阿托伐他汀对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞体外干预后Toll样受体2、Toll样受体4的表达变化研究

目的：观察天然免疫分子Toll样受体2（TLR-2）、Toll样受体4（TLR-4）在强直性脊柱炎（ankylosing spondyli-tis,AS）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的mRNA水平表达,研究其与AS发病的相关性,并探讨阿托伐他汀是否对AS患者TLR-2、TLR-4的表达有影响。方法：研究对象包括AS活动期患者30例和健康志愿者30例,分别抽取外周静脉血分离单个核细胞,提取细胞mRNA。采用半定量的RT-PCR方法,检测AS患者和健康志愿者外周血单个核细胞中TLR-2、TLR-4的mRNA,通过灰度分析与β-actin相比得到目的基因相对表达水平。分离12例AS活动期患者静脉血外周血单个核细胞体外培养,并给予阿托伐他汀（终浓度为0.01 mmol/L）处理,以自身非处理细胞为对照,24 h后收获细胞,提取mRNA,采用RT-PCR方法,观察阿托伐他汀对细胞TLR-2、TLR-4的mRNA表达的影响。所有数据采用配对t检验。结果：AS患者TLR-2 mRNA的相对表达水平为（1.59±1.43）,较健康志愿者（0.06±0.039）高（P〈0.05）;AS患者TLR-4 mRNA的相对表达水平为（0.60±0.73）,较健康志愿者（0.06±0.039）高（P〈0.05）;阿托伐他汀干预组TLR-2和TLR-4的mRNA表达均低于不干预对照组（P〈0.05）。结论：AS患者PBMC的TLR-2、TLR-4的表达均较健康志愿者高,提示TLR-2和TLR-4可能参与了AS的发病。阿托伐他汀可下调AS患者PBMC的TLR-2和TLR-4的表达,可能是AS新的有价值的治疗靶点之一。     

层流低切应力刺激对人脐静脉血管内皮细胞Toll样受体mRNA表达的影响

目的用RT-PCR和Northern杂交技术,评价层流低切应力刺激对人脐静脉血管内皮细胞Toll样受体(TLR-4)信号受体表达的影响。方法用未刺激和经42μN/cm2处理1 h的脐静脉血管内皮细胞提取总RNA,采用RT-PCR和Northern杂交技术观察切应力刺激1 h人脐静脉血管内皮细胞TLR-2和TLR-4 mRNA的表达情况。结果RT-PCR和Northern杂交均显示,层流低切应力刺激1 h后血管内皮细胞TLR-4表达增强,TLR-2几乎无变化。结论层流低切应力可引起人脐静脉内皮细胞TLR-4mRNA表达增加,提示炎症信号受体TLR-4可能介导层流切应力诱导的血管内皮细胞某些效应基因的表达。     

Toll样受体-2对角质形成细胞分泌IL-8的影响

目的:观察白念珠菌刺激人角质形成细胞后IL-8的变化以及Toll样受体2(Toll-like receptor2,TLR-2)对IL-8分泌的影响,探讨角质形成细胞在皮肤免疫系统中的作用。方法:白念珠菌分别与抗TLR-2抗体预处理前后的角质形成细胞孵育,ELISA方法检测不同时间培养上清液IL-8的水平。结果:白念珠菌可引起IL-8明显升高(P<0.01),3h开始,至24h达到高峰;中和TLR-2受体后,虽然引起IL-8升高,但无统计学意义(P>0.05)。结论:白念珠菌可以刺激角质形成细胞分泌IL-8,TLR-2在角质形成细胞IL-8表达中的作用尚难确定。     

卡介苗活化的CD1-限制性细胞毒T细胞的抗膀胱癌效应

为研究卡介苗（BCG）活化的T细胞亚群在抗膀胱癌效应中的作用，通过细胞因子（IL－4与GM－CSF）体外诱导而获得高表达CD1分子的抗原提呈细胞，然后用BCG抗原致敏抗原提呈细胞以激活各T细胞亚群，比较BCG活化的T细胞亚群对膀胱癌细胞株T24生长抑制效应。结果表明：BCG活化的CD1－限制性T细胞具有明显的抗瘤活性，CD4^ T细胞和γδT也发挥抑制瘤细胞生长的作用。该研究结果提示具有非特异免疫功能的T细胞亚群在BCG抗膀胱癌效应中发挥重要作用。     

