碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用

背景:有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达.目的:在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用.方法:购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3～5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用.复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上.在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组:对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组).各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统统计阳件细胞数及平均吸光度值.结果与结论:与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P＜0.01),Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P＜0.01).证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖.     

成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长(英文)

背景:人胚胎干细胞是一种全能型细胞,可以分化为3个胚层的组织,目前国内对其无饲养层生长的研究较少.成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子.目的:探讨长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响.方法:两株人胚胎干细胞在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养3代,分别转移到含100,160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养8代.从培养皿中移出胚胎干细胞,用IV胶原酶消化聚集成团的细胞,观察细胞分化状态和全能性情况.收集传8代后的胚胎干细胞,种植于SCID小鼠体内.对所得细胞做形态学评估,并进行碱性磷酸酶染色、表面标记免疫组化检测、RT-PCR检测OCT-4的表达、体内致瘤情况.结果与结论:在含160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中,两株人胚胎干细胞可以保持原有性状,即细胞克隆呈圆形,核质比较高,中间大片区域为未分化细胞,周围为分化细胞;呈碱性磷酸酶强阳性表达;表达OCT-4转录因子蛋白;细胞表面标志SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81均呈阳性表达;聚集成团的胚胎干细胞培养10 d后形成拟胚体;种植于SCID小鼠体内可得含3个胚层组织的畸胎瘤.含100 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基不足以维持人胚胎干细胞的长期增殖,4代以后大部分细胞分化死亡.提示成纤维细胞生长因子质量浓度达160 μg/L以上时,可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖,且不影响细胞分化状态和全能性.     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

脐血来源AC133+细胞在不同诱导条件下神经分化标志物的表达

背景：近年来，在啮齿类动物中发现，造血干细胞具有向神经分化的塑型性，而在人类，这种造血的塑型性仍然具有争议。目的：榆测人脐血来源的AC133^＋造血干细胞是否具有向神经分化的潜能。设计、时间及地点：本实验为成组对照设计实验，于2005—08／2007—12在天津血液学研究所和清华大学玉泉医院神经中心实验室完成。材料：人脐带取自健康足月新生儿。胎脑滋养层细胞来源于22周流产胎儿脑组织。方法：应用免疫磁珠分选人脐血AC133^＋细胞，流式细胞仪检测其纯度为99％以上。同时以机械分离及酶消化法制备胎脑滋养层细胞。选用4种培养条件对脐血来源AC133^＋造血干细胞进行诱导分化：①生长培养液DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子。②DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子并联合使用脑源性生长因子，其间用全反式维甲酸处理3d。③非细胞接触的共培养体系，先将制备的胎脑滋养层细胞生长在培养板内插件的半透膜上，与培养板内的脐血来源的AC133^＋细胞进行共培养。④细胞直接接触共培养，将预先用BrdU标记的脐血来源的AC133^＋细胞直接种在胎脑滋养层细胞上进行共培养。主要观察指标：1，2，4周收集诱导分化的脐血细胞，以RT-PCT检测是否有巢蛋白、骨形态生成蛋白2及神经细胞黏附分子的表达，免疫细胞化学方法检测细胞分型特异性抗原。结果：部分脐血来源的AC133^＋细胞，在体外存在生长必需的因子上皮生长因子和碱性成纤维生长因子时，能表达一些与神经细胞分化有关的基因，如巢蛋白、骨形态生成蛋白，条件不同时，这些基因出现下调和关闭。在DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合使用脑源性生长因子诱导培养液中，上述基因表达在2周时可检测到，同时可榆测到神经发育过程中出现的另一分子神经细胞黏附分子，这一分子在造血过程中并不出现，在使用内插件的胎脑滋养层细胞共培养的脐血细胞中也检测到相同结果。在优化的非细胞接触条件中主要表达胶质酸性蛋白，在细胞直接接触的共培养体系中出现神经元分化的标志物Ⅲ β-tubulin蛋白的表达。这种基因表达变化提示，在特定的培养环境下，脐血来源的AC133^＋细胞内可能出现了基因重排，使造血潜能的干细胞表达神经细胞发育分子。结论：脐血来源的AC133^＋细胞包含部分具有向神经分化潜能的多能干细胞，在适合条件下，表达神经分化相关抗原。     

