中药半夏的DNA分子与分子鉴别

目的 :分析半夏 [Pinelliaternata(Thunb .)Breit.]的核基因组 18SrRNA基因核苷酸序列 ,以中药半夏正品基原进行分子鉴别。方法 :采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的 18SrRNA基因序列并作DNA序列变异分析。结果 :半夏和伪品虎掌的 18SrRNA序列长度均为 180 5bp ,两者存在 4个变异位点 ,而且在半夏 18SrRNA序列中有一个限制性内切酶AseⅠ识别位点 ,通过PCR RFLP图谱分析可以区别两者。结论 :通过DNA序列和PCR RFLP图谱差异分析 ,可对半夏正品基原进行准确而有效的分子鉴别     

快速筛选高纯合度天麻PCR-RFLP鉴定方法

目的 建立一种快速筛选高纯合度天麻种质材料的方法，为其纯系育种和杂交育种奠定基础。方法 以本课题组前期天麻全基因组测序和群体重测序为基础，利用单核苷酸多态性（SNP）位点开发20个限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）标记，并采用聚合酶链式反应（PCR）-RFLP法对15份天麻种质的20个RFLP标记进行限制性内切酶实验，根据20个RFLP标记位点酶切条带数目，计算15份天麻种质的纯合度，进而对天麻种质纯合度进行评估；在此基础上，利用基因组重测序技术对评估结果进行验证。结果 利用PCR-RFLP法筛选获得10份纯合度>95%的种质材料，其中3份种质材料的纯合度为95%，7份种质材料的纯合度为100%；利用基因组重测序法筛选获得9份纯合度>95%的种质材料，其中8份种质材料与PCR-RFLP法检测结果一致。结论 该文所建立的用于筛选高纯合度天麻种质的PCR-RFLP法精确度为80%，准确率为89%。该方法实验操作简便、检测效率高，且成本显著低于基因组重测序技术，为天麻纯系育种提供了技术支撑，也为其他中药材品种选育研究提供了借鉴。     

RAPD技术在中药鉴定中的研究进展

随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,通过基因工程分析手段,从遗传物质的DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定成为一个新的便捷、准确的鉴定方法。中药鉴定所需的分子标记技术可分为3大类:①基于传统的Southern杂交技术的分子标记,如限制性内切酶片段长度多态技术(RFLP);②基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)等;③PCR和RFLP技术的结合,即RFLP技术。其中RAPD技术应用最多[1]。现将RAPD技术在中药鉴定中的研究进展综述如下。1技…     

RAPD技术在中药材鉴定中的应用进展

随机扩增多态性DNA（random amplified pclymorphic DNA，RAPD）技术是1990年由Williams等发展起来的一项DNA分子标记技术。RAPD技术是建立在PCR技术的基础上．用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链（一般为10bp）作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。     

我国药用动物分子遗传标记鉴别研究进展

药用动物是中国重要的中药资源,在中药市场、药品及临床上得到广泛的应用。但目前动物类药材鉴定工作尚面临着一定的困难。在生物技术不断进步和日益成熟的今天,利用分子遗传标记鉴定药用动物成为了可能。目前DNA分子标记技术已有数十种,限制性片段长度多态性（RFLP）标记、随机扩增多态性DNA（RAPD）标记、微卫星DNA（SSR）标记、线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）标记等几种是在药用动物鉴别中较常用的DNA分子标记技术,DNA条形码技术在药用动物鉴别中也得到了很好的应用。     

白芍种质资源的DNA分子标记研究

目的:采用DNA条形码技术和随机多态性(RAPD)分子标记技术对12个不同品种(系)的白芍种质资源进行遗传多样性研究。方法:采用CTAB法提取白芍叶片基因组DNA,利用ITS2引物和RAPD随机引物对样品进行PCR扩增,对于ITS2-PCR体系,测序后采用相似性搜索(BLAST法)进行鉴定分析;对于RAPD-PCR体系,根据条带数目,应用NTSYS2.10e软件采用UPGMA法进行聚类分析。结果:12个品种的ITS2序列的BLAST结果高度一致,未见碱基位点的变异。RAPD引物碱基序列共扩增出308条带,其中多态性条带有257条,多态百分率为83.4%,各品种(系)间的相似系数在0.558~0.847之间。结论:白芍的各品种间保存着丰富的遗传多样性。     

