pEGFP-C3-hNIS重组质粒的构建及其在人胃癌BGC-823细胞的表达

目的构建人钠碘转运体（hNIS）基因真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并研究重组hNIS基因在人胃癌BGC-823细胞中的表达情况。方法采用Trizol一步法从甲状腺手术患者的甲状腺组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到hNIS的可编码区基因,并克隆到T载体上,测序后亚克隆到真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3的多克隆位点,获得重组真核表达载体pEGFP-C3-hNIS。分别将pEGFP-C3-hNIS重组质粒（实验组）和pEGFP-C3（对照组）瞬时转染至人胃癌BGC-823细胞中,转染48 h后,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达情况,并通过Western blot方法检测hNIS基因的蛋白表达水平。结果序列分析证实克隆片段与GenBank公布的hNIS基因序列（序列号：NM-000453）相似性达99.90%。转染48 h后,实验组与对照组细胞均可观察到较强绿色荧光信号,用hNIS基因特异性抗体检测表明实验组hNIS表达水平明显高于对照组。结论成功构建hNIS真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并能在人胃癌BGC-823细胞中高表达。     

人FUT3基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表选.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.     

pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12(MAGE-12)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,并在真核细胞中表达。方法于2005-10～2005-12对郑州大学第一附属医院应用RT-PCR方法,从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至质粒载体(pGEM-Teasy),测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

PTEN对乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞凋亡的促进作用及机制

目的观察野生型PTEN基因促进乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR凋亡的作用并探讨其机制。方法采用脂质体介导法将真核表达载体pEGFP-C1-PTEN及突变载体pEGFP-C1-PTEN-C124S转染人乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞。MTT法观察细胞对阿霉素的敏感性和耐药倍数,流式细胞技术检测细胞凋亡率,Western blot检测Bcl-2和Caspase-3蛋白。结果转染组的凋亡率为36.86%,高于对照组（3.75%）和C124S组（4.00%）（P均〈0.05）。转染组对阿霉素的耐药倍数显著降低（t=4.77,P〈0.05）,其半数致死剂量IC50值为对照组的26.1%。转染后细胞内Bcl-2表达降低,且检测到Caspase-3活性裂解片段。结论PTEN基因可能通过下调Bcl-2表达及活化Caspase-3来促进乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞凋亡,增加其对阿霉素的药敏性。     

人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础.方法 从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体中.通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性.提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株.提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达.结果 从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基.测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列.转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P＜0.01.结论 成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体.获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株.     

bFGF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的 构建人碱性成纤维生长因子(bFGF)真核表达载体,观察其在人骨髓间充质干细胞(MSCs)内的表达.方法 应用RT-PCR从人胎盘组织中扩增出bFGF,并将其构建于pcDNA3.1真核表达载体上.利用脂质体将基因转染MSCs内,利用G418进行基因的表达筛选,通过RT-PCR和Western blot进行基因表达的检测.结果 扩增出人bFGF基因成功构建在bFGF-pcDNA3.1真核表达载体上.经G418筛选转染的MSCs存活十代以上.经RT-PCR及Western blot检测发现转染bFGF-pcDNA3.1真核表达载体的MSCs能够大量稳定表达bFGF.结论 构建的bFGF-pcDNA3.1真核表达载体可在MSCs内得到稳定的表达.     

YAP干扰质粒的构建及转染肺腺癌细胞A549的筛选鉴定

目的构建YAP基因小发卡RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,建立稳定低表达YAP基因的肺癌细胞系。方法根据信息检索,分别构建4个shRNA(shRNA1,shRNA2,shRNA3,shRNA4)质粒表达载体和一个阴性对照表达载体(NCRNA),脂质体法转染人肺癌A549细胞株,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定低表达YAP基因的A549细胞系,RT-PCR和Western印迹检测YAP在该细胞中的表达。结果转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western印迹检测到目的基因YAP在转染细胞中为低表达。RT-PCR检测YAP mRNA示shRNA1,shRNA2,shRNA3,shRNA4,NCRNA组和空白对照组的2-ΔΔct值分别为2.775,0.498,0.432,2.834,3.289,3.320。Western印迹检测示shRNA1组,shRNA2组,shRNA3组,shRNA4,NCRNA组,空白对照组的蛋白相对灰度值分别为0.690,0.411,0.354,0.688,0.699,0.712。结论成功构建了靶向YAP基因的shRNA,筛选出了干扰作用最为明显的shRNA,并建立了稳定低表达YAP基因的A549细胞系。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化

目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009（H1N1）]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK-1的构建及其在结直肠癌SW480细胞内的表达

目的:构建重组p21-activated kinase-1(PAK1)基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,并转染入结直肠癌细胞SW480中表达.方法:在南方医科大学附属南方医院消化研究所实验室,从人类结直肠癌细胞株SW620细胞提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得人PAK1 cDNA片段,经过限制性内切酶进行酶切,T4连接酶进行连接,将目的基因克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,然后转染结直肠癌细胞株SW480,观察其在细胞中表达.结果:重组载体经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析验证,显示插入载体的序列与目的基因一致,而且该重组载体能够在SW480细胞中表达.结论:成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,为研究PAK1在结直肠癌中的生物学功能奠定了基础.     

