应用干扰RNA体外抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒N基因的表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒N蛋白的融合表达载体pEGFP-C1-N以及针对SARS冠状病毒N基因的小发卡型shRNA表达载体pshRNAN，观察shRNA对SARS冠状病毒N基因复制和表达的影响。方法将构建成功的pEGFP-C1-N与psh RNA-N共转染293细胞，于转染后24、48、72h观察GFP表达的强弱，采用Western Blot分别检测GFP与N蛋白的表达，逆转录PCR检测N基因的mRNA。结果pshRNA—N作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，Western Blot和逆转录PCR结果也证实pshRNA—N对N基因和N蛋白的表达有明显抑制作用，而无关序列的shRNA无此作用。结论针对SARS冠状病毒N基因的shRNA具有显著和特异的抑制N蛋白表达的作用。     

一个包含HCV IRES的高效真核双顺反子表达载体的构建

目的利用丙型肝炎病毒（HCV）的内部核糖体进入位点（IRES）元件构建一个新的真核双顺反子表达载体。方法克隆包含HCV5’非编码区18nt开始到HCV CORE区编码基因的32nt的IRES序列替换商用载体pIRES中脑心肌炎病毒（EMCV）的IRES序列。构建真核双顺反子表达载体pCVIR，再将绿色荧光蛋白（GFP）和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因分别克隆到pIRES和pCVIR中的IRES的上下游，用流式细胞仪检测GFP的表达强度，ELISA法检测HBsAg的表达，比较两者的表达效率。结果pCVIR载体对IRES下游GFP和HBsAg的表达效率高于pIRES载体。结论构建了一个高效的真核双顺反子表达载体。     

HepG2细胞中HCV NS5A蛋白对HCV IRES启动蛋白翻译的影响

目的探讨HepG2细胞中HCV非结构蛋白5A（NS5A）对HCV IRES启动蛋白翻译的影响，以了解HCV的复制调控机制。方法将构建的表达双荧光素酶的双顺反子载体pCMV-Rluc-IRES-Fluc和含HCV NS5A基因的表达质粒pcDNA-NS5A共转染HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，细胞免疫荧光技术检测HCV-NS5A蛋白的表达，RT-PCR检测虫荧光素酶基因mRNA水平，并与相应对照做比较，以观察HCV NS5A对HCV IRES介导虫荧光素酶翻译水平的影响。结果转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞中虫荧光素酶活性明显高于转染pCDNA3．I-3flag的对照组，并存在剂量依赖关系；而RT-PCR虫荧光素酶基因mRNA水平在两组间差异无统计学意义。转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞质中可见HCV NS5A蛋白的表达。结论HCV NS5A蛋白对HCV IRES介导虫荧光素酶的翻译有正调节作用，并存在剂量依赖关系．     

载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立

目的 构建4个针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的小发央RNA(shRNA)表达载体，作用于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBV S基因融合表达载体，观察shRNA对融合蛋白的抑制作用，筛选出有效靶位。方法 利用pAVU6 27质粒，设计并掏建4个shRNA表达载体，与融合表达载体共转染AD293细胞，荧光显做镜下观察融合蛋白的荧光表达情况并通过流式细胞仪分析shRNA对融合蛋白的抑制作用。同时，逆转录聚合酶链反应法验证其筛选的有效性。结果 成功掏建shRNA表达载体和HBs-EGFP融合表达载体；4组shRNA表达载体均可不同程度抑制融合基因的表达，其中以579位点最有效，荧光表达抑制率为69．8％，RNA水平抑制率为74．6％。结论 筛选出有效抑制HBV S基因的siRNA靶位。     