基因编辑技术及其在药用植物中的应用展望

基因编辑是一项能够在生物体基因组水平上实现对DNA序列精确定向修饰的新技术。该技术主要利用序列特异性核酸酶靶向识别切割基因组上目标位点,造成DNA双链断裂（DSBs）,进一步诱发非同源末端连接（NHEJ）和同源性重组（HR）2种修复机制对断裂的DNA双链进行修复,实现修复位点碱基的插入、缺失和替换,从而达到对靶基因精确编辑的目的。对基因编辑技术的类型、作用原理及该技术在植物领域中的应用进行综述,并对基因编辑技术在药用植物功能基因组学和遗传改良中的应用前景进行展望。     

ISSR标记技术及其在药用植物遗传育种中的应用

简单重复序列间扩增(ISSR)是在简单重复序列(SSR)基础上发展起来的一种新技术。该技术以锚定的微卫星DNA为引物,对与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增。ISSR标记具有较长的引物序列,退火温度高,表现出较好的稳定性,且结合位点丰富,可以检测到基因组中多个位点的差异,能够揭示出比限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物扩增多态DNA(RAPD)、SSR更多的多态性信息。对ISSR标记技术的原理、特点及其在药用植物种质鉴定、遗传多样性、居群遗传结构、进化与亲缘关系分析以及分子辅助育种等研究方面的应用进行了综述。     

分子鉴定技术在中药中的应用

对近些年来兴起的分子鉴定技术进行了分析总结,主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增性简单序列重复(ISSR)、限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)、扩增限制性内切酶片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、DNA条形码序列分析等技术。从中药材真伪鉴定、中药材正品与替代品鉴定、中药材多基原鉴定和遗传多样性、中药材产地鉴别、中药材年限鉴别5个方面对分子鉴定技术在中药中的应用进展进行了归纳总结,阐述了分子鉴定技术存在的一些问题及其未来的发展方向。     

牛膝的rDNAITS序列分析

目的 探讨不同产地牛膝的ITS的序列变异，为鉴别牛膝提供DNA分子标记。方法 利用特异性PCR技术对牛膝的rDNA ITS区碱基序列进行测定，报道了牛膝的rDNA ITS区的碱基序列。结果 得到核糖体DNA中的ITS及5．8S rDNA完全序列，18S和26S rDNA部分序列，共约650bp。牛膝与川牛膝及土牛膝碱基序列有明显差异，不同产地、不同栽培品种牛膝碱基序列无差异。结论 此法可用于牛膝种间及真伪品鉴别。     

基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅰ)——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别

目的 :分析半夏Pinelliaternata(Thunb .)Breit.及其伪品虎掌南星PinelliapedatisectaSchott的核基因组序列 ,为半夏正品基原鉴别提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18SrRNA基因核苷酸离列并作序列变异和选择性内切酶谱 (PCR SR )分析。结果 :半夏和伪品的 18SrRNA序列长度均为 180 5bp ,根据排序比较 ,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同 ,虎掌南星亦如此。而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异 (有 4个变异位点 )。在半夏 18SrRNA序列中有一个限制性内切酶AseⅠ识别位点 ,通过PCR SR图谱显示 80 0bp和 90 0bp2个酶切片断 ,而虎掌南星则无此位点 ,PCR SR图谱显示 1个未消化的 180 0bp片断。 结论 :通过核基因组序列和PCR SR图谱差异 ,DNA测序技术可成为半夏正品基原鉴别准确而有效的分子方法     

根据基因探讨药用植物的变异和生药基原

以检测RFLPs进行各种药用植物种内或种间变异的分析,并把生药中残存基因的特定区域扩增克隆,根据检测其碱基序列的差异,来探讨用DNA鉴定生药的可能性。 1.三岛柴胡地理变异的分析:三岛柴胡(Bupleurum falcatum)在日本各地均有分布,为多态性强的种,由于产地不同其体细胞染色体数目、叶序、柴胡皂甙含量等形状和性质有差异,对日本8个产地野生的样品,在基因水平上进行了地理系统之间的遗传关系分析。首先选用御种植物,用RFLP图谱对个体变异进行探讨,但调查范围内同一种群未见个体变异。用各种限制酶进行RFLP的检测,在以Dra Ⅰ,Kpn Ⅰ,Taq Ⅰ进行限制酶酶切     

