单克隆抗体已日益广泛地应用于治疗以肿瘤为主的多种疾病.重组DNA技术使鼠源抗体的人源化改造得以实现.此文对抗体人源化技术的发展及面临的问题进行综述.     

人源化改形抗体研究进展

随着鼠源单克隆抗体在临床治疗中越来越广泛的应用，降低抗体免疫原性的要求也变得越来越迫切。目前已经发展了三种降低抗体免疫原性的技术，包括嵌合抗体、人源化改形抗体和人类噬菌体抗体库技术。构建人源化改形抗体需要先选定模板并确定需要保留的鼠源残基，可供选择的模板有两种形式，孰优孰劣尚无定论；但在确定保留残基方面已初现规律，现已可以脱离计算机分析而直接进行。随后的工作只是根据设计构建基因进行表达。本综述在选     

人源化改形抗体研究进展

随着鼠源单克隆抗体在临床治疗中越来越广泛的应用,降低抗体免疫原性的要求也变得越来越迫切。目前已经发展了三种降低抗体免疫原性的技术,包括嵌合抗体、人源化改形抗体和人类噬菌体抗体库技术。构建人源化改形抗体需要先选定模板并确定需要保留的鼠源残基,可供选择的模板有两种形式,孰优孰劣尚无定论;但在确定保留残基方面已初现规律,现已可以脱离计算机分析而直接进行。随后的工作只是根据设计构建基因并进行表达。本综述在选定模板、确定保留残基和构建基因三个方面进行了简要的论述和回顾,重点论述了如何确定需要保留的残基,并对人源化改形抗体的前景进行了展望。     

抗肿瘤人源化抗体药物的研究进展

随着单克隆抗体技术的发展,治疗性抗体药物逐渐占据全球市场,主要应用于肿瘤治疗、抗移植排斥、自身免疫性疾病的治疗等。抗体药物可根据人源化程度不同,分为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。本文着眼于目前治疗性抗体药物研究热点,聚焦于抗肿瘤人源化抗体药物,结合已上市热点抗肿瘤人源化抗体药物实例,从抗体人源化技术以及人源化抗体生产的角度来阐述目前研究状况。同时,立足于国内外抗肿瘤人源化抗体药物的现状,分析未来发展趋势。     

人源化肝癌抗体研制应用前景的分析

非手术治疗是肝癌治疗的重要方面 ,放疗与化疗由于治疗药物对肿瘤组织特异性差 ,对肿瘤外组织有很大的毒副作用 ,经放疗或化疗后的患者生活质量受到很大影响 ,甚至可能会危及生命。肝癌的生物治疗尤其是特异性抗体的针对性治疗成为人们日益关注的焦点。但是从 1975年开始研制了近 2 0年的鼠源性的抗体并不能有效的激发人类效应器的功能 ,却会引发人抗鼠抗体的形成 ,从而引起严重的副反应。DNA重组技术的应用为解决免疫导向存在的问题提供有效的技术手段。鼠单抗人源化与噬菌体人抗体库技术为肝癌治疗提供了新的方法和策略。而国内用于肿瘤治疗的单抗产品均为鼠源或人源化鼠抗体 ,人源抗体的研究还处于初期阶段 ,无相关产品问世 ,而美国FDA从 2 0 0 1年起已不再批准非人源抗体用于人体的临床试验。从发展趋势看 ,人源抗体的研制将会迅速占领市场 ,采用噬菌体抗体库技术研制人源肝癌治疗性抗体将会有良好的应用前景     

人凝血因子Ⅷ在基因工程中的研究进展

目的：因原料血浆不足,作为治疗血友病A的唯一有效用药人凝血因子Ⅷ资源短缺,而运用基因工程生产的重组人凝血因子Ⅷ能很好的解决这些问题。本文从人凝血因子Ⅷ的结构改造、载体及表达系统、基因治疗和前沿基因编辑技术的应用等几个方面对FⅧ在基因工程中的研究进行总结及展望。     

抗体文库展示技术在抗体新药开发中的应用

1975年,Kohler和Milstein将分泌抗体的B细胞和骨髓瘤细胞融合,用杂交瘤细胞培养生产单克隆抗体[1]。随后,1986年,美国食品药物管理局（FDA）批准了第一个用于治疗的单克隆抗体[2],一种定位于人类的CD3的鼠源抗体。由于鼠源抗体具有免疫原性,导致在人体内迅速地被清除,从而表现为低效率治疗效果,高风险的输液反应,因此,     

未来十年生物医药开发热点--基因工程药物等

本刊讯在日前举行的21世纪医药国际学术大会暨2004上海国际生物技术与医药研讨会上,中外学者纷纷指出,基因工程药物(蛋白类药物)、人源化治疗性单克隆抗体药物、现代中药以及基因治疗技术,将成为未来10年国际生物医药研究开发领域的热点。中国科学院副院长陈竺院士、上海市现代生物与医药产业办公室主任李逸平博士、美国耶鲁大学郑永齐教授、耶鲁大学大卫沃德教授、国家新药筛选中心主任王明伟,以及哈佛大学的专家认为,虽然化学合成药物在今后很长一段时间内仍然是疾病治疗的主导产品,但随着生命科学技术的迅速发展,基因工程药物、抗体药物…     

