脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。
　　目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。
　　方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用 MTT 比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的 DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。
　　结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

不同品系大鼠皮下脂肪源干细胞诱导分化能力的比较

目的:对比SD大鼠和Wistar大鼠皮下脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外诱导分化能力,为ADSCs的进一步应用提供实验依据。方法:SD大鼠和Wistar大鼠各6只取腹股沟脂肪垫,培养扩增ADSCs,相差显微镜下观察两个品系来源的ADSCs的形态。用第4代细胞进行成骨和成脂诱导,分别用茜素红和油红O染色观察向成骨细胞分化后的矿化结节和向脂肪细胞分化后的脂质沉积。结果:两个品系来源的ADSCs在细胞形态上没有显著区别,都能进行成骨和成脂诱导分化。结论:SD大鼠和Wistar大鼠腹股沟脂肪垫来源的ADSCs诱导分化能力差异无显著性。     

不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的：对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较，为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。 方法：实验于2004-11／2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者（平均年龄32岁）8个部位（大腿前侧、臀上部；臀上部、上腹部；髂腰部；上腹部；背部、上臂）脂肪抽吸组织中的间充质干细胞，体外进行成脂诱导分化。在对照培养基（含体积分数0．1胎牛血清的DMEM培养基）中培养的第l代脂肪干细胞，以3&;#215;10^-4细胞／皿接种到35mm培养皿中，将对照培养基更换为成脂诱导培养基，进行成脂诱导，每周换液2次，以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周，分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色，以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数，分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测，采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。 结果：①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果：从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同，从2.45&;#215;10^8-／100mL-1.25&;#215;10^9个／100mL不等；但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似；根据各例细胞成脂诱导分化率，可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36．2％。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力，获得的平均干细胞数目与年龄无关（r=0．098，P=0．817），而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关（r=-0．568，P〈0．01。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大，分化为成脂细胞，细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴，多者可占整个细胞体积的80％-90％，细胞核缩小或偏于细胞的一侧，呈阳性；而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成，呈阴性。 结论：患者年龄越大，成脂分化率越低，且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时，在患者年龄和取材部位上应有所选择，进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞

背景：国内均可见有探讨脂肪干细胞向神经元诱导分化的相关研究报道,但运用差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞,多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的研究鲜有报道。目的：观察多因子联合诱导和分步诱导方案诱导大鼠脂肪组织源性干细胞体外分化为神经元样细胞的可行性。方法：取SD雄性大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织,酶消化法分离、差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞。免疫荧光细胞化学法鉴定脂肪组织源性干细胞（CD44,CD49d,CD106）;＂鸡尾酒＂式神经元诱导培养基对脂肪组织源性干细胞进行诱导分化,并用免疫荧光细胞化学法鉴定（Nestin和NeuN）分化结果。结果与结论：大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织内分离、原代培养的脂肪组织源性干细胞形态均一,呈长梭形,细胞核椭圆形,核仁明显,细胞质染色浅,呈旋涡状克隆样生长;CD44和CD49d阳性表达而CD106阴性;诱导培养基内培养6h后脂肪组织源性干细胞呈锥体形或不规则,有短而细的指状突起;24h后多数细胞显示类神经元的形态学特征,且Nestin和NeuN阳性。提示肪组织源性干细胞在多因子＂鸡尾酒＂式培养基内可向神经元方向分化。     