太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究

目的研究太子参脱病毒苗与外界苗rDNAITS区碱基序列的异同。方法运用PCR直接测序法对9种太子参脱病毒苗和4种外界苗的rDNAITS区（包括ITS1、5．8S、ITS2）碱基序列进行了序列测定。结果太子参脱病毒苗与外界苗的5．8S碱基序列完全一致，变异位点基本上位于ITS1的起始端与ITS2的终止端，其中江苏溧阳和安徽宣城的脱病毒苗变异位点较多。使用UPGMA法构建了系统发生树，从分子生物学角度说明了它们之间的内在联系。结论rDNAITS碱基序列的比较分析从分子水平上进一步阐明了脱病毒苗的遗传稳定性。     

分子标记技术在中药品种鉴别中的应用

 目的：介绍现代生物技术——DNA分子标记及其分析方法在中药品种鉴别上的应用和意义。方法：以国内外有代表性的论文为基础，进行整理与归纳。传统分子标记技术有抗血清、蛋白质、同工酶；目前DNA分子标记有RFLP，PCR，SNA序列，AP-PCR和RAPD。结果：分析了传统的分子标记（如生物化学、酶学、血清学特征）特点、适用范围和局限性，介绍了DNA分子标记技术的研究成果和进展。结论：DNA分子标记技术对中药品种鉴别具有广阔的应用前景。     

千里香杂合度PCR-RFLP快速评估方法的建立

目的 建立一种快速评估千里香种质材料杂合度的方法，为制定千里香的优异种质繁育策略和促进种质创新提供依据。方法 以65株千里香重测序数据为基础，检测并筛选单核苷酸多态性（SNPs），利用其中20个SNP位点，通过自编脚本将其转化为限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）标记；采用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）法对12份千里香种质的20个RFLP标记进行检测，根据RFLP标记位点酶切片段数目计算千里香种质的杂合度；采用plink软件计算12份千里香种质的全基因组杂合度，并比较不同种质杂合度评估方法得到的结果。结果 PCR-RFLP法和基因组重测序法计算的杂合度间差异无统计学意义。利用PCR-RFLP法筛选获得了8份杂合度<30%的种质材料，利用基因组重测序法筛选获得9份杂合度<30%的种质材料，2种方法计算杂合度均<30%的种质材料共7份。结论 该文建立了千里香种质杂合度评估的PCR-RFLP法，其精确度为87.5%，准确率为77.8%，该法可为其他药用植物种质杂合度评估方法研究提供借鉴。     

三种一般钩藤ITS序列的RFLP分析

目的以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对采集自3个不同地区的一般钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jack.进行RFLP遗传分析,研究不同地理区域一般钩藤的rDNA ITS序列是否具有生物地理差异。方法通过改良CTAB法提取一般钩藤总DNA,利用通用引物对其rDNA ITS序列进行PCR扩增,并对连接转化后扩增得到的rDNAITS序列进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析。结果获得采集自广东韶关阳山、广东梅州大埔、广西植物园的3种一般钩藤两种限制性内切酶(Msp I&HaeⅢ)酶切图谱。结论通过基于rDNAITS序列进行的RFLP分析,表明这3个地区的一般钩藤rDNA ITS序列无明显差异,不同区域的一般钩藤其遗传本质不具有地理差异。     

韩国赤芝全基因组重测序分析

目的：探索韩国赤芝与中国赤芝CGMCC5.0026间在基因组水平上存在的差异,为赤芝的遗传育种提供研究基础。方法：采用高通量重测序技术,对韩国赤芝进行全基因组重测序,并对单核苷酸多态位点突变（SNP）、小片段插入缺失变异（InDel）、结构变异（SV）进行检测和注释。对DNA水平变异基因进行KEGG、GO、COG、NR、SwissProt数据库注释。结果：韩国赤芝重测序覆盖深度为44 ×,与中国赤芝CGMCC5.0026相比,共发现10607个基因发生非同义SNP,4774个InDel和1428个SV,共导致9469个基因发生变异。这些变异基因中有转录因子86个,细胞色素P450 195个。结论：本研究通过对中国赤芝和韩国赤芝基因组序列进行比较,为赤芝的分子标记育种和对完善灵芝模式真菌研究体系提供了基础。     