TLR-2、MMP-9与胆脂瘤型中耳炎的关系

Toll样受体2(TLR-2)是一种跨膜受体,在病原体感染机体中可发挥天然免疫作用,并通过其胞内信号转导而连接获得性免疫。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一种可降解细胞外基质的内肽酶,其作用底物为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原以及明胶等。近年来研究发现,相对于正常外耳道上皮、中耳的胆脂瘤上皮中TLR-2和MMP-9均为高表达。     

红色毛癣菌对人角质形成细胞模式识别受体TLR-2,TLR-4,Dectin-1表达及细胞因子分泌的影响

目的研究红色毛癣菌对人角质形成细胞模式识别受体TLR-2,TLR-4,Dectin-1表达及细胞因子分泌的影响,探讨角质形成细胞对红色毛癣菌的免疫应答及其机制。方法红色毛癣菌孢子与人永生化表皮细胞株HaCaT细胞共培养,采用Real time PCR检测共培养后HaCaT细胞TLR-2,TLR-4,Dectin-1mRNA的表达情况;采用流式细胞技术检测共培养后不同时间段HaCaT细胞TLR-2,TLR-4及Dectin-1平均荧光强度;采用蛋白芯片抗体阵列检测共培养上清液中36种不同的细胞因子,趋化因子和急性时相蛋白的表达情况。结果共培养6 h后,TLR-2,TLR-4,Dectin-1mRNA表达上调;共培养量明24显h增后加TL。R结-2,论T L人R角-4,质D形ec成tin细-1胞平对均红荧色光毛强癣度菌增的高免,细疫胞识因别子和I应L-答8,,I在-30一9,定IF程N-度γ,上IL可-6通,IL过-1上3调在红Ha色Ca毛T癣细菌胞刺中激模后式分识泌别受体TLR-2,TLR-4及Dectin-1后分泌多种细胞因子来实现。     

C型凝集素受体和Toll样受体在子前期重度患者胎盘中的表达

目的分析子前期(PE)患者胎盘组织中C型凝集素样受体家族中DC-SIGN和甘露糖受体(MR)以及Toll样受体(TLR)家族中TLR-2和TLR-4的表达情况。方法采集PE重度患者(PE组,n=20)及正常妊娠妇女(NP组,n=20)的新鲜胎盘标本;采用免疫组织化学技术对胎盘组织中DC-SIGN、MR、TLR-2和TLR-4的表达进行定位分析;采用Western blotting法检测胎盘组织中的DC-SIGN、MR、TLR-2和TLR-4的蛋白表达。结果两组胎盘组织中均有DC-SIGN、MR、TLR-2和TLR-4的表达,主要位于胎盘合体滋养层细胞,在细胞滋养层细胞中亦有少量表达。PE组与NP组比较,胎盘组织TLR-4阳性细胞表达率明显升高(P<0.01);DC-SIGN、MR阳性细胞表达率明显降低(P<0.01,P<0.05),TLR-2阳性细胞表达率的差异无统计学意义(P>0.05)。结论相对于正常晚期妊娠妇女,PE患者胎盘组织中C型凝集素受体DC-SIGN和MR表达减少,TLR-4过度表达;两种受体家族活化平衡失调可能是PE发病机制中的关键环节之一。     

heparanase通过调控EMT促进人膀胱移行细胞癌细胞T24迁移及侵袭的作用研究

目的 探讨乙酰肝素酶（heparanase）是否通过上皮-间充质转化（EMT）影响膀胱移行细胞癌细胞的侵袭及迁移能力.方法 利用荧光定量PCR来检测人膀胱移行细胞癌细胞T24、EJ、MGH-U1以及BIU-87中heparanase的表达水平;设计并合成靶向heparanase的特异性shRNA,通过脂质体转染法转染heparanase表达最高的膀胱移行细胞癌细胞T24以构建稳定低表达heparanase细胞株,通过Western blot法检测和定量PCR来验证shRNA的干扰效率;通过transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力,Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail和WNT-5a的变化.结果 heparanase-shRNA转染后,能够有效抑制T24细胞中heparanase的表达;Transwell法结果显示,heparanase干扰组细胞侵袭及迁移能力显著低于阴性对照组（P ＜0.001）.Western blot法检测结果发现,heparanase干扰组细胞的E-cadherin表达增加,N-cadherin的表达降低;此外,heparanase干扰组细胞的Snail以及WNT-5a表达较对照组显著下降.结论 运用RNA干扰技术能够有效沉默T24细胞的heparanase基因,并诱导其迁移侵袭能力的下降,其可能的机制是通过调节EMT的上游信号分子Snail、WNT-5a的表达来调控EMT,从而影响膀胱移行细胞癌细胞的迁移及侵袭.提示heparanases可能在膀胱移行癌T24细胞的发生发展中起重要作用,抑制heparanase的表达可能成为一种治疗膀胱移行细胞癌的新方法.     

