骨髓间质干细胞体外预构组织工程化肌腱的实验研究

目的 探讨骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性，为构建组织工程化肌腱寻求理想方法。方法 以贴壁法分离、培养骨髓间质干细胞，并检测CD44。在实验组中将骨髓间质干细胞置入含胶原-聚羟基乙酸的DMEM培基中培养；在对照组中将骨髓间质干细胞置入DMEM培基中培养。通过MTT方法比较两组的细胞活性和生长情况，并对实验组进行超微观察。以骨髓间质干细胞为种子细胞，以胶原-聚羟基乙酸为支架在体外预构组织工程化肌腱。结果 以贴壁法原代培养骨髓间质干细胞，11天细胞即汇合成片，检测CD44示阳性。骨髓间质干细胞接种于胶原一聚羟基乙酸中混合培养后14天生长良好，始终保持89％VA上的细胞活力，与对照组比较无显著差别；实验组细胞数未发生明显改变．而对照组从第4天开始即发生增殖。透射电镜示实验组细胞培养14天后仍保持旺盛的分泌功能。体外预构的组织工程化肌腱具有良好的形态，细胞伸展成梭形，沿聚羟基乙酸缝线大致平行排列。结论 骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性好。以骨髓间质干细胞为种子细胞，以胶原-聚羟基乙酸为支架可在体外初步预构组织工程化肌腱。     

兔骨髓间质干细胞组织工程化肌腱模型的构建

目的通过体外细胞培养和贴壁筛选法将骨髓间质干细胞由骨髓中分离纯化，以工型胶原-聚羟基乙酸（PGA）为支架构建组织工程化肌腱。方法提取骨髓，通过离心和贴壁筛选培养获取骨髓间质干细胞，将骨髓间质干细胞进行分离、扩增，未经体外诱导即接种于胶原-PGA支架中，回植于跟腱缺损部位，借助体内微环境中细胞因子的作用，完成肌腱的重建与再塑形。结果获得重建的组织工程化肌腱组织。结论以骨髓间质干细胞为种子细胞，以工型胶原-聚羟基乙酸为支架构建组织工程化肌腱，为解决肌腱损伤、缺损提供新的思路。     

体外兔骨髓间质干细胞成软骨潜能实验研究

目的 :探讨兔骨髓间质干细胞体外软骨样分化的诱导条件及影响因素。方法 :抽取新西兰大耳白兔骨髓于DMEM培养液中单层培养、扩增。用 2～ 3传代细胞按一定比例种植于 6孔板中。调整培养液 ,并加入TGF～β ,地塞米松 ,多聚赖氨酸等诱导因子。于不同时间点取材固定 ,甲苯胺兰染色鉴别。结果 :在本实验条件下 ,原代培养的兔MSC细胞于 10～ 14d铺满单层。传代培养后 ,细胞增殖旺盛 ,仍能保持干细胞的形态特点 ,而第 5代细胞增殖缓慢。选用传 2～ 3代的MSC在成软骨剂作用下 ,于d4发生形态变化 ,由梭形变为圆形。分泌细胞外基质 ,甲苯胺兰变色反应阳性。TGF - β为 5ng/ml效果显著。结论 :在本实验条件下 ,获取的兔骨髓间质干细胞生长稳定、增殖快、能定向性发生软骨样转化 ,可作为软骨组织工程学研究的种子细胞     

大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外诱导分化为成骨细胞的模型。方法：分离大鼠骨髓间质干细胞进行体外培养，观察其生物学特性。并选用一定的诱导剂诱导成骨细胞，通过形态学变化、碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，成骨细胞诱导后MSC细胞形态由长梭形向多边形转变，ALP染色阳性，Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。结论：大鼠骨髓MSCs体外能被诱导分化为成骨细胞，为骨组织工程研究的优良种子细胞。     

犬骨髓间质干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的建立骨髓间质干细胞体外诱导分化心肌细胞的方法。方法犬骨髓液10ml通过密度梯度离心法分离出间质干细胞,间质干细胞用5-氮胞苷诱导培养3～4周,进行心肌细胞特异性标志物测定及细胞超微结构的观察。结果犬骨髓间质干细胞经5-氮胞苷诱导培养3～4周后,免疫组化显示肌细胞特异性蛋白α-actin、Myosin、TropninⅠ阳性,心肌特异性肌钙蛋白I阳性。电镜观察细胞呈梭形,可见细胞肌丝与房性颗粒。结论密度梯度分离法分离出骨髓间质干细胞,用5-氮胞苷诱导后可分化为心肌细胞。此可为心肌梗死、心力衰竭与心律失常的移植及修复治疗提供理想的细胞材料。     