基于ITS2序列的乌头属药材分子鉴定及亲缘关系分析

目的 应用核糖体基因内转录间隔区（ITS）2序列对乌头属12种药材进行DNA条形码（DNA barcoding）分子鉴定，并确定其亲缘关系。方法 收集乌头属12种药材共计30份，运用离心柱型植物基因组试剂盒的方法提取DNA、使用ITS2序列通用引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增、电泳检测后双向测序，应用CodonCode Aligner 17.0软件对测序序列和峰图进行校对拼接，利用MEGA 7.0软件进行序列变异分析，采用ITS2 Database在线工具预测其二级结构，使用邻接法（NJ）构建系统聚类树。结果 乌头属12种药材ITS2序列长度为220~221 bp，鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）平均含量为64.09%；变异位点共140个，信息位点共137个，保守位点共81个，种内遗传距离（K2P）小于种间K2P；在ITS2序列二级结构和NJ聚类分析中，花葶乌头、西伯利亚乌头和高乌头的亲缘关系接近，其他9种药材的亲缘关系接近，其中华北乌头和阴山乌头的亲缘关系更为接近。结论 ITS2序列在乌头属12种药材分子鉴定及确定亲缘关系方面具有较好的应用价值，为民族药的资源保护、开发应用方面提供新的思路、技术和方法。     

基于AFLP分子标记的我国不同生态栽培产区枸杞资源遗传多样性分析

目的 利用荧光标记辅助的扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）技术，从基因组DNA水平上分析我国6个栽培生产区域52份枸杞Lycium chinense样本的遗传多样性。方法 对提取的枸杞DNA样本进行酶切、连接、预扩增和选扩增等步骤，扩增产物经毛细管电泳系统分离和数据采集后，利用Popgene软件计算遗传多样性参数，利用GenAlex软件计算遗传距离并进行主坐标分析，利用MEGA-X软件根据遗传距离进行聚类分析，利用Structure软件进行群体遗传结构分析。结果 共筛选得到10对AFLP选择性扩增引物组合，扩增得到328条扩增片段，其中多态性片段121条，且在不同产地枸杞居群间多态性位点分布不均匀。分析显示不同栽培产区枸杞的遗传多样性较低，等位基因数（observed number of alleles,Na）、有效等位基因数（effective number of alleles,Ne）、观测杂合度（Nei’s gene diversity,H）和香浓信息指数（Shannon information index...     

长白山地区药用植物龙胆DNA条形码鉴定

目的：基于内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2,ITS2）碱基序列,运用DNA条形码鉴定技术对长白山地区药用植物龙胆进行鉴别研究,为龙胆药材的基原植物鉴定和药材的真伪鉴别提供参考。方法：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取法提取龙胆叶片及药材的DNA,对其中特定ITS2碱基序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,检测后测序,并从GenBank下载同属植物序列,运用SeqMan软件对碱基序列拼接后,采用MEGA 7.0软件对数据进行分析处理及对比,计算Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离,建立邻接（NJ）法,进行对比分析。结果：根据NJ聚类树可知,不同种龙胆属植物笔龙胆、三花龙胆、高山龙胆、坚龙胆都自为一支,区分明显,龙胆和条叶龙胆聚在一支未能区分开,同时结合变异位点及K2P遗传距离发现,条叶龙胆和龙胆应用ITS2碱基序列区分时种间差异十分小。吉林省长白山10个不同地区的龙胆种内几乎无差异,经Blast比对确定碱基序列的确为所需要鉴定的品种。结论：运用ITS2碱基序列的DNA分子条形码鉴别方法对龙胆植物及药材进行鉴别有效可行且成功率较高,可以用于龙胆属种间及种内鉴别。