转化生长因子β1联合血管内皮细胞生长因子体外诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化

目的:观察胚胎干细胞在转化生长因子β1和血管内皮细胞生长因子体外诱导分化血管内皮细胞的能力,探讨提高诱导效率的方法。方法:实验于2004/2006在南昌大学医学院第二附属医院血液病研究所进行。实验材料:成年昆明小鼠由南昌大学医学院动物科学部提供(机构许可证号:96021),经自然交配怀孕。小鼠胚胎干细胞129×1/SvJ细胞系,购于ATCC公司。实验方法:取孕12.5～14.5d的胎鼠,制作小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增胚胎干细胞。将饲养层上扩增后生长状态好的胚胎干细胞以0.25%胰酶消化,小心吹打成单个细胞悬液,以差速贴壁法将饲养层细胞去掉,按1×104L-1胚胎干细胞悬液悬滴在细胞培养皿的盖上,每滴10～20μL,不换液,3d后形成拟胚体,培养液为不含白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液。挑选状态好的拟胚体分3组:转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组、转化生长因子β1 血管内皮细胞生长因子诱导组。采用RT-PCR和免疫组织化学方法证实诱导的细胞是否为内皮细胞。结果:①胚胎干细胞体外诱导生长观察:3组中拟胚体贴壁后第2天,胚体均略摊开,周围有上皮样细胞出现,第3,4天有许多卵石样细胞产生,至第6天开始出现由卵石样细胞构成的管状结构,自胚体向周围呈辐射状生长,渐呈网状,诱导时间约2周。转化生长因子β1 血管内皮细胞生长因子诱导组中产生的管样结构的拟胚体数较转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组多(44.67±3.88,28.17±6.08,33.00±2.68,P<0.05)。②RT-PCR法检测基因mRNA水平:3组基因表达的扩增片断分别为1086,733,265bp,与DNAmark相比较,条带位置相符。③扩增细胞的免疫组织化学染色:Ⅷ因子抗体反应显示阳性。结论:转化生长因子β1与血管内皮细胞生长因子均能诱导胚胎干细胞为内皮细胞,两者合用有可能提高诱导效率。     

胚胎干细胞向胆管上皮细胞定向分化的体外实验

背景：在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件，使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的。 目的：验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院。 材料：选用BALB／c系小鼠胚胎干细胞（BALB／c—ES）由中山大学实验动物中心建系和保存。分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品，实验用抗小鼠细胞角蛋白7（CK7）和细胞角蛋白19（CK19）购自丹麦DAKO公司，间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品，IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品。 方法：实验于2004—10／2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成。①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化，在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子，使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化。以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组，使胚胎干细胞自然分化。②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况。③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19，γ-谷胺酰转肽酶（GGT）表达变化，同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点。 主要观察指标：①细胞生长及三维环状结构形成情况。②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况。结果：①细胞生长及三维的环状结构形成情况：胚胎干细胞悬浮培养10h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中。分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现～种三维的环状结构，细胞呈同心圆层状排列，内层细胞排列紧密，继续培养，内层细胞逐渐排列疏松，分化20d左右时细胞活力达到最好，其后活力开始下降，分化36d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中。对照组环状结构于第13天出现，细胞结构于27d裂解。②CK7，CK19表达：胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达，分化第13天时CK19表达，其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强。对照组细胞在分化第13，15天开始出现CK7，CK19表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化：加入生长因子后，细胞环状结构形成初始即表达GGT，说明此结构中含有胆管上皮细胞。在环状结构形成初始，细胞间连接紧密，不能分清单个细胞结构，随着培养时间增长，单细胞结构逐渐清晰。GGT阳性细胞呈多角型或方形排列，核位于中央，细胞器较少，胞质染色较浅，符合立方上皮细胞特点，体现出胆管上皮细胞的形态学特点。 结论：胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

持续 Wnt 信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖简

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a（100μg/L）持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34＋/Sca-1＋,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a（100μg/L）连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典 Wnt/β-catenin 信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34＋/Sca-1＋细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。     