体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构

[目的]研究体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构。[方法]采用常规技术对SD鼠骨髓间质干细胞进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和透射电镜分析。[结果]流式细胞仪检测,细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;经5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后结蛋白和肌球蛋白染色阳性。透射电镜观察有巨噬样、内皮样和成纤维样三类基本细胞,巨噬样细胞表面有胞质突起,胞浆含电子密度高的结晶样包涵体;内皮样细胞靠胞膜边有吞饮小泡,胞浆中有电子密度高的内皮特殊小体;成纤维样细胞呈梭形,较幼稚,细胞器简单,有丰富的糖原和核糖体;经诱导分化的肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带;细胞间存在胞膜局部紧密连接和胞质突起接合。[结论]传代贴壁生长的为骨髓间质干细胞;超微结构分析显示早期幼稚细胞发育的特征,但各有特点;在不同培养条件诱导下,细胞具备向肌肉和脂肪组织分化的潜能。本研究为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和临床应用打下基础。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

人骨髓间质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的建立

目的:探讨体外诱导培养人骨髓间质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的方法和技术,为骨组织工程研究提供理想的种子细胞.方法:抽取无系统疾病自愿捐献骨髓患者的骨髓,体外分离诱导培养BMSCs,按照诱导条件加入时间的先后次序分为早期诱导组(A组)和延迟诱导组(B组),镜下观察2组细胞形态学变化,计算倍增时间,并测定2组骨钙素的含量和Ⅰ型胶原的表达,研究该细胞生物学特性及其体外成骨能力.结果:(1)镜下观察:A组细胞贴壁,呈菱形,5～7 d融合,成纤维细胞集落样生长;B组细胞贴壁,呈梭形,3～5 d融合,呈指纹状生长方式.(2)倍增时间:A组第1、2、3、4代倍增时间分别为18.86、17.45、18.71、20.99 h;B组第1、2、3代倍增时间分别为17.54、19.59、25.46 h,第4代停止生长,2组各代倍增时间差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)骨钙素:A组各代均可检测到骨钙素,Ⅰ型胶原自原代就有阳性表达,第3、4代细胞达到最强;B组原代、第1代细胞中未检测到骨钙素,诱导后才分泌骨钙素,Ⅰ型胶原各代均有阳性表达,但不均匀,第4代细胞停止增殖,无阳性表达.结论:应用成骨细胞条件培养液在体外能够促进人BMSCs向成骨细胞分化,验证了BMSCs是一种比较理想的骨组织工程种子细胞.早期诱导是较为完善的体外诱导培养条件和方法.     

成人骨髓间质干细胞体外分化为神经元样细胞

目的 探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)体外增殖和不同诱导剂对hMSC定向分化为神经元样细胞的作用。方法 体外分离hMSC,培养扩增。分别用参芪液、β-巯基乙醇(β-ME)和复合成分诱导剂体外定向诱导hMSC分化为神经元。于诱导后1,3和5h分别应用相差显微镜观察神经元样细胞和进行免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并进行神经元样细胞定量分析。结果 加入3种诱导剂后,可使hMSC特异性的分化为神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE,NF阳性,GFAP阴性。神经分化的定量分析显示诱导后1,3和5h,参芪液诱导NSE,NFH阳性细胞分别为50．3％,63．5％,79．6％和46．5％,58．9％,77．5％。经β-ME诱导NSE,NFH阳性细胞分别为44．6％,60．9％,77．2％和43．7％,56．1％,75．6％。经复合成分诱导NSE,NFH阳性细胞分别为50．5％,62．3％,80．5％和45．1％,59．1％,78.8％。结论 hMSC可在体外扩增、传代,并能被不同诱导剂在体外诱导分化为神经元样细胞。     

新型组织工程化人工骨的体外初步构建

目的 应用组织工程学技术，体外初步构建有活性的人工骨。方法 培养，诱导人间充质干细胞向成骨细胞表型转化，制备性能优越的支架材料，将细胞与材料复合构建人工骨，在体外培养一定时间后，扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构和消化细胞行碱性磷酸酶染色。结果 L－聚乳酸，聚磷酸钙纤维，I型胶原按一定的方法可构建出新型的骨组织工程复合支架材料，诱导后的间充质干细胞可在材料内良好贴附生长，维持成骨细胞表型。结论 本实验为骨组织工程学的进一步研究与应用提供了新的材料和方法。     

