人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明,白细胞介素12是一种强有力的抗肿瘤细胞因子,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,因此,利用携带白细胞介素12基因的间充质干细胞对于肿瘤的治疗具有极大的发展前景.目的:构建人白细胞介素12 5型腺病毒载体(Ad hIL-12),感染人骨髓间充质干细胞,检测白细胞介素12的表达.方法:提取成熟的树突状细胞的总RNA,用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA,p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点连接,构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒.采用Ad MaxTM腺病毒载体体系,pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt△E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12.Ad hIL-12感染人骨髓间充质干细胞后经γ射线照射使细胞失去增殖能力,用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中白细胞介素12的水平.结果与结论:经测序证实,RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882(762 bp)和NM_002187(987 bp)提供的序列完全一致.用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白;Ad hIL-12腺病毒载体感染人骨髓间充质干细胞后可持续高水平分泌白细胞介素12,在以人骨髓间充质干细胞为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景.     

骨髓间充质干细胞分泌的蛋白及其功能

骨髓间充质干细胞的主要功能是支持和营养造血细胞,其提供的微环境由其分泌的可溶性物质、细胞表面分子以及细胞外基质组成,这二者中研究较多并且更有现实意义的是骨髓间充质干细胞分泌的可溶性物质.骨髓间充质干细胞除了可以分泌一些造血功能必须的细胞因子,如白细胞介素6、白细胞介素7、白细胞介素8、白细胞介素1 1、白细胞介素12、白细胞介素14、白细胞介素15、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和干细胞因子,长期支持造血干细胞的造血功能.还可以分泌许多神经营养因子,如脑源性神经营养因子、胶质源性神经营养因子、神经生长因子、表皮生长因了、碱性成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子、肝细胞生长因子和血小板衍生的生长因子等,这些因子可以参与中枢神经系统的神经再生,促进损伤脑组织的生存与重塑.     

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性.目的:拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-R细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成.材料:原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdlL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建.方法:分离培养SD大鼠骨髓间允质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:以反转录聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达. 结果:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Westem Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达.结论:应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞.     

骨髓间充质干细胞中大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒的表达

背景:研究显示,白细胞介素10在脓毒症等炎性疾病发挥了抑制炎症反应、促进疾病转归的重要作用。目的:构建大鼠白细胞介素10重组腺病毒,并以骨髓间充质干细胞为基因载体,观察外源基因在细胞中的表达情况。方法:采用反转录-聚合酶链反应方法从SD大鼠新鲜脾脏组织中提取出的总RNA中克隆大鼠白细胞介素10基因,通过AdEasy系统成功包装、扩增并纯化出含目的基因的重组腺病毒颗粒。取大鼠骨髓细胞,利用密度梯度离心法和贴壁法分离并扩增骨髓间充质干细胞,并使用流式细胞仪进行表型鉴定。以不同感染倍数的Ad.rIL-10/Ad.GFP感染骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,并用反转录-聚合酶链反应和Weaternblot方法检测目的基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结果与结论:成功构建了重组腺病毒Ad.rIL-10,计算病毒滴度为6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒Ad.rIL-10对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率,当感染复数=200时为70%。提示含外源基因大鼠白细胞介素10的骨髓间充质干细胞持续高效地表达目的基因,是基因治疗的良好细胞载体。     

干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子与心肌梗死大鼠体内骨髓间充质干细胞的迁移

背景:外周静脉移植间充质干细胞只有1%～5%的移植细胞能归巢到心肌梗死区域。目的:观察干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子对骨髓间充质干细胞归巢的影响。方法:采用贴壁培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取传至3～5代细胞。建立SD大鼠急性心肌梗死模型,干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组、干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组在骨髓间充质干细胞移植前3d和移植后3d单独或混合皮下注射干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子,骨髓间充质干细胞组不注射细胞因子。结果与结论:荧光显微镜下观察,骨髓间充质干细胞迁移至心肌梗死组织,骨髓间充质干细胞组、干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组迁移至心肌梗死区的骨髓间充质干细胞数量没有明显的区别(P>0.05),干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组的骨髓间充质干细胞数量明显高于其他3组(P<0.05)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白cTnI。结果说明干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子两种细胞因子联合应用可以促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞能够转化为心肌样细胞。     

特尔立联合自体骨髓干细胞移植治疗终末期肝病的临床观察与护理

干细胞在骨髓中含量丰富,包括骨髓间充质干细胞(MMSCs)和造血干细胞,MMSCs是一类具有多分化潜能的均质性细胞,目前许多研究表明它可诱导分化为成熟的肝细胞或胆管细胞,而且肝细胞因子等细胞因子或微环境对干细胞的定向分化起重要作用。重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(特尔立)可刺激骨髓祖细胞的增殖、分化,同时刺激粒细胞、单核细胞的增殖,提高外周血白细胞数量,激活巨噬细胞,增强机体抵抗     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