多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞

背景:国内均可见有探讨脂肪干细胞向神经元诱导分化的相关研究报道,但运用差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞,多因子联合诱导脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的研究鲜有报道。目的:观察多因子联合诱导和分步诱导方案诱导大鼠脂肪组织源性干细胞体外分化为神经元样细胞的可行性。方法:取SD雄性大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织,酶消化法分离、差速贴壁法纯化脂肪组织源性干细胞。免疫荧光细胞化学法鉴定脂肪组织源性干细胞(CD44,CD49d,CD106);"鸡尾酒"式神经元诱导培养基对脂肪组织源性干细胞进行诱导分化,并用免疫荧光细胞化学法鉴定(Nestin和NeuN)分化结果。结果与结论:大鼠腹股沟和附睾脂肪垫脂肪组织内分离、原代培养的脂肪组织源性干细胞形态均一,呈长梭形,细胞核椭圆形,核仁明显,细胞质染色浅,呈旋涡状克隆样生长;CD44和CD49d阳性表达而CD106阴性;诱导培养基内培养6h后脂肪组织源性干细胞呈锥体形或不规则,有短而细的指状突起;24h后多数细胞显示类神经元的形态学特征,且Nestin和NeuN阳性。提示肪组织源性干细胞在多因子"鸡尾酒"式培养基内可向神经元方向分化。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景:脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的:构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法:切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论:体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈＂S＂型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的:对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较,为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。方法:实验于2004-11/2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者(平均年龄32岁)8个部位(大腿前侧、臀上部;臀上部、上腹部;髂腰部;上腹部;背部、上臂)脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,体外进行成脂诱导分化。在对照培养基(含体积分数0.1胎牛血清的DMEM培养基)中培养的第1代脂肪干细胞,以3×104细胞/皿接种到35mm培养皿中,将对照培养基更换为成脂诱导培养基,进行成脂诱导,每周换液2次,以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周,分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色,以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数,分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测,采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。结果:①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果:从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同,从2.45×108个/100mL～1.25×109个/100mL不等;但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似;根据各例细胞成脂诱导分化率,可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36.2%。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力,获得的平均干细胞数目与年龄无关(r=0.098,P=0.817),而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关(r=-0.568,P<0.01)。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大,分化为成脂细胞,细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴,多者可占整个细胞体积的80%～90%,细胞核缩小或偏于细胞的一侧,呈阳性;而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成,呈阴性。结论:患者年龄越大,成脂分化率越低,且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时,在患者年龄和取材部位上应有所选择,进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

来源于大鼠腹股沟皮下脂肪垫与附睾周围脂肪的间充质干细胞生物学特性的对比研究

目的:分离培养大鼠腹股沟皮下和附睾周围脂肪的间充质干细胞(ADMSC),研究两种不同来源的间充质千细胞的生物学特征.方法:分离提取Wistar大鼠腹股沟皮下和附睾周围脂肪中的ADMSC,进行体外培养.观察细胞形态,计算细胞的收获情况,MTT法检测细胞的生长增殖状态,应用流式细胞仪检测细胞表面标志CD44以及细胞周期.地塞米松、胰岛素定向诱导后,油红O染色检测细胞内的中性脂肪.结果:单位质量腹股沟皮下和附睾周围脂肪组织中获得的间充质干细胞数量存在差异,两处细胞形态均为条索样.不同的时间点两处细胞的贴壁率相似,并且有同向变化的趋势.两处细胞的增殖能力相当.两处细胞绝大多数处于G0/G1,无明显差异.两处细胞表面标记CD44均为阳性.两处细胞经成脂诱导后,胞浆中有脂滴形成,经油红O染色,脂滴呈鲜红色.结论:从不同部位提取的ADMSC仅在单位质量组织所获得干细胞数量上存在差异,即单位质量的附睾周围脂肪中获取的干细胞数多于腹股沟皮下脂肪垫中获取的干细胞数.两处细胞的其他生物学特性以及成脂分化能力没有明显差异.     

人颊脂垫脂肪干细胞与皮下脂肪干细胞生物学特性的比较

背景:在人脂肪干细胞的研究中,针对其内脏脂肪与皮下脂肪生物学特性的比较较多,对人颊脂垫部位脂肪干细胞的研究较少。目的:提取人颊脂垫脂肪干细胞进行体外增殖及成骨诱导培养,观察其细胞生物学特性,并与皮下脂肪来源脂肪干细胞进行对比。方法:分别提取面部轮廓整形手术获取的人颊脂垫与皮下吸脂术获取的皮下脂肪中的脂肪干细胞,进行体外传代培养与成骨诱导,对二者细胞浓度、增殖活性、成骨能力等指标进行对比观察。结果与结论:人颊脂垫为特化脂肪组织,血管成分明显多于皮下脂肪。颊脂垫提取脂肪干细胞浓度显著高于吸脂术来源者;CCK-8实验生长曲线显示颊脂垫来源脂肪干细胞增殖活性亦高于吸脂术来源脂肪干细胞(P<0.05);经成骨培养后第3,7,14天碱性磷酸酶染色,颊脂垫来源脂肪干细胞成骨活性优于吸脂来源脂肪干细胞(P<0.05)。表明颊脂垫作为特化的深部脂肪组织,其包含的脂肪干细胞生物学特性明显优于吸脂来源者,且由于其解剖毗邻关系,是口腔颌面部骨组织工程理想的种子细胞库。     