应用抗体"框架重塑"技术构建人源化抗体fSM03

目的：应用抗体“框架重塑”（framework-reengineering）技术构建人源化抗体iSM03。方法：互补决定区（CDRs）克隆来源于嵌台抗体SM03；VL框架FR1，FR2，FR3和FR4分别优选自人源基因JOH，Vd’CL，WES和RZ；VH框架FR1，FR2，FR3和FR4优选自人源基因WAS，WAS，GAL和DOB，无须涉及任何鼠源残基的回复突变。分别合成轻链表达载体pEk及重链表达载体pEγ，转染宿主细胞SP2／O。结果：fSM03保持了原有亲本抗体的功能特性，如CD22特异性和亲和力、细胞内化以及淋巴瘤细胞毒效应等。结论：应用框架重塑技术成功构建了人源化抗体fSM03，无须引入新的鼠源残基，较CDRs移植更为简便灵活。     

治疗性抗体药物研究与发展趋势

单克隆抗体技术的问世,使研究和生产治疗性单抗药物成为现实.随着基因工程技术的发展,新型的重组抗体技术也随之而生.人们可以利用DNA重组技术对鼠源抗体进行人源化改造、构建合成或半合成抗体库及噬菌体抗体库,从中筛选获得人源抗体,甚至利用转基因小鼠直接获得人源抗体.抗体药物发展的趋势也从鼠源、人一鼠嵌合、人源化到全人源.近年...     

人源化抗体CDP571在克罗恩病中的疗效观察

目的:评价抗人TNF-a抗体CDP571治疗活动性克罗恩病的效果。方法:共有395名严重克罗恩氏病的患者参加研究。在28周的随机临床对照试验中,患者每8周接受一次静脉内CDP 571(10mg·kg-1)注射或安慰剂至第24周为止。观察指标是第28周时的临床缓解(克罗恩病活动指数CDAI下降>100)或临床应答(CDAI<150)率,和第2,4,8,12,16,24周时的临床应答、缓解率(同样的标准)。结果:第28周时,263例CDP571组患者中80例(30.4%)产生临床缓解,132例安慰剂组患者中31例(23.5%)产生缓解(P=0.102)。第2周时,CDP571组患者中90例(34.2%)产生临床缓解,安慰剂组患者中28例(21.2%)产生缓解(P=0.011)。对159例初始C反应蛋白(CRP>10mg·L-1)的患者进行Post-hoc检测亚群分析证明了CDP 571和安慰剂2组临床缓解率差别有统计学意义:第2周时,CDP 571组为50/101(49.5%),安慰剂组为9/58(15.5%),P<0.001;第28周时,CDP 571组为29/101(28.7%),安慰剂组为7/58(12.1%)(P=0.018)。结论:在活跃的克罗恩病患者中,CDP571短期治疗有一定疗效,而长期疗效目前尚不明确。通过Post-hoc分析显示CRP(C反应蛋白)基线水平较高(大于10mg·L-1)的患者,短期和长期应用CDP 571疗效好,同时CDP 571毒副作用较小。     

一种新型靶向Frizzled7抗体的筛选及其人源化设计

目的:获得一种新型靶向人Frizzled7(Fzd7)蛋白的人源化抗体。方法:首先用重组人Fzd7蛋白(rh Fzd7)免疫BALB/c小鼠,获得鼠源抗Fzd7抗体(SHH002),并用生物膜层干涉技术(biolayer interferometry,BLI)检测SHH002的亲和力;测序获得SHH002可变区序列(V区),通过与Human Germline序列库比对选择人源化设计模板,利用Discoverystudio软件对SHH002进行人源化设计,获得人源化抗Fzd7抗体SHH002-hu,并对SHH002-hu的纯度和亲和力进行验证,最后通过MTT实验初步验证其抗肿瘤活性。结果:杂交瘤筛选技术获得高亲和力(亲和力常数KD <1. 0×10-12mol·L-1)鼠源抗Fzd7抗体SHH002; SHH002 V区序列比对Human Germline序列库,选择同源性最高的IGHV1/IGKV1作为人源化设计模板,保留对抗体结构稳定性起关键作用的鼠源氨基酸,将非关键的位点突变为人源氨基酸,获得人源化程度高达98%的人源化抗体SHH002-hu;分子排阻色谱(SEC-HPLC)...     