C型凝集素受体和Toll样受体在子(癎)前期重度患者胎盘中的表达

目的 分析子(癎)前期(PE)患者胎盘组织中C型凝集素样受体家族中DC-SIGN和甘露糖受体(MR)以及Toll样受体(TLR)家族中TLR-2和TLR-4的表达情况.方法 采集PE重度患者(PE组,n=20)及正常妊娠妇女(NP组,n=20)的新鲜胎盘标本；采用免疫组织化学技术对胎盘组织中DC-SIGN、MR、TLR-2和TLR-4的表达进行定位分析；采用Western blotting法检测胎盘组织中的DC-SIGN、MR、TLR-2和TLR-4的蛋白表达.结果 两组胎盘组织中均有DC-SIGN、MR、TLR-2和TLR-4的表达,主要位于胎盘合体滋养层细胞,在细胞滋养层细胞中亦有少量表达.PE组与NP组比较,胎盘组织TLR-4阳性细胞表达率明显升高(P ＜0.01)；DC-S1GN、MR阳性细胞表达率明显降低(P＜0.01,P＜0.05),TLR-2阳性细胞表达率的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 相对于正常晚期妊娠妇女,PE患者胎盘组织中C型凝集素受体DC-SIGN和MR表达减少,TLR-4过度表达；两种受体家族活化平衡失调可能是PE发病机制中的关键环节之一.     

CpG-ODN对鼠巨噬细胞TLR-9及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响

目的探讨非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG-ODN)对鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7Toll样受体9(TLR-9)的表达及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响。方法体外培养小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞,逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western blot检测Cp-ODN,鸟嘌呤胞嘧啶二核苷酸序列(Non-CpG-ODN),CpG-ODN 氯喹刺激24h后巨噬细胞TLR-9的表达,放免法及ELISA法检测刺激前后巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-12(IL-12)的表达水平。结果刺激24h后,CpG-ODN与CpG-ODN 氯喹组巨噬细胞TLR-9 mRNA及蛋白的表达明显增加(P<0.01,P<0.05);细胞上清液中TNF-α水平CpG-ODN组明显高于其他组,差异有显著性(P<0.05);各组IL-6、IL-12水平无显著性差异(P>0.05)。结论CpG-ODN刺激可引起鼠巨噬细胞TLR-9表达增高,调节Th1/Th2类细胞因子的分泌。     

CD3AK细胞联合BCG对膀胱癌细胞的体外杀伤活性研究

目的探讨CD3AK细胞对膀胱癌细胞的体外杀伤活性,以及CD3AK细胞与BCG联合作用于膀胱癌细胞的效应.方法采用抗CD3单抗和IL-2共同刺激健康人外周血单个核细胞诱导出CD,AK细胞;以流式细胞仪测定细胞表型;用MTT法测定CD,AK以及CDaAK联合BCG对膀胱癌细胞系(T24)的杀伤活性.结果CD3AK细胞为异质细质细胞群,其细胞类型主要是CD8 细胞;在效靶比为10:1及20:1时,培养4 d的CD:,AK细胞BCG联合作用于T24细胞的杀伤率高于二者分别对T24细胞的杀伤率.结论CD3AK细胞是一种高效的抗肿瘤效应细胞,对膀胱癌细胞具有较强的杀伤作用;CD3AK细胞与BCG对膀胱细胞呈协同杀伤作用.CD3AK细胞在膀胱癌过继免疫治疗中具有重要的临床应用前景.     