钙黏蛋白11和核心结合因子α1双基因修饰人骨髓间充质干细胞

背景:钙黏蛋白11对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,可促进细胞的黏附性能.利用核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,有望实现多能干细胞的成骨定向分化,并在诱导成骨分化的级联效应中发挥重要的信号作用.目的:拟采用腺病毒为载体,介导钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞,观察两基因的表达情况.设计、时间及地点;细胞-基因学实验,于2008-08在珠江医院中心实验室完成.材料:人骨髓间充质干细胞来源于1例胸椎骨折男性患者,由珠江医院提供,患者对实验知情同意.钙黏蛋白11全长cDNA质粒由日本神户理研Riken分子生物中心Takeichi教授惠赠,全长核心结合因子α1基因质粒由美国Baylor医学院Ducy博士提供,pAdeasy腺病毒系统由美国约翰霍普金斯遗传所Bert博士馈赠.方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞.利用PCR技术获得钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因,分别构建到腺病毒穿梭载体上,然后分别通过同源重组获得重组腺病毒质粒,再将两病毒质粒包装获得重组病毒液,最后通过病毒将两基因导入骨髓间充质干细胞.主要观察指标:Western blot法检测钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因在入骨髓间充质干细胞中的表达.结果:获得携带钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因的病毒液,将其感染人骨髓间充质干细胞后,以Wastern blot检测两种基因同时获得高表达.结论:实验成功构建钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因腺病毒载体,通过病毒转染入骨髓间充质干细胞,二者获得高效表达.     

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突状细胞的免疫学效应

背景:沉默树突状细胞发育成熟的关键基因核因子кB/RelB可构建新型致耐受树突状细胞? 目的:探讨RelB shRNA转染小鼠骨髓树突细胞的生物免疫学功能的影响.方法:利用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素4联合诱导小鼠骨髓树突状细胞;慢病毒载体将RelB shRNA转染致小鼠骨髓树突细胞后,分为未成熟树突状细胞、脂多糖刺激成熟、RelB基因沉默及脂多糖刺激RelB沉默的4组树突状细胞进行观察.结果:体外培养第 6 天脂多糖刺激组细胞表面可见大量细长的类似树枝的突起,其他3组细胞形态特征相似,呈圆形、皱缩状态,这3组细胞表面MHC-II类分子、CD86和CD40分子表达水平相当,但低于脂多糖刺激组;3组混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05),但均较脂多糖刺激组显著降低(P < 0.01);RelB基因沉默的树突状细胞分泌Th1细胞因子γ-干扰素和白细胞介素2的能力较低,分泌Th2白细胞介素10和白细胞介素4的能力较高(P < 0.01),Th1/Th2细胞因子的比例与未成熟树突状细胞类似.说明RelB shRNA经慢病毒转染骨髓源性树突状细胞后,在细胞形态、表面分子表达、免疫学功能等方面均具有与未成熟树突状细胞相似的特点,且不能被脂多糖刺激成熟.     

养心通脉有效部位方与急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的动员及定向归巢

背景:急性梗死心肌修复过程中,寻找可有效提高外周血骨髓间充质干细胞的数量、并动员其定向归巢于损伤心肌的骨髓间充质干细胞动员剂尤为关键.目的:探讨养心通脉有效部位方对急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞动员入血及定向归巢于梗死心肌的影响.方法:养心通脉有效部位方主要成分包括人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖等,由中南大学药学院依课题组稳定的制作工艺制作提供.SD大鼠70只,取8只大鼠作为正常对照组,剩余62只大鼠建立急性心肌梗死模型.取造模成功的32只大鼠,随机分为养心通脉有效部位方组、复方丹参注射液组、重组人粒细胞集落刺激因子组、模型对照组,各组均于造模3 h后给与对应药物,连续5 d.流式细胞仪检测外周血CD34+细胞数,免疫组化染色检测梗死心肌边缘区CD34+细胞数.结果与结论:与模型对照组比较,重组人粒细胞集落刺激因子组、养心通脉有效部位方组外周血CD34+细胞数均明显增加(P < 0.01);心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数均显著增加(P < 0.01).与重组人粒细胞集落刺激因子组比较,养心通脉有效部位方组心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数显著增加(P < 0.01).养心通脉有效部位方能促进骨髓干细胞动员入血,并定向归巢于梗死心肌,其作用与重组人粒细胞集落刺激因子大体相当,在归巢CD34+细胞方面甚至强于重组人粒细胞集落刺激因子,是一种良好的骨髓间充质干细胞动员剂.     

