大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定

目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450。方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成。提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因。并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定。BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450。结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因。重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1461bp的酶切产物。测序的结果用ClustalW在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源。阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带。对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1461bp和5900bp两条特异性条带。结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础。     

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法

目的:agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用,也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用,其表达产物在机体内分布广泛.设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法,并检测其特异性、敏感性和可重复性.方法:实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成.以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物,经检索Blast验证特异性,并以Primer 5设计构建agrin基因标准品引物.选择清洁级Wistar大鼠交配,获取3日龄乳鼠,取脑,获取mRNA、cDNA,常规反转录-聚合酶链反应获取agrin 554个碱基DNA片断.PCR填加T7启动子后,T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品,消化模板.分光光度计测定其浓度,1∶5倍比稀释3次;经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品,测序验证特异性.以ACTB引物反转录cDNA,1∶5倍稀释3次,构建ACTB基因标准品.常规聚合酶链反应确定、优化反应条件.标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性,融解曲线验证检测方法的特异性,作重复性检测.结果:①agrin基因有意义链引物序列:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,反义链引物序列:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,内标:ACTB基因有意义链引物序列:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,反义链引物序列:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,优化反应条件:95 ℃变性5 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s.②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均＞ 0.95.③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求.结论:绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法.     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

背景:有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道.目的:构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒.方法:对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定.结果与结论:实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒.     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景;血管内皮生长因子在肿痛新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能.目的:克降人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮牛长因子受体1基因的真核表达载体.设计、时间及地点:基因表达载体构建实验,于2006-1012007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体.方法:提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录一聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实.然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克降至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定.主要观察指标:可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录一聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果.结果:构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮牛长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致.结论:应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长凼子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体.     

携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达

目的:内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子,但内皮抑素蛋白极不稳定,难以制备及应用,故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用.实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白.方法:实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成.以Pshuttle-Endostatin质粒为模板,应用特异引物,通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断,经测序鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组质粒经筛选、提取、纯化后,经酶切及测序鉴定正确,再大量扩增为腺病毒载体,线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增,得到的病毒液纯化扩增后,感染人脐静脉内皮细胞,反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达,蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达.结果:获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确,重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确,成功转染AAV293细胞,包装并扩增出病毒液,纯化后测滴度为2.06×1010 pfu/mL,进一步感染人脐静脉内皮细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达.结论:人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功,且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白.     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景:核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的:克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法:采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的:克隆大鼠神经营养因子4全长基因,构建真核细胞表达质粒。方法:实验于2004-06/2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠,用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板,应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中,构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。结果:提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带,聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带,测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致(M86742),说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。结论:正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

人瘢痕疙瘩成纤维细胞IKKβ特异性siRNA的筛选和载体构建

背景:近年来的研究表明核转录因子k B通过调控多种基因的表达,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用.核转录因子k B抑制蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β是核转录因子k B 激活通路中的关键激酶,被抑制后可以阻断核转录因子k B的活化过程,通过siRNA干扰沉默IKKβ基因,下调核转录因子k B.目的:体外合成并筛选人瘢痕疙瘩成纤维细胞特异性IKK β-siRNA,并构建其表达载体.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2008-04/2008-10在解放军广州军区总医院中心实验室完成.材料:细胞来源为珠江医院整形外科25～40岁患者切除的瘢痕疙瘩标本,患者知情同意.方法:化学合成3条IKKβ.siRNA,分别转染体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,采用反转录-聚合酶链反应技术检测所合成的SiRNA对IKKβ表达的抑制,筛选出特异性IKKβ-siRNA,并采用PU6质粒构建载体.主要观察指标:①RT-Q-PCR检测结果.②载体基因连接产物酶切鉴定.③重组质粒测序鉴定.结果:经实时定量反转录-聚合酶链反应检测,合成的3条IKKβ-siRNA链中,IKKβ-siRNA-2有明显抑制IKKβmRNA表达的作用,IKKβ-siRNA-1、IKKβ-siRNA-3干扰效果不明显.并通过酶切鉴定和测序结果证明成功构建IKKβ-siRNA载体.结论:应用反转录-聚合酶链反应可筛选出针对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的特异性IKK β-siRNA=可构建具有干扰效果的IKKβ-siRNA表达载体.     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的:构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒,为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法:实验于2005-06/2006-03在解放军第三○二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT,筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①聚合酶链反应扩增目的基因:电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3.5kb处有特异性目的条带,绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建和鉴定结果:双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果:荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论:①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建成功,为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法,并为建立永生化人肝细胞系奠定基础。