丙型肝炎病毒5′非翻译区 DNA 序列在 HepG2细胞中的启动子活性

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组5′非翻译区(5′UTR)DNA 序列在 HepG2细胞中 的启动子活性，以了解 HCV 的复制调控机制。方法 分别构建 HCV 基因组5′UTR DNA 正反向序列驱动 虫荧光素酶基因表达的质粒5′UTR-Luc(+)/(-)和5′UTR DNA 序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒5′ UTR-EGFP(+)/(-)，分别转染 HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，逆转录 聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因 m R N A 水平，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平，并与相应 对照作比较，来证实 HCV 基因组5′UTR DNA 序列的启动子活性。结果 5′UTR-Luc(+)有明显的虫 荧光素酶表达，但比 pGL3 control 表达水平低(Luc/R为0．690±0．086，Luc/RL 为4．210±0．340)，而5 ′UTR-Luc(-)和 pGL3 enhancer 无明显虫荧光素酶表达(Luc/RL 分别为0．095±0．008和0．044±0． 005)；逆转录聚合酶链反应结果与之相符，5′UTR-Luc(+)检测到虫荧光素酶基因 mRNA，而5′UTR- Luc(-)则未检测到。5′UTR-EGFP(+)观察到较强绿色荧光，而5′UTR-EGFP(-)无荧光表达。 结论 HCV 基因组5′U TR DNA 序列具有明显的启动子活性，能启动下游基因的表达，在 HCV 基因组复 制过程中有重要作用。     

丙型肝炎病毒5''非翻译区DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组5'非翻译区(5'UTR)DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性,以了解HCV的复制调控机制.方法分别构建HCV基因组5'UTR DNA正反向序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒5'UTR- Luc(+)/(-)和5'UTR DNA序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒5'UTR -EGFP(+)/(-),分别转染HepG2细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因m R N A水平,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平,并与相应对照作比较,来证实H CV基因组5'UTR DNA序列的启动子活性.结果 5'UTR- LUc(+)有明显的虫荧光素酶表达,但比pGL3 control表达水平低(Luc/R为0.690 ± 0.086,Luc/RL为4.210±0.340),而5'UTR-Luc(-)和pGL3 enhancer无明显虫荧光素酶表达(Luc/RL分别为0.095±0.008和0.044±0.00 5);逆转录聚合酶链反应结果与之相符,5'UTR- Luc(+)检测到虫荧光素酶基因mRNA,而5'UTRLuc(-)则未检测到.5'UTR- EGFP(+)观察到较强绿色荧光,而5'UTR -EGFP(-)无荧光表达.结论 HCV基因组5'UTR DNA序列具有明显的启动子活性,能启动下游基因的表达,在HCV基因组复制过程中有重要作用.     

犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达

目的 构建犬贾第虫病毒（Giardia canis virus，GCV）转染载体。 方法 根据GCV基因组（DQ238861）的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件，将绿色荧光蛋白（GFP）基因替换GCV基因部分编码区，构建GCV基因与 GFP基因的嵌合体，并置T7启动子之下。用T7 RNA聚合酶体外转录后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体，并用荧光显微镜检测GFP表达情况，间接ELISA测定转染后GFP的表达量。 结果 构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174, 经SacⅠ和NotⅠ双酶切得到约2.0和3.5 kb两条带，与预计值相符。由其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达，其表达量在转染后第1天达高峰(A₄₉₀=1.8)；以后随时间的延长而逐渐下降，14 d后绿色荧光信号基本消失。 结论 成功构建了犬贾第虫病毒转染载体，为贾第虫细胞基因表达调控的研究提供了方法。     