不同麻醉肿胀液干预脂肪干细胞的生长增殖与成脂分化

背景：不同的麻醉肿胀液成分及浓度对脂肪细胞及所获取的人脂肪干细胞的生物学特性是否存在毒性反应等负面影响,至今仍不得而知,国内外亦未见相关研究报道。目的：观察不同麻醉肿胀液对体外培养条件下人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响,以减少麻醉药物对其损害,提高人脂肪干细胞的利用率。方法：分离人脂肪干细胞并行原代及传代培养,取P3代细胞以终浓度为0.2g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液进行干预,并设立对照组。分析人脂肪干细胞受损及生长增殖情况并比较其成脂分化率。结果与结论：与对照组比较,各麻醉组每个时间点细胞上清液中乳酸脱氢酶值均增高,吸光度值降低,差异均有显著性意义（P〈0.05）;而布比卡因组与利多卡因组、罗哌卡因组比较,差异也有显著性意义（P〈0.05）。但各麻醉组人脂肪干细胞成脂分化率与对照组比较,差异无显著性意义（P〉0.05）。说明终浓度为0.2g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液对人脂肪干细胞生长增殖有一定的抑制作用,但不影响其成脂分化能力。     

胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

背景：间充质干细胞最先在骨髓中发现,且骨髓间充质干细胞的相关研究也最多,但是骨髓间充质干细胞来源有限且含量极低。近年来,已经从人胚胎组织分离出间充质干细胞,其与骨髓间充质干细胞在生物学特性上有很多相似之处,但是二者的成脂诱导能力比较尚无明确报道。目的：比较人胚胎组织与骨髓来源间充质干细胞体外增殖能力及成脂诱导能力。方法：采用全骨髓法获得骨髓间充质干细胞,胶原酶消化法获得胚胎组织间充质干细胞。流式细胞术鉴定两种间充质干细胞表面分子标记。用细胞计数方法检测两种间充质干细胞增殖能力。分别向两种细胞培养体系中加入成脂诱导剂诱导14d,经油红O染色后观察并计数,计算不同来源间充质干细胞的成脂诱导分化率。结果与结论：从两种不同组织中均可获取梭形贴壁的间充质干细胞,表面标记物CD44、CD73、CD90和CDl05均呈阳性表达,CDl4、CD34和CD45均为阴性表达;胚胎组织间充质干细胞的增殖能力明显强于骨髓间充质干细胞（P〈0．01）。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经过成脂诱导液诱导14d后,油红O染色结果均为阳性,但是骨髓间充质干细胞体外成脂能力明显强于胚胎组织间充质干细胞（P〈0．01）。     

缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞与自体脂肪移植

背景：自体颗粒脂肪组织作为理想的填充材料用于美容与重建修复领域,但因其移植后组织大量被吸收,严重影响了远期效果。目的：观察缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞对自体移植脂肪组织存活率的影响。方法：取健康成年人吸脂术后的脂肪组织分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,传至第3代,调整细胞浓度为1×109L-1,经缺氧诱导因子1α基因转染后调整细胞浓度为1×1011L-1备移植时使用;同时选用同一抽脂术后的脂肪组织颗粒并进行纯化,利用纤维蛋白胶的物理特性制备不同成分脂肪组织复合移植物,在20只裸鼠背部皮下随机分离3个腔隙,实验分为3组：基因修饰组移植经缺氧诱导因子1α基因修饰的脂肪干细胞＋脂肪组织＋纤维蛋白胶;基因未修饰组移植单纯脂肪干细胞＋脂肪组织＋纤维蛋白;生理盐水组移植生理盐水＋脂肪组织＋纤维蛋白。结果与结论：移植后3个月和6个月,各组移植物血管密度比较,基因修饰组〉基因未修饰组〉生理盐水组,组间比较差异有显著性意义（P〈0.05）;各组移植物脂肪细胞纤维坏死率比较,基因修饰组〈基因未修饰组〈生理盐水组,组间比较差异有显著性意义（P〈0.05）;各组移植物脂肪质量保持率比较,基因修饰组〉基因未修饰组〉生理盐水组,组间比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结果证实,缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞可促进移植脂肪组织局部的血管再生,促进脂肪细胞的成活,增加脂肪组织的质量保持率,减少脂肪移植术后的纤维坏死程度。     