超大容量非免疫人源性Fab抗体库的构建

目的构建超大容量非免疫人源性Fab抗体库。方法通过RT-PCR从208名不同人的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库。结果成功地构建了库容量为2.6×1012的人源性Fab段噬菌体抗体库。结论新的噬菌体抗体库对筛选不同抗原位点的抗体,提供有用的资源。     

食管癌人源噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建全人源化食管癌噬菌体单链抗体库,从中筛选Eca-109细胞特异性单链抗体。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取总RNA,用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段,再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker,用SOE-PCR技术将后者组装成scFv,再引入酶切位点SfiI和NotI。将scFv基因克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E后电转入EcoliTG1,经抗体表达的辅助噬菌体M13KO7超感染,构建单链抗体库。PCR鉴定阳性重组菌EcoliTG1中scFv的插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果。从该抗体库中筛选特异性识别Eca109细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化EcoliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS-PAGE、West-ern blot鉴定,通过ELISA法、免疫组化法、免疫细胞化学鉴定其与人食管癌细胞的结合的特异性。结果食管癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带;VH基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的scFv基因约为850bp。用pUC18标准质粒测定转化效率达到108cfu.μg-1。scFv的阳性插入率为91.7%(22/24)。在筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体分子量为30ku左右,在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅食管癌组织着色,而肝癌、胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使食管癌细胞Eca109染色。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论从食管癌病人癌肿周围淋巴结成功地构建人源食管癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到食管癌特异性抗体。     

抗人CD40单克隆抗体的筛选及其人源化抗体的抗肿瘤活性评价

CD40激动型抗体在治疗恶性肿瘤方面具有巨大的潜力,但其疗效和安全性仍有欠缺。该研究通过杂交瘤技术筛选到2株高结合力、高亲和力的激动型抗CD40单克隆抗体(31A2-2、42D11-8),对其进行人源化改造,并采用NPG小鼠移植瘤模型研究其药效。结果显示,改造后的抗体经测定仍具有较高的结合力和亲和力,在树突状细胞激活试验中显示出较强的激活能力,可刺激树突状细胞激活并释放IL-12。2株抗体在NPG小鼠体内均具有显著的抗肿瘤效果,肿瘤生长抑制率分别达到86.83%、87.95%。该研究为CD40激动型药物的开发提供了数据支持。     

食蟹猴静脉注射抗HER2人源化抗体急性毒性研究

目的 评价抗HER2 人源化抗体的急性毒性。方法 将食蟹猴随机分为4 组,包括溶媒对照和抗HER2 人源化抗体75、150 和250 mg/kg 组,单次iv 溶媒对照组或供试品,进行各项毒理学指标检测。结果 给药后各组动物临床症状、体质量、摄食量、体温、心电图、血压和血液学检测均未见明显异常;血清生化结果显示,150 mg/kg 组与250 mg/kg 组动物给药后血清IgG 水平出现一过性增加;各组动物均未见大体病理学改变。结论 食蟹猴单次iv 抗HER2 单抗,总体上动物具有良好的耐受性,最大耐受剂量可达250 mg/kg,这些结果为进一步临床前评价抗HER2 人源化单克隆抗体的安全性奠定了基础。     

EMEA警告重组人凝血因子Ⅶ产生抗体的风险

欧洲药品监督管理局（EMEA）警告患者和医疗专业人员，一些曾经用过重组人凝血因子Ⅷ治疗A型血友病的患者产生了针对此凝血因子的抗体，结果导致出血不能得到有效控制。     

重组人干扰素-β1b对恒河猴免疫原性的影响

目的:研究重组人干扰素-β1b(rhIFN-β1b)对恒河猴的免疫原性及其对疗效的潜在影响.方法:实验分溶剂对照组及rhIFN-β1b低、中、高剂量组,分别皮下注射1.25%人血清白蛋白0.36mL·kg-1及rhIFN-β1b 4.0×106,1.2×107及3.6×107IU·kg-1,连续90d.血清结合抗体测定采用ELISA法,中和抗体测定采用细胞病变抑制法.结果:给药3周后,3个给药组动物均出现rhIFN-β1b结合抗体,4周后抗体滴度达最大值,不同剂量组间在结合抗体滴度方面未见明显的剂量-反应关系.同时,给药3周后血清中出现中和抗体,以后抗体滴度逐步升高.停药30d后,中和抗体滴度逐渐降低.结论:恒河猴重复给予rhIFN-β1b后,体内产生结合抗体和中和抗体,但给药组动物未观察到明显的病理学和生化指标异常,提示该生物制品重复使用是安全的.     

人源抗体的研究进程及其在控制病毒感染中的作用

多年来,研究人员一直在研究单克隆抗体在病毒性疾病中的临床应用。由于鼠源单克隆抗体可能会引发患者的免疫反应,降低其疗效,故研究人员相继开发了嵌合抗体、改型抗体、噬菌体抗体及利用基因工程方法改造植物和动物产生人源抗体以应用于临床治疗。人源抗体在控制多种病毒感染性疾病方面已取得一些进展,并将发挥重要作用。     

注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白的耐受性

目的研究注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白(CTLA4-Ig,抗类风湿关节炎药)在健康志愿者体内的耐受性和安全性。方法随机选择健康志愿者27例,分别单次静脉滴注CTLA4-Ig 1、10、20 mg·kg~(-1),动态观测健康志愿者用药后的血、尿常规、血沉、心电图检查、胸片检查、血液生化检查等。结果各组受试者体检及实验室检查各项指标均在正常范围。给药后,生命体征和实验室检查均未见有临床意义的改变,试验中未见严重不良反应发生。结论单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1～20 mg·kg~(-1)对人体是安全的,耐受性良好。