卡介苗提取物体外诱导小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的 分离活卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)的有效组分,分析其有效组分诱导的小鼠脾淋巴细胞体外对人膀胱癌细胞株T24细胞的杀伤作用.方法 采用酶裂解法和超声波破碎法对活BCG进行裂解,通过Sephadex G100凝胶层析对其有效组分进行分离及分子量的测定,用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度鉴定;采用四氮唑盐(MTT)法测定BCG有效组分BCGE2诱导的小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞株T24细胞的杀伤活性.结果 BCGE2可体外诱导小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌细胞株T24细胞的杀伤作用,在效靶比为20:1时对T24细胞的抑制率为42.31％,而对照组仅为13.32％,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 BCGE2诱导的小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞株T24的杀伤作用很显著,且随着效靶比的增加而增强.     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

BT—BAK细胞和BCG膀胱腔内过继免疫治疗对膀胱癌患者全身免疫功能影响的比较

目的：观察BT-BAK细胞与BCG膀胱腔内灌注治疗对患者全身免疫功能的影响。方法：由手术切除的膀胱瘤标本制备膀胱肿瘤可溶性抗原,以BCG为佐剂,从PBMNC中诱导出抗膀胱肿瘤特异性细胞毒性BT-BAK细胞,临床选择72例浅表性膀胱癌术后患者随机平均分成2组分别进行BT-BAK和BCG的膀胱腔内灌注治疗。于不同阶段采用ELISA法测定患者外周血中IL-2、TNF-α及IFN-γ的含量;观察治疗后患者PBMNC对T24膀胱肿瘤细胞株杀伤活性的变化。结果：BT-BAK组患者血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平均较治疗前明显提高（P＜0.01);患者PBMNC对T24膀胱肿瘤细胞株的杀伤活性显著增强（P＜0.01)。BT-BAK组上述指标均高于BCG组（P＜0.05)。平均随访18.16个月,两组的复发率分别为2.7%和11.11%。结论：BT-BAK细胞及其培养上清进行膀胱腔内灌注治疗,能够有效提高膀胱癌术后患者的全身免疫水平,降低膀胱癌的术后复发率。     

CXCR4基因158沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响

目的 探讨CXCR4基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。 方法 将T24细胞分为3组,即干扰组、阴性对照组和空白对照组。采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默CXCR4基因的小干扰RNA(siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,Western-blot检测转染后T24细胞中CXCR4蛋白的表达水平,MTT比色法检测细胞凋亡,Transwell迁移试验观察T24细胞迁移能力。 结果 转染siRNA后,CXCR4蛋白表达量明显下调(P<0.05),与空白对照组及阴性对照组的T24细胞比较,沉默CXCR4基因后,显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(均为P<0.05),促进T24细胞凋亡(均为P<0.05); Transwell实验结果提示,RNAi干扰CXCR4表达后能显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(P<0.05)。 结论 RNAi干扰CXCR4表达水平能够抑制T24细胞增殖、促进细胞凋亡及降低细胞的迁移能力,推测CXCR4基因可能是膀胱肿瘤细胞增殖及迁移的重要调控因子之一。     

组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂联合抗癌药物对膀胱癌细胞功能影响的研究

目的:探究组蛋白甲基化酶EZH2特异性抑制剂UNC1999与针对DNA 的化疗药物丝裂霉素C对膀胱癌T24 细胞的抑制效应。方法:组蛋白甲基化酶EZH2特异性抑制剂UNC1999 和化疗药物丝裂霉素C单独使用或者联和使用处理T24细胞,Q-PCR法检测EZH2基因的表达水平,用Western blot法检测EZH2以及下游H3K27me3蛋白的表达水平,MTT法测定T24 细胞的增殖,划痕实验检测细胞的迁移,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:UNC1999与丝裂霉素C单独使用以及联合用药都能引起EZH2表达水平的下调,同时引起T24 细胞增殖能力降低, 迁移能力下降,凋亡水平上调,两者联合使用效果更加明显。结论:UNC1999以及MMC均可引起膀胱癌细胞EZH2表达水平的下调,同时联合使用效果最大, 可明显降低细胞的增殖侵袭能力,上调凋亡水平,为膀胱癌的化疗治疗、用药方法以及后续的机制研究提供了参考。     

HIV/AIDS患者外周血白细胞TLR-1、-2、-4和-6表达的初步研究

目的了解HIV/AIDS患者外周血白细胞Toll样受体(TLRs)的表达及其在HIV/AIDS疾病过程中的意义。方法应用流式细胞仪检测20例HIV/AIDS患者和15例健康人外周血多型核粒细胞、淋巴细胞和单核细胞表面TLR-1、TLR-2、TLR-4和TLR-6的表达水平。结果 TLR-1、TLR-2、TLR-4和TLR-6在外周血白细胞表面均有表达,与健康对照组比较,HIV/AIDS患者多型核粒细胞TLR-1[(967.44±215.01)%vs(1 159.51±210.17)%,P=0.014]、TLR-2[(1 614.91±346.66)%vs(2 101.87±236.28)%,P<0.001]、TLR-4[(1 735.31±443.28)%vs(2 539.08±842.96)%,P<0.001]和TLR-6[(1 102.96±259.32)%vs(1 357.36±155.49)%,P<0.001]的表达水平显著降低;淋巴细胞TLR-1[(922.09±271.04)%vs(728.19±184.31)%,P=0.024]、TLR-2[(961.81±419.21)%vs(617.72±2...     