脂肪干细胞的三维球形培养简

背景：大多哺乳类细胞在正常生理状态下多以三维结构存在,为还原细胞本身在体内的自然状态,很多研究者开始尝试在体外对细胞进行三维培养,球形培养是一种常见的三维培养模式。目的：尝试用3种不同的方法在体外对人脂肪干细胞进行球形培养,并观察其生物学特征。 方法：对提取的脂肪来源细胞进行表面 Marker 流式检测以及成脂成骨诱导鉴定后,证实为脂肪干细胞。先后用低黏附培养法、hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法3种方法在体外对脂肪干细胞进行球形培养,对3种方法形成球形的特点进行比较分析,并通过 Imagej 软件计算出3组多细胞球体的平均面积,利用Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live＆amp;Dead Cel s试剂盒对3组多细胞球体进行活力检测。结果与结论：①通过流式细胞术鉴定细胞表型标志物,其中CD29,CD44,CD59完全阳性,同时成脂成骨诱导也为阳性,证实提取的细胞为脂肪干细胞。3代以内脂肪干细胞多呈长梭形,并克隆状生长。②低黏附培养法、hanging-drop 培养法、Eppendorf 管培养法均可使脂肪干细胞聚集成球形生长,但所成多细胞球形有所差异。低黏附培养法所形成的细胞球形大小不一,不易控制;而hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法均可使脂肪干细胞形成大小均一的球形,但在大小和形成时间上有所不同。③3种不同方法所形成的球形细胞均保持较好的细胞活力。     

现代吸脂技术采集脂肪混合物在脂肪干细胞制备领域中的应用

背景：目前用于整容的吸脂术发展很快,但为了脂肪干细胞应用而进行的综合吸脂术研究和比较尚未见报道。 目的：对比目前各种类型脂肪抽取技术的特点以及对基质血管层、脂肪细胞、脂肪干细胞的数量和存活率等指标的影响,评价出细胞活性高、适合进行脂肪干细胞制备、储存及临床科学研究的吸脂技术。 方法：作者分别采用检索关键词“adipose-derived stem cel s,ADSCs, liposuction,SAL,UAL,PAL,WAL”和“脂肪干细胞、脂肪抽取术、负压吸脂术、超声辅助吸脂术、震动辅助吸脂术、水动力辅助吸脂术”检索了PubMed数据库、中国知网全文期刊数据库和美国NIH 临床试验数据库,排除与研究目的无关和内容重复者,保留50篇文献进行进一步分析。 结果与结论：目前可应用于脂肪间充质干细胞采集的现代吸脂技术主要有负压吸脂、超声辅助吸脂、震动辅助吸脂、水动力辅助吸脂。其中负压吸脂、超声辅助吸脂技术、水动力辅助吸脂技术3类技术采集的脂肪混合物中可以分离出脂肪干细胞且具有较高的活性,可以用作自体细胞辅助移植技术和再生疗法。这4类技术虽然各有特点,有必要进一步研究这些吸脂技术获得的脂肪干细胞的活性、遗传性状稳定性、分化能力等系统性对比数据,为未来的再生医学工程提供更准确完善的支持。     

利用细胞外基质大规模扩增临床级人脂肪间充质干细胞

背景：如何运用无血清培养体系大规模扩增处于未分化状态的脂肪间充质干细胞,并使其保持“干性”是脂肪间充质干细胞临床应用转化中急待解决的难题。目的：建立含细胞外基质的脂肪间充质干细胞体外培养系统,验证其扩增细胞的高效性、有效性及安全性。方法：在无血清培养条件下,将体外分离得到的脂肪间充质干细胞分别接种在包被细胞外基质的培养板和传统二维塑料培养板上。经过体外扩增后,比较2种条件下细胞数量、细胞表面标记物表达、细胞衰老状况以及体外多向分化能力（诱导成脂、成骨和成软骨）的差异,考察脂肪间充质干细胞在含细胞外基质的培养条件下扩增后的临床安全性。结果与结论：脂肪间充质干细胞扩增到第5代时,包被细胞外基质培养板的细胞产量已经是传统二维塑料培养板的10倍以上,流式细胞检测表明,在含细胞外基质条件下扩增的脂肪间充质干细胞仍保持了干细胞表面特定标记物的表达。细胞衰老检测结果显示,使用包被细胞外基质的培养板扩增脂肪间充质干细胞至第15代时,细胞仍几乎无老化现象,而使用二维塑料培养板扩增的细胞在第5代时已出现明显老化,传代后细胞增殖能力明显下降。体外多向诱导分化实验显示,脂肪间充质干细胞在含细胞外基质条件下扩增至第15代时仍具有成脂、成骨和成软骨的分化功能,并且与第5代时没有明显差异,同时显著优于传统培养条件下的第5代脂肪间充质干细胞。染色体核型分析及小鼠成瘤性试验结果表明,脂肪间充质干细胞在含细胞外基质条件下扩增后仍具备临床应用的安全性。以上结果证实,含细胞外基质的无血清培养系统可以更高效且安全地扩增出具有临床应用潜能的脂肪间充质干细胞。     