双相接种法体外构建组织工程骨

目的观察双相接种法构建组织工程骨的效果.方法取健康志愿者骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增、诱导分化,然后应用双相接种技术与脱钙骨基质(DBM)复合构建组织工程骨,并与静置接种方法进行比较,计算接种效率、测定碱性磷酸酶活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察.结果与静置接种法相比,双相接种法不仅获得近100%的接种效率,而且在体外培养过程中,组织块中细胞的碱性磷酸酶活性均高于静置接种法,后者在第14天时碱性磷酸酶活性与前者第5天的水平相当.扫描电镜见双相接种法构建的组织块切面较平坦,孔隙较小,细胞包埋在胶原中,而静置接种法构建的组织块可见细胞,细胞外基质较少.结论双相接种法是一种高效的组织工程骨构建方法,有利于提高接种效率和促进组织工程骨的体外成熟.     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

人骨髓基质干细胞体外三维立体培养的实验研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)在部分脱钙骨三维支架上立体培养的可行性。方法：将自人骨髓中分离出的骨髓基质干细胞进行培养、扩增,接种于多孔的部分脱钙骨支架上,通过荧光活性染料DiI标记和扫描电镜观察骨髓基质干细胞在部分脱钙骨上的生长和粘附情况,并测量hBMSCs在部分脱钙骨上的粘附率。结果：hBMSCs在部分脱钙骨上的粘附率为(99.1±1)%;DiI标记的细胞于接种后第2、4、7天激光共聚焦检测,见支架空隙中细胞逐渐增多;电镜观察,接种7天后,电镜下见细胞覆盖了部分脱钙骨表面;自部分脱钙骨中份切开,横断面电镜观察见断面中充满细胞。结论：hBMSCs在部分脱钙骨支架的三维立体环境中生长良好,是一种较好的体外培养方法。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

骨髓和脂肪源多潜能间充质干细胞的比较研究

①目的比较骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞的生物学特性。②方法分离人的骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞进行体外培养，通过绘制生长曲线，比较细胞的增殖能力；利用流式细胞仪分析细胞表型，并与诱导培养比较细胞的分化潜能进行比较。③结果脂肪源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞具有相当的生物学特性，且在增殖能力方面优于骨髓源间充质干细胞。④结论人脂肪组织可能成为一种新的间充质干细胞来源。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞的体外培养及生长特性

目的 研究肝硬化患者骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外扩增方法及其生长特性和特异性表面标记,为肝组织工程“种子细胞”的选择提供新的理论依据,为进一步研究自体骨髓间充质干细胞移植治疗肝衰竭时移植细胞在体内的调控机制打下基础。方法 无菌抽取4例肝硬化志愿者骨髓3～4mL,年龄30～40岁,利用密度梯度离心法联合贴壁筛选法逐步筛选MSCs,获取MSCs,倒置显微镜下逐日观察细胞生长特性,细胞计数,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志CD甜、CD45。结果 原代培养细胞生长潜伏期0～9d,对数增殖期为10～19d,生长平台期为20～24d;传代细胞生长周期较原代细胞快,细胞生长潜伏期为4～24h,对数增殖期为3～12d,13～15d进入生长平台期。肝硬化患者骨髓MSCs高表达CD44,低表达CD45。结论 肝硬化患者骨髓MSCs体外生长良好,性质稳定,可以作为“种子细胞”用于自体骨髓干细胞移植和生物人工肝系统。     

体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine aortic valve scaffold，APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells，RBMSCs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理，去除猪主动脉瓣细胞成分，并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定；在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞，行形态学检查和免疫组化测定。结果光镜及电镜证实，猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除，获得完整无细胞的纤维网状支架；瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化；种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层。结论种植RBMSCs于ACPAV上，可体外构造组织工程人工心脏瓣膜。     

犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养后细胞表型变化

目的: 观察犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)经分离、自然扩增及诱导分化后表型变化和生物学特性. 方法: 利用骨髓穿刺、percoll密度梯度法离心分离继而贴壁筛选纯化BMSCs进行接种培养,体外扩增;倒置显微镜下观察其形态学变化,并进行相关抗原检测. 结果: 分离的细胞免疫组化显示SH2, Vimentin, α-SMA和 collagen Ⅰ, Ⅲ均呈阳性表达,其阳性率分别为(95.1±1.7)%, (64.4±2.2)%, (78.7±0.9)%, (78.3±1.4)%和(66.8±0.8)%;CD34,Ⅷ因子antigen 和laminin的表达均为阴性. 在加入bFGF等诱导培养基作用下,可以诱导分化出成纤维细胞,其诱导分化率为(50.2±2.5)%. 诱导后α-SMA表达阳性率下降为(42.3±1.6)%,vimentin表达阳性率上升为(86.2±2.4)%,生长扩增能力强,2 wk内经3代培养即可扩增到(5.6±0.3)×107细胞数量级. 结论: 此实验自然分化扩增来的肌纤维母细胞的表型和生物学特征显示这类间质细胞较应用bFGF诱导、分化扩增来的成纤维细胞有更强活力,且分泌胶原力强,更符合构建组织工程种子细胞的要求.