骨髓间充质干细胞干预再生障碍性贫血患者树突状细胞的成熟分化

背景：骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞增殖的影响国内仅见少量报道,而骨髓间充质干细胞是否通过调节树突状细胞来影响再生障碍性贫血患者T细胞的增殖,国内未见报道,其机制值得深入研究.目的：观察骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者树突状细胞的免疫调节作用.方法：将培养第5天的再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞来源的树突状细胞与第3代健康人骨髓间充质干细胞混合培养,加入脂多糖、肿瘤坏死因子促树突状细胞成熟,应用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞与未成熟、成熟树突状细胞共培养前后树突状细胞表面标志表达.结果与结论：未成熟的树突状细胞在脂多糖的刺激诱导下与骨髓间充质干细胞共培养前后,树突状细胞表面标志CD14,CD1a,CD83,CD80表达无变化（P〉0.05）;成熟树突状细胞与骨髓间充质干细胞共培养前后,树突状细胞表面标志CD14,CD1a,CD83,CD80表达降低（P〈0.05）.结果说明骨髓间充质干细胞可抑制再生障碍性贫血患者单核细胞来源的树突状细胞的发育和成熟,进而发挥调节再生障碍性贫血患者的免疫作用.     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓问充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。结果与结论：慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上。F盯．PCR和Westernblot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。     

胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

背景：间充质干细胞最先在骨髓中发现,且骨髓间充质干细胞的相关研究也最多,但是骨髓间充质干细胞来源有限且含量极低。近年来,已经从人胚胎组织分离出间充质干细胞,其与骨髓间充质干细胞在生物学特性上有很多相似之处,但是二者的成脂诱导能力比较尚无明确报道。目的：比较人胚胎组织与骨髓来源间充质干细胞体外增殖能力及成脂诱导能力。方法：采用全骨髓法获得骨髓间充质干细胞,胶原酶消化法获得胚胎组织间充质干细胞。流式细胞术鉴定两种间充质干细胞表面分子标记。用细胞计数方法检测两种间充质干细胞增殖能力。分别向两种细胞培养体系中加入成脂诱导剂诱导14d,经油红O染色后观察并计数,计算不同来源间充质干细胞的成脂诱导分化率。结果与结论：从两种不同组织中均可获取梭形贴壁的间充质干细胞,表面标记物CD44、CD73、CD90和CDl05均呈阳性表达,CDl4、CD34和CD45均为阴性表达;胚胎组织间充质干细胞的增殖能力明显强于骨髓间充质干细胞（P〈0．01）。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经过成脂诱导液诱导14d后,油红O染色结果均为阳性,但是骨髓间充质干细胞体外成脂能力明显强于胚胎组织间充质干细胞（P〈0．01）。     

骨髓间充质干细胞在多发性骨髓瘤活动与缓解期具有不同的促血管生成能力

背景：活动期和缓解期多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的血管生成能力有无差异目前尚不清楚。目的：观察多发性骨髓瘤活动期及缓解期骨髓间充质干细胞促血管生成能力的差异。方法：抽取13例多发性骨髓瘤患者治疗前和4个周期治疗后的骨髓,分离培养出骨髓间充质干细胞,采用ELISA 方法测定骨髓间充质干细胞培养上清液中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的浓度;MTT检测骨髓间充质干细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞增殖能力的影响;通过Transwel 小室观察骨髓间充质干细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞运动能力的影响;通过人工基底膜实验观察骨髓间充质干细胞体外促血管生成和成管能力。结果与结论：活动期多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养上清中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子浓度明显高于缓解期（P〈0.05）;骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞上清对脐静脉内皮细胞增殖作用呈剂量依赖性,活动期明显强于缓解期（P〈0.05）;活动期骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞上清对脐静脉内皮细胞迁移作用明显高于缓解期（P〈0.05）;骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞体外具有明显成血管作用,活动期明显强于缓解期（P〈0.05）。结果提示多发性骨髓瘤活动期骨髓间充质干细胞促血管生成能力明显大于缓解期。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1．073g／mL的Percoll分离液,3000r／minx30min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2000—2500r／min×（20—30）min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基（对照组）和成骨诱导培养基（实验组）中培养。结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组（P〈0．05）。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向血管平滑肌样细胞的诱导分化