真核表达载体pCMV-(Kozak)TFPI在搭桥模型移植静脉中的表达

目的构建真核表达载体pCMV-（Kozak）TFPI并检测其在移植静脉中的表达，为冠状动脉旁路移植术中转染大隐静脉内皮细胞抗凝治疗的临床试验奠定理论应用基础。方法用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法提取人组织因子途径抑制因子（TFPI）基因，并引入Kozak序列，将（Kozak）TFPI亚克隆入pCMV质粒中。在阳离子脂质体介导下，转染颈总动脉搭桥模型移植静脉内皮细胞。RT-PCR、蛋白印迹法（Western印迹）和免疫组化法检测移植静脉中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。结果（Kozok）TFPI成功克隆入pCMV中。RT-PCR、Western印迹和免疫组化检测到移植静脉中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。结论pCMV-（Kozak）TFPI真核表达载体构建成功，移植静脉中检测到其蛋白的表达。     

腺病毒载体介导PTEN基因转染大肠癌细胞的实验研究

目的观察PTEN腺病毒载体（Ad5-PTEN）对大肠癌细胞生物学行为的影响。方法将目的基因PTEN导入腺病毒载体Ad5,与辅助质粒共同转染人胚肾母细胞（293细胞）构建Ad5-PTEN。测定病毒滴度后转染新分离的大肠癌细胞。结果表达增强型绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad5-EGFP）和Ad5-PTEN在体外可以转染大肠癌细胞,其中在Ad5-EGFP腺病毒转染的大肠癌细胞观察到了绿色荧光;在Ad5-PTEN腺病毒转染的大肠癌细胞培养上清液中检测到了PTEN蛋白的表达。结论 Ad5-PTEN在体外可以有效转染大肠癌细胞,且携带的外源基因可以在胰岛细胞中稳定表达,为大肠癌的防治研究奠定了基础。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

RhoC—miRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达

目的 体外合成RNA干涉小分子构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA真核表达载体,分析其在人卵巢癌细胞SKOV3中稳定表达情况.方法 设计并合成单链oligo,经退火形成双链的DNA oligo,将其与线性的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒连接,构建重组质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA真核表达载体,经扩增、筛选、鉴定及测序后,用脂质体法将重组质粒转染SKOV3细胞,筛选稳定转染细胞系、观察转染细胞的形态并进一步通过Western印迹法检测细胞内RhoC蛋白表达.结果 重组质粒进行PCR鉴定及DNA序列测定证实DNA oligo已被成功连接到载体中并且序列完全正确;经重组质粒转染的SKOV3细胞24 h后的荧光显微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号,RhoC-miRNA稳定转染的SKOV3细胞形态变圆,折光性增强,收缩不铺展.Western印迹结果显示,与SKOV3细胞株及pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg细胞相比,pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA细胞中RhoC蛋白表达水平明显降低,表明所设计的RhoC-miRNA能有效抑制SKOV3细胞中内RhoC蛋白表达.结论 该实验成功构建了RhoC-miRNA真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA,利用脂质体法将其转染卵巢癌细胞后,能有效地抑制细胞内RhoC蛋白表达,为进一步研究RhoC的功能及探讨以RhoC为靶点的基因治疗提供了研究平台.     

旋毛虫ES抗原P49基因的体外表达分析

目的克隆和表达旋毛虫ES抗原P49基因,并分析表达产物的免疫原性。方法以重组质粒pCDNA3.1 P49为模板,PCR扩增旋毛虫ES抗原P49基因,将扩增片段双酶切产物连接到质粒pEGFP N1中,构建重组真核表达载体pEGFP N1 P49,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS 7。于转染24h后在荧光显微镜下观察发绿色荧光的转基因细胞;通过Western blot分析证实P49基因表达产物的免疫原性。结果成功构建旋毛虫ES抗原P49基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP N1 P49,并在COS 7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。结论成功获得了重组蛋白,并证实该融合蛋白具有免疫原性,其结果为研究其生物学功能奠定了基础。     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的: 基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1-ERbeta并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达. 方法: 应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段, 将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中, 采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列; 脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERbeta瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选, 获得比较单一的转染细胞; 分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERbeta基因不同分子水平表达. 结果: 酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERbeta构建无误; RT-PCR和Western blot分析均表明, 与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比, 转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERbeta组细胞ERbeta基因表达水平明显提高. 结论: 成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERbeta并在Caco-2细胞株中表达, 为进一步研究ERbeta如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的:基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1ERβ并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达.方法:应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段,将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERβ瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选,获得比较单一的转染细胞:分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERβ基因不同分子水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ构建无误:RT-PCR和Western blot分析均表明,与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比,转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ组细胞ERβ基因表达水平明显提高.结论:成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERβ并在Caco-2细胞株中表达,为进一步研究ERβ如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.