脐血来源AC133^＋细胞在不同诱导条件下神经分化标志物的表达

背景：近年来，在啮齿类动物中发现，造血干细胞具有向神经分化的塑型性，而在人类，这种造血的塑型性仍然具有争议。目的：榆测人脐血来源的AC133^＋造血干细胞是否具有向神经分化的潜能。设计、时间及地点：本实验为成组对照设计实验，于2005—08／2007—12在天津血液学研究所和清华大学玉泉医院神经中心实验室完成。材料：人脐带取自健康足月新生儿。胎脑滋养层细胞来源于22周流产胎儿脑组织。方法：应用免疫磁珠分选人脐血AC133^＋细胞，流式细胞仪检测其纯度为99％以上。同时以机械分离及酶消化法制备胎脑滋养层细胞。选用4种培养条件对脐血来源AC133^＋造血干细胞进行诱导分化：①生长培养液DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子。②DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子并联合使用脑源性生长因子，其间用全反式维甲酸处理3d。③非细胞接触的共培养体系，先将制备的胎脑滋养层细胞生长在培养板内插件的半透膜上，与培养板内的脐血来源的AC133^＋细胞进行共培养。④细胞直接接触共培养，将预先用BrdU标记的脐血来源的AC133^＋细胞直接种在胎脑滋养层细胞上进行共培养。主要观察指标：1，2，4周收集诱导分化的脐血细胞，以RT-PCT检测是否有巢蛋白、骨形态生成蛋白2及神经细胞黏附分子的表达，免疫细胞化学方法检测细胞分型特异性抗原。结果：部分脐血来源的AC133^＋细胞，在体外存在生长必需的因子上皮生长因子和碱性成纤维生长因子时，能表达一些与神经细胞分化有关的基因，如巢蛋白、骨形态生成蛋白，条件不同时，这些基因出现下调和关闭。在DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合使用脑源性生长因子诱导培养液中，上述基因表达在2周时可检测到，同时可榆测到神经发育?     

人鼻咽癌CD133^＋干细胞的生物学特性及意义

背景：有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道。目的：观察人鼻咽癌CD133^＋干细胞生物学特性及意义。方法：采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况。免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133^＋干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133^＋干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133^＋干细胞的生物学特性。结果与结论：免疫磁珠富集的CD133^＋细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球。CD133^＋细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力（P〈0.01）;CD133^＋细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞（P〈0.05）。结果证实,鼻咽癌CD133^＋干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力。     

肝癌干细胞分离及其细胞生物学特性

背景：正常干细胞和肿瘤干细胞在基因表达和依赖的细胞信号通路上应该存在不同,如何发现能选择性杀伤肿瘤干细胞的治疗手段是一个仍然需要大量研究的课题。目的：分离人肝癌细胞系肿瘤干细胞MHCC97,分析其细胞生物学特性。方法：采用流式细胞技术在人高转移肝癌细胞系 MHCC97中筛选肿瘤干细胞,分离正常人肝脏干细胞CD133-CD34-MHCC97和人肝癌细胞系肿瘤干细胞CD133＋CD34＋MHCC97,分别检测其表型、生长曲线、细胞周期和多系分化能力。结果与结论：人肝癌细胞系 CD133＋CD34＋ MHCC97肿瘤干细胞的表型为 CD133＋CD34＋,人肝癌细胞系CD133＋CD34＋ MHCC97具有与CD133-CD34- MHCC97相似的细胞曲线和生长周期,可以向上皮和内皮细胞分化,并表达相应特异性的分子标志。提示人肝癌细胞系中 CD133＋CD34＋MHCC97细胞具有肿瘤干细胞的特性,可以向内皮和上皮细胞分化,同时具有肿瘤干细胞的生物学特性,是肿瘤复发转移的根源,也是临床治疗的靶点。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

联合应用生长因子促骨髓间充质干细胞向韧带样细胞分化

背景：利用生长因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化成韧带样细胞并促其分泌胶原蛋白是构建组织工程化韧带的关键。生长因子碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1在细胞定向分化过程中都起着十分重要的作用。目的：采用转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞,转化为韧带样细胞,并研究此种韧带样细胞的生物特性。方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化骨髓间充质干细胞并培养、增殖。采用10μg/L转化生长因子β1和25μg/L碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间质干细胞进行诱导分化,分为空白组、转化生长因子β1组、碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组。观察生长因子对骨髓间质干细胞生长、形态的影响,使用MTT法绘制细胞生长曲线,使用天狼腥红染色法定量对比骨髓间质干细胞分泌胶原蛋白量。把转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合诱导的骨髓间质干细胞使用BrdU荧光染色标记,然后移植到脱细胞真皮基质上,观察细胞增殖分布情况,并与空白组对照。结果与结论：转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合组,细胞形态优于空白组及单一因子组,细胞增殖率、胶原分泌量也较高。脱细胞真皮基质上,转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组细胞增殖分布情况明显优于空白组。提示联合使用生长因子转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子刺激兔骨髓间质干细胞,能够促使兔骨髓间质干细胞定向转化为韧带样细胞,对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。     