背景：有研究表明,血管外膜成纤维细胞被激活早期参与动脉粥样硬化及血管再狭窄的形成,另有研究表明,骨髓间充质干细胞有部分黏附分化参与血管重塑,实验拟从血管外膜成纤维细胞与骨髓间充质干细胞之间相互作用的角度,来探讨动脉硬化及血管损伤后再狭窄过程中的可能机制。目的：观察骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞直接接触培养后,骨髓间充质干细胞形态改变及表达血管平滑肌肌动蛋白的情况。方法：将骨髓间充质干细胞（DAPI标记细胞核）与外膜成纤维细胞按一定的比例混合培养7d,细胞单独培养作对照,显微镜下观察细胞形态变化,免疫荧光检测骨髓间充质干细胞平滑肌肌动蛋白表达的情况。结果与结论：骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞共培养后,可见骨髓间充质干细胞的细胞核蓝染（DAPI标记细胞核）、胞浆红染（平滑肌肌动蛋白阳性）的双标细胞出现,且随培养时间的延长,骨髓间充质干细胞的平滑肌肌动蛋白表达阳性率明显增高。结果可见与血管外膜成纤维细胞直接接触有诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞分化的趋势。     

Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

背景：相关实验表明Bio-Gide胶原膜与细胞有良好的生物相容性,但有关与其复合培养干细胞成骨分化能力的报道少见。 目的：观察Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,将第3代兔骨髓间充质干细胞分别接种于覆盖Bio—Gide胶原膜的培养板（实验组）与单纯培养板（对照组）培养。于培养1,4,7,14d利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖;成骨分化诱导培养1,4,7,14d收集细胞培养液上清,检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：两组细胞数量均随着培养时间的增加而不断增加,对照组培养7d细胞数量明显多于实验组（P〈0．05）,其他时间点组间比较差异无显著性意义。两组细胞碱性磷酸酶活性均随着培养时间的增加而不断增加,实验组成骨诱导14d细胞碱性磷酸酶活性高于对照组（P〈0．05）,其他时间点组间比较差异无显著性意义。表明Bio-Gide胶原膜可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。     

骨髓间充质干细胞体外构建工程化心肌组织的生存

背景：到目前为止,工程化心肌组织仍然面临很多的问题。研究证实,骨髓间充质干细胞可分化为心肌样细胞;聚乙交酯、聚己内酯为常用的人工高分子材料,生物相容性良好。目的：观察体外构建骨髓间充质干细胞-聚乙交酯-聚己内酯共聚物补片在正常心肌组织和梗死后心肌组织中的生长情况。方法：SD大鼠骨髓间充质干细胞采用贴壁分离筛选法进行分离、培养,选取第3代进行体外DAPI标记。制作骨髓间充质干细胞悬液（2×106/cm2）种植于聚乙交酯-聚己内酯共聚物上形成骨髓间充质干细胞-聚乙交酯-聚己内酯共聚物补片。培养48 h在电镜下观察;苏木精-伊红染色后在光学显微镜下观察。大鼠结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。将补片植入到正常心肌组织和梗死后心肌组织培养5周,行病理学检查了解骨髓间充质干细胞在组织中的存活情况。结果与结论：光学显微镜和电镜观察结果示,骨髓间充质干细胞在聚乙交酯-聚己内酯共聚物支架中呈三维生长,细胞与支架黏附良好。在激光共聚焦显微镜下,对比观察补片植入正常心肌组织后第1周和第5周切片结果,同第1周相比,第5周的心肌组织内出现DAPI标记的骨髓间充质干细胞;心肌梗死区出现DAPI标记的骨髓间充质干细胞。苏木精-伊红染色结果示,梗死区出现骨髓间充质干细胞。提示骨髓间充质干细胞在聚乙交酯-聚己内酯共聚物支架上贴附生长,黏附良好。骨髓间充质干细胞-聚乙交酯-聚己内酯共聚物补片可用于心肌组织修复。     

携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达

背景：人低氧诱导因子1α可调控其下游成骨及成血管基因的表达,具有提高成骨活性的作用。目的：观察携带人低氧诱导因子1α慢病毒感染的大鼠骨髓间充质干细胞中成骨基因表达情况。方法：通过RT-PCR方法从Hela细胞中获得低氧诱导因子1α,构建携带低氧诱导因子1α的慢病毒表达质粒Lenti-HIF-1α-eGFP,与LentiPac HIV混合包装质粒共包装293Ta细胞,获得病毒;采用全骨髓直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,使用流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行鉴定。分别在慢病毒感染骨髓间充质干细胞1,4,7,14 d后,用实时荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。结果与结论：Lenti-HIF-1α-eGFP有效地感染骨髓间充质干细胞,实时荧光定量PCR检测结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶在Lenti-HIF-1α-eGFP感染后第4天开始明显过表达,且持续至14 d。结果表明低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞的成骨活性。