组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞

背景：研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法,采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。 目的：采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞,并进行成脂、成骨的诱导分化。 方法：采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞,进行体外培养,观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞,用MTT法绘制其生长曲线;流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况;分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。 结果与结论：体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29,CD44,阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后,油红O染色阳性;成骨诱导培养14 d后,茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。     

低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化

背景：脂肪间充质干细胞在跟腱组织工程再生领域越来越受到重视,研究其诱导分化的有利环境（氧体积分数）尤为必要。 目的：将脂肪间充质干细胞与跟腱细胞在不同氧体积分数条件下间接共培养,比较氧体积分数对脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化能力的影响。 方法：无菌条件下获取SD大鼠跟腱细胞。SD大鼠脂肪间充质干细胞直接购买,经培养传至第1代后,与跟腱细胞一起在常氧（体积分数20%）和低氧（体积分数2%）条件下经Transwel 间接共培养体系共培养。在培养7,14和21 d ,实时荧光定量 PCR 检测跟腱细胞的特异指标胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ, Tenomodulin , Thrombospondin-4,Scleraxis 基因相对表达量,免疫荧光染色法检测胶原蛋白Ⅰ和Thrombospondin-4蛋白表达量。 结果与结论：脂肪间充质干细胞与跟腱细胞经间接共培养后,低氧组检测到的跟腱细胞的相关特异指标在基因和蛋白水平上表达水平均高于常氧组。提示氧体积分数可显著影响脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的潜能,低氧是脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的有利条件之一。     

携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化

背景：胰岛素是成脂诱导剂的重要组成成分。然而胰岛素存在半衰期,会随着体内代谢不断灭活及降解,植入体内的细胞或材料无法像体外那样以更换培养液来达到目的。实验拟通过转染胰岛素基因,使转染后的干细胞稳定分泌胰岛素,促进其成脂分化。目的：探讨携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质=F细胞后对其成脂分化能力的影响。方法：取第3代人脐带间充质干细胞,以感染复数为20转染腺病毒载体。实验分为4组：对照组为第4代人脐带间充质干细胞;实验组1为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞;实验组2为第4代人脐带间充质干细胞＋成脂诱导液;实验组3为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞＋成脂诱导液。结果与结论：转染48h后实验组1和实验组3的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下显现弱荧光,72h后荧光较强。经脂肪诱导培养液培养14d后,实验组1,2,3油红O染色后显微镜下呈红色,对照组未见脂滴形成,实验组1可见一些细小脂滴形成;实验组3与实验组2相比,脂滴大且多,定量分析显示,实验组3油红0染色阳性的面积和吸光度大于实验组2（P〈0．05）。由此说明携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后可促进其成脂能力。     

大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨

背景：脂肪干细胞取材方便、增殖旺盛、具有多向分化潜能,有望取代骨髓间充质干细胞而成为新一代组织工程的种子细胞。然而,脂肪干细胞的分离培养仍存在诸多困难与不足。目的：优化脂肪干细胞的分离培养方法,并鉴定其成骨分化潜能。方法：选取200g成年雌性大鼠1只,无菌环境下切取大鼠肾脏、子宫周围及腹后外侧白色脂肪组织,多次胶原酶消化法分离消化,低糖培养基培养脂肪干细胞,倒置显微镜下观察脂肪干细胞的形态变化及增殖能力。采用成骨诱导培养液对第3代细胞进行成骨诱导,并采用碱性磷酸酶、茜素红染色方法进行鉴定。结果与结论：脂肪干细胞形态以长梭形为主,增殖活跃呈旋涡状生长。经成骨诱导10d后,碱性磷酸酶染色为阳性;成骨诱导28d后,茜素红染色阳性。提示采用多次酶消化法得到的大鼠腹腔源性脂肪干细胞在体外易于分离培养,可以稳定传代。在一定条件诱导下,可以向成骨细胞分化。采用以上方法进行脂肪干细胞的分离培养可以为组织工程提供大量、优质的种子细胞。