小鼠纤维介素基因shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的探讨纤维介素蛋白（fg12）的双链RNA（dsRNA）在体外对fg12凝血酶原酶基因表达的干扰作用及其规律。方法构建能产生鼠fg12（mfg12）的发夹状双链RNA（shRNA）的载体p-mfg12shRNA。将其与mfg12-EGFP融合基因表达质粒pEGFP—mfg12共转染（用量比为1：5）到中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）作为实验组。另仅转染pEGFP—mfg12或共转染无关序列shRNA表达质粒和pEGFP—mfg12（用量比为1：5）作为对照组。转染24，48、72h后。观察mfg12-EGFP融合蛋白在CHO细胞中的表达情况，并通过流式细胞仪检测荧光细胞阳性率。分别将p—mfg12shRNA和mfg12cDNA表达质粒pcDNA3．1-mfg12共转染（用量比为1：5）到CHO细胞和人宫颈癌细胞（Hela细胞），作为试验组，另转染pcDNA3．1-mfg12或共转染无关序列shRNA表达质粒和pcDNA3．1-mfg12（用量比为1：5）或不转染任何质粒作为对照组。通过逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学检测mfg12在CHO和Hela这两种细胞株中表达的情况。结果实验组较对照组的绿色荧光强度明显减弱。荧光细胞数明显减少。在CHO和Hela两种细胞株。均显示mfg12shRNA显著抑制mfg12mRNA和蛋白质的表达。结论本研究所构建的mfg12shRNA表达质粒p-mfg12shRNA可在体外高效特异地抑制mfg12的表达，为进一步的体内实验奠定了基础。     

乙型肝炎病毒RNA上La蛋白结合位点缺失对S基因mRNA稳定性的影响

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）RNA上La蛋白结合位点的缺失对S基因mRNA在细胞内稳定性的影响，评价HBV RNA上这个位点对HBV生命周期的重要性，从而寻找新的抗HBV靶点。方法构建HBV突变载体，使其转录出来的HBV RNA缺失La蛋白结合位点；计算机预测突变后这个位点所在的HBV RNA片段的二级结构，将未突变的HBV载体和HBV突变载体分别瞬时转染HepG2细胞；半定量逆转录聚合酶链反应法检测HBV S基因的mRNA，酶联免疫吸附法检测乙型肝炎表面抗原。结果酶切鉴定和测序证明，成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的HBV突变载体——pHBV—mLa；突变后的HBV RNA二级结构同突变前的比较，完全改变；转染细胞后半定量逆转录聚合酶链反应法检测发现，突变后HBV S基因的mRNA水平显著降低（t′=12．703，P〈0．05）；酶联免疫吸附法检测发现突变引起乙型肝炎表面抗原表达明显下调（t=44．648，P〈0．01）。结论HBV RNA上La蛋白的结合位点以及局部特殊二级结构的形成，影响着自身转录后的稳定性，对于HBV的生命周期至关重要。     

大鼠叉头蛋白转录因子O1基因的shRNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

目的 构建针对大鼠又头蛋白转录因子哦O1（FoxO1）基因的shRNA慢病毒载体,并在大鼠系膜细胞（RMCs）上鉴定其沉默效率。方法利用四质粒合成法合成慢病毒载体。分别用阴性对照慢病毒载体（LV-shNC-GFP组）、shRNA慢病毒载体（LV-shRNA-FoxO1组）和感染增强剂（NC组）处理RMCs。72h后,采用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（GFP）阳性表达率。采用荧光定量PCR检测Fox01mRNA表达情况。15d后,采用蛋白免疫印迹法检测Fox01蛋白的表达情况。结果Lv_shNc_GFP、LV-shRNA-Fox01组GFP阳性表达率分别为87．4％、95．8％;Lv-shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA与蛋白表达量较NC、LV-shNC-GFP组均降低（P〈0.05）。其mRNA及蛋白抑制率分别达到86．2％和77．3％,而Lv_shNC-GFP、Lv_shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA及蛋白表达量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功构建大鼠FoxO1基因的shRNA慢病毒载体能高效、稳定地抑制FoxO1的表达,为进一步研究FoxO1的功能和作用机制奠定研究基础。     

Inhibitor RNA blocks the protein translation mediated by hepatitis C virus internal ribosome entry site in vivo