环氧合酶-2抑制剂美洛昔康对人膀胱癌T24细胞体内外生长的影响

目的:探讨选择性环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂美洛昔康对膀胱癌T24细胞生长的体内外抑制作用.方法:RT-PCR检测人膀胱癌T24细胞株COX-2 mRNA表达,应用四唑氮蓝还原法研究选择性COX-2抑制剂美洛昔康对膀胱癌细胞T24生长的体外抑制作用.观察美洛昔康对裸鼠T24细胞移植瘤生长的体内抑制作用.结果:膀胱癌细胞株124中检测出了COX-2的表达,美洛昔康体外抑制膀胱癌细胞株T24的增殖呈剂量依赖性,体内抑瘤率达61.2%.各组裸鼠的体内实验中未见明显不良反应.结论:选择性COX-2抑制剂在体内外对膀胱癌T24细胞生长均具有显著的抑制作用,提示其可用于膀胱癌的防治.     

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞的影响及其与Toll样受体-2的相关性

目的观察结核分枝杆菌MPT 64抗原对RAW264．7巨噬细胞凋亡及Toll样受体-2（toll-like receptor2,TLR-2）表达的影响。方法将佛波肉苴蔻醋酸（phorbol myristoyl acetate,PMA）分化的RAW264．7巨噬细胞分为阴性对照组、卡介菌纯蛋白衍化物（purified protein derivative of BCG, BCG-PPD）诱导组、PPD＋MPT64共同作用组,孵育16h后,AnnexinV-FITC染色,用流式细胞技术（flowcytometry,FCM）和Westernblot检测细胞凋亡、细胞膜及细胞内TLR-2的表达情况。结果BCG-PPD可以诱导RAW264．7巨噬细胞凋亡,PPD＋MPT64作用组的细胞凋亡水平明显低于BCG-PPD组,随着MPT64蛋白浓度的逐渐增高,凋亡水平逐渐降低。FCM和Western blot技术检测结果表明,BCG-PPD组的TLR-2表达水平明显高于阴性对照组,在诱导16h达到高峰。而在PPD＋MPT64组,细胞膜及细胞内的TLR-2水平均明显低于BCG-PPD组。结论MPT64抗原能够抑制PPD诱导的巨噬细胞凋亡,可能通过调节TLR-2的表达水平来实现。MtrI＇64抗原可能是一种毒力因子,在结核分枝杆菌感染机体的过程中,通过抑制巨噬细胞凋亡参与宿主与结核分枝杆菌的相互作用。     

linc00346调控膀胱癌细胞增殖的分子机制

目的：探讨长链非编码RNA-linc00346 调控膀胱癌细胞增殖的分子机制。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测膀胱尿路上皮癌组织中linc00346 mRNA和PTEN mRNA的表达情况;沉默膀胱癌T24细胞系内linc00346的表达,通过RT-PCR检测T24细胞内的linc00346 mRNA和PTEN mRNA表达变化情况,通过蛋白质印迹（Western blot）法检测T24细胞内PTEN蛋白和PI3K/Akt信号通路中Akt、p-Akt蛋白的表达情况;CCK-8实验检测各组T24细胞的增殖能力。结果：与膀胱正常组织比较,膀胱尿路上皮癌组织中linc00346 mRNA表达上调,而PTEN mRNA的表达水平降低（均P ＜0.05）。沉默linc00346表达后,T24细胞内linc00346 mRNA的表达水平显著下降,PTEN mRNA的表达水平显著上调,PTEN蛋白水平升高,p-Akt蛋白水平降低（均P ＜0.05）;给予PTEN特异性抑制剂SF1670处理后,PTEN蛋白水平显著下调,p-Akt蛋白水平明显增加（均P ＜0.05）。沉默linc00346表达后,T24细胞的增殖能力明显受到抑制,给予SF1670处理后细胞的增殖能力显著增强（均P ＜0.05）。结论：linc00346可以增强膀胱尿路上皮癌细胞的增殖能力,其作用机制可能是通过抑制PTEN表达,激活PI3K/Akt信号通路实现的。