深低温冻存的外周血单个核细胞活性氧水平与造血干/祖细胞归巢黏附分子表达之间关系的研究

本研究通过检测经程控降温液氮保存前后的富集造血干/祖细胞的外周血单个核细胞(PBMNC)的活性氧(ROS)水平及造血干/祖细胞归巢分子的表达,分析二者之间的相关性。以冻存PBMNC为实验组,以新分离PBMNC为对照组,通过台盼蓝染色方法检测2组细胞的存活率;通过流式细胞分析法检测2组细胞ROS水平;通过流式细胞分析法检测造血干/祖细胞表面抗原CD34、CD133以及归巢相关分子VLA4、CXCR4、CD44的表达;通过相关系数分析ROS水平与归巢分子表达之间的相关性。结果表明:PBMNC随冻存时间延长存活率逐渐降低,冻存3、6、9、12个月的细胞存活率比冻前显著降低(P<0.05);造血干/祖细胞表面标志性抗原CD34、CD133及归巢相关分子CD44、VLA4、CXCR4表达率随冻存时间的延长有所下降,冷冻保存1年后的表达率比冻存前显著降低(P<0.05);随着冷冻保存时间的延长,细胞内ROS水平逐渐升高,冻存6、9、12个月后细胞内ROS水平比冻存前显著升高(P<0.05)。PBMNC内ROS水平与造血干/祖细胞CD34+VLA4+、CD34+CXCR4+、CD34+CD44+双阳性表达率均呈负相关(相关系数分别为-0.503、-0.457、-0.465)。结论:造血干/祖细胞的归巢黏附分子表达随冻存时间延长而逐渐下降;冻存的PBMNC中的ROS水平与造血干/祖细胞归巢黏附分子表达率成显著负相关;ROS水平增高可能是冻存外周血造血干/祖细胞归巢功能降低的原因之一。     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾（AGM）区、胎肝（FL）及骨髓（BM）基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体（EB）,并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM＋FL和EB/AGM＋FL＋BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1＋c-Kit＋细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论：①EB/AGM＋FL组和EB/AGM＋FL＋BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞明显升高（P〈0.05）。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组（P〈0.05）,而EB/AGM＋FL、EB/AGM＋FL＋BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM＋FL和AGM＋FL＋骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

人脐带间充质干细胞体外诱导分化为成纤维细胞

背景：脐带间充质干细胞具有多向分化能力,但其向成纤维细胞分化研究较少。目的：验证人脐带间充质干细胞向成纤维细胞的分化能力。方法：采用贴壁法分离脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析其表面抗原。取第3代脐带间充质干细胞进行成脂成骨诱导分化,以碱性成纤维细胞生长因子诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。结果与结论：贴壁法能稳定从脐带中分离出干细胞,脐带间充质干细胞极低表达 CD31、CD45、CD40、HLA-DR,强表达 CD29、CD90、CD44、CD105。脐带间充质干细胞成脂诱导后油红O染色显示胞浆中充满红色的油滴;成骨诱导后茜素红染色可在细胞密集区见红色的钙结节。碱性成纤维细胞生因子诱导后细胞表达Ⅰ型胶原明显高于对照组。提示贴壁法分离脐带间充质干细胞可靠、纯度高,碱性成纤维细胞生长因子可诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。     

骨肉瘤干细胞的分离与鉴定

背景：骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,其发生可能与骨肉瘤干细胞有关。目的：评估骨肉瘤干细胞分离、培养和鉴定方法以及其相关肿瘤标记物的表达。方法：在无血清条件下以及无血清联合抗肿瘤药物的条件下应用免疫磁珠分选法对骨肉瘤干细胞进行分离、培养,分选出Stro-1阳性、CD133阳性骨肉瘤干细胞,采用免疫荧光染色、蛋白质印迹法等检测骨肉瘤肿瘤干细胞标记物CD133、Oct3／4以及Nanog等的表达水平以及致瘤性能。结果与结论：骨肉瘤干细胞在接种培养2-10d后形成悬浮细胞球,增殖潜伏期约为24h,Stro．1阳性干细胞能够形成悬浮细胞球,Stro-1阴性细胞则不能形成悬浮细胞球。此外,骨肉瘤干细胞还能高表达Oct3／4、Nanog和CD133等,CD133阳性骨肉瘤干细胞高表达CD133分子,侵袭力更强,而CD133阴性细胞则不能表达CD133分子,侵袭力相对较弱。塞来昔布对骨肉瘤干细胞的形成具有一定程度的抑制作用,能够降低肿瘤新生血管中血管内皮生长因子的表达。