AIM:To investigate the inhibitory effect of hepatitis C virus internal ribosome entry site (HCV IRES) specific inhibitor RNA(IRNA) on gene expression mediated by HCV IRES in vivo.METHODS:By using G418 screening system, hepatoma cells constitutively expressing IRNA or mutant IRNA (mIRNA) were established and characterized, and HCV replicons containing the 5′ untranslated region (5′UTR) were constructed by using the same method. Cotransfection of pCMVNCRluc containing HCV 5′UTR-Iuc fusion genes and eukaryotic vector of IRNA into human hepatic carcinoma cells (HepG2) was performed and the eukaryotic expression plasmid of IRNA was transfected transiently into HCV replicons, pCMVNCRluc or pCDNA-luc was cotransfected with pSV40-β Gal into IRNA expressing hepatoma cells by using lipofectamine 2000 in vitro. Then the reporting gene expression level was examined at 48h after transfection by using a luminometer and the expressing level of HCV C antigen was analysed with a confocal microscope.RESULTS: Transient expression of IRES specific IRNA could significantly inhibit the expression of reporter gene and viral antigen mediated by HCV IRES by 50% to 90% in vivo, but mIRNA lost its inhibitory activity completely. The luciferase gene expression mediated by HCV IRES was blocked in the HHCC constitutively expressing IRNA. At 48h after transfection, the expression level of reportor gene descreased by 20%, but cap-dependent luciferase gene expression was not affected. IRNA could inhibit the HCV replicon expression 24h after transfection and the highest inhibitory activity was 80% by 72h, and the inhibitory activity was not increased until 7d after transfection.CONCLUSION:IRNA can inhibit HCV IRES mediated gene expression in vivo.     

血红素合成酶特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的利用含红色荧光报告基因（DsRed）的pGCsi-U6／Neo／DsRed／质粒构建干扰人红系特异的γ-氨基-6-酮戊酸合成酶（eALAS）基因表达的短发夹RNA（shRNA）表达载体,并进行活性鉴定。方法根据GenBank中eALAS的序列,设计3条表达shRNA的互补DNA序列,分别克隆至质粒载体pGCsi-U6／Neo／DsRed中构建重组质粒,转化大肠杆菌DHSa菌株扩增后,提取质粒测序分析,以相同的方法构建并鉴定eALAS基因的真核表达载体pEGFP-N1-eALAS;将3种pGCsi-U6／Neo／DsRed／eALAS-shRNA分别与pEGFP-N1-eALAS共转染HEK293细胞株,通过流式细胞仪检测pEGFP-N1-eALAS融合蛋白的荧光强度,选择最佳RNA干扰（RNAi）靶点,并在基因和蛋白水平检测eALAS的表达,进一步验证最佳RNAi靶点的敲减效率。结果经测序,模板序列与设计序列完全正确,最佳RNAi靶点敲减效率达72．45％,eALAS在基因和蛋白水平显著下降。结论成功构建了eALAs特异性RNAi表达载体,为下一步研究铁效应元件eALAS在铁代谢异常所致红系统疾病的机制奠定了基础。     

含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达。转染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。     

半乳糖凝集素-3对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达,设计合成galectin-3小干扰片段,筛选有效片段构建质粒,转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99,并设立对照组和空质粒转染组,RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达.活细胞计数法观察干扰后24、48,72 h各组细胞增殖情况;Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测转染72 h后各组细胞凋亡情况.组间比较用LSD法t检验进行统计学分析.结果 rHSC-99细胞表达galectin-3;成功构建pG Csilencer U6/Neo/GFP/shRNA,并经测序验证正确.转染效率为40%～50%,RT-PCR结果显示:RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%(F=136.432,P＜0.01),Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%(F=144.842,P＜0.01).干扰后48 h和72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%(F=4.425,P=0.010)和37.5%(F=4.415,P=0.018);干扰72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组:早期凋亡率增加155.2%,与对照组比较,F=27.588,P＜0.01;晚期凋亡率增加56.9%与对照组比较,F=12.798,P＜0.01.结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3;RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡.     

半乳糖凝集素-3对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达,设计合成galectin-3小干扰片段,筛选有效片段构建质粒,转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99,并设立对照组和空质粒转染组,RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达.活细胞计数法观察干扰后24、48,72 h各组细胞增殖情况;Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测转染72 h后各组细胞凋亡情况.组间比较用LSD法t检验进行统计学分析.结果 rHSC-99细胞表达galectin-3;成功构建pG Csilencer U6/Neo/GFP/shRNA,并经测序验证正确.转染效率为40%～50%,RT-PCR结果显示:RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%(F=136.432,P＜0.01),Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%(F=144.842,P＜0.01).干扰后48 h和72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%(F=4.425,P=0.010)和37.5%(F=4.415,P=0.018);干扰72 h时,galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组:早期凋亡率增加155.2%,与对照组比较,F=27.588,P＜0.01;晚期凋亡率增加56.9%与对照组比较,F=12.798,P＜0.01.结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3;RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡.     

严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白对环氧合酶-2表达的影响

目的 探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响.方法 将带有COX-2基因启动子的报告质粒分别与表达SARS-CoV基因组的单个基因的质粒共转染293T细胞,并测定荧光素酶的活性,采用RT-PCR和Western印迹法检测COX-2 mRNA和蛋白表达的变化.结果 SARS-CoV核衣壳蛋白能显著激活COX-2基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调COX-2的表达,且这种激活作用随着核衣壳蛋白浓度的增加而增强.结论 SARS-CoV核衣壳蛋白能特异性地激活COX-2的表达.     

腺病毒载体RNAi技术抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas表达

目的探讨RNAi技术对血吸虫病肝组织中Fas表达的作用。方法采用尾静脉注射腺病毒载体,在小鼠体内表达Fas-shRNA抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达。冰冻切片荧光显微镜检查腺病毒载体对肝细胞的转染率,免疫组化和Western Blot方法检测肝组织Fas表达情况,RT-PCR方法检测肝组织Fas mRNA表达情况。结果免疫组化和Western Blot方法检测均表明RNAi组Fas表达受到抑制(t=29.799,P<0.01),模型组和HK对照组Fas表达增强。对Fas mRNA表达的RT-PCR方法检测也与上述结果一致。腺病毒载体对肝细胞的转染率达78.5%。结论腺病毒载体Fas-shRNA能够有效抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达,尾静脉注射腺病毒载体能高效率感染肝细胞。     

小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究

目的构建靶向乙型肝炎病毒X基因（HBX）的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础。方法设计并构建靶向HBx的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3．1-HBx与pSilencer3．1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量。结果经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3．1-shHBX与设计一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47．1％,使HBx蛋白表达量降低58．9％,而阴性对照质粒无此作用。结论成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达。     

白细胞介素-1受体相关激酶-4短发夹RNA阻断库普弗细胞激活效应的实验研究

目的 探讨以白细胞介素-1受体相关激酶-4（IRAK-4）特异性短发夹RNA（shRNA）阻断内毒素诱导的库普弗细胞（KCs）激活效应的可行性。方法 构建两对表达IRAK-4-shRNA的阳性载体质粒（pSfIRAK-4-A，pSfIRAK-4-B）及一对阴性载体质粒（pSⅡRAK-4-C）。分离培养小鼠KCs，分为正常对照组，RNA干扰（RNAi）对照组（转染pSⅡRAK-4-C）与RNAi抑制组（转染pSⅡRAK-4-A，pSⅡRAK-4-B）。质粒转染后24h，加入0．1μg／ml脂多糖（LPS）。6h后，蛋白免疫印迹法及逆转录聚合酶链反应测定IRAK-4蛋白和mRNA表达水平；酶联免疫吸附法检测0、1、3、6、12h后KCs的核因子-κB（NFKB）活性及培养上清液中肿瘤坏死因子α含量。结果 RNAi抑制组IRAK-4表达水平，以及LPS刺激后NFKB活性、肿瘤坏死因子α峰值均明显低于正常对照组和RNAi对照组，t值分别为22．50，4．18及958．49，P〈0．01；尤其是pSⅡRAK-4-A组，抑制效果明显优于pSⅡRAK-4-B，t值分别为12．60，3．36及256．39，P〈0．01。结论 以IRAK-4为靶点的shRNA能有效的阻断内毒素诱导的KCs激活效应。