桃红四物汤对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用

背景:临床组织学及病理学研究证明:激素性股骨头缺血性坏死的早期病理变化是股骨头骨髓内造血组织减少,脂肪组织增多,这可能与激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关.目前被很多学者用来解释激素性股骨头缺血性坏死的发病机制. 目的:观察桃红四物汤对激素诱导臂髓间充质干细胞成脂分化的干预作用. 方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过大剂量激素诱导体外培养的骨髓间充质干细胞成脂分化,在诱导成脂的同时给予桃红四物汤含药血清干预.检测干预6 d后细胞内成脂标志物三酰甘油、PPARy mRNA和aP2 mRNA的表达. 结果与结论:桃红四物汤含药血清可对抗激素诱导下的骨髓间充质干细胞三酰甘油、PPARy mRNA和aP2 mRNA表达的增加.提示桃红四物汤防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头的微循环,同时还与其抑制激素诱导下的骨髓间充质干细胞成脂分化有关.     

残粒脂蛋白激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ诱导人脂肪间充质干细胞的成脂分化

背景：残粒脂蛋白可诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为成熟的脂肪细胞。目的：观察残粒脂蛋白对人脂肪间充质干细胞成脂分化和氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂联素基因表达的影响。方法：采用成脂诱导剂刺激人脂肪间充质干细胞,油红O染色鉴定脂肪细胞。分离高三酰甘油血症患者高脂餐后4h抗凝血浆中的残粒脂蛋白,分别将0,50,100,150,200mg/L残粒脂蛋白与10mg/L胰岛素联合刺激脂肪间充质干细胞。结果与结论：油红O染色发现0,50mg/L残粒脂蛋白组有微量脂滴形成。100～200mg/L残粒脂蛋白组红色脂滴逐渐增加,以200mg/L组红色脂滴最多。在50～200mg/L质量浓度范围内,细胞氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA与脂联素mRNA表达随残粒脂蛋白浓度增加而逐渐增强（P〈0.05）。200mg/L残粒脂蛋白组脂联素mRNA表达量显著低于150mg/组（P〈0.05）,但与100mg/L残粒脂蛋白组差异未达到显著性意义。表明残粒脂蛋白通过激活氧化物酶体增殖物激活受体γ诱导人脂肪间充质干细胞的成脂分化,并上调脂联素mRNA的表达。     

残粒脂蛋白激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ诱导人脂肪间充质干细胞的成脂分化

背景:残粒脂蛋白可诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为成熟的脂肪细胞。目的:观察残粒脂蛋白对人脂肪间充质干细胞成脂分化和氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂联素基因表达的影响。方法:采用成脂诱导剂刺激人脂肪间充质干细胞,油红O染色鉴定脂肪细胞。分离高三酰甘油血症患者高脂餐后4h抗凝血浆中的残粒脂蛋白,分别将0,50,100,150,200mg/L残粒脂蛋白与10mg/L胰岛素联合刺激脂肪间充质干细胞。结果与结论:油红O染色发现0,50mg/L残粒脂蛋白组有微量脂滴形成。100～200mg/L残粒脂蛋白组红色脂滴逐渐增加,以200mg/L组红色脂滴最多。在50～200mg/L质量浓度范围内,细胞氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA与脂联素mRNA表达随残粒脂蛋白浓度增加而逐渐增强(P<0.05)。200mg/L残粒脂蛋白组脂联素mRNA表达量显著低于150mg/组(P<0.05),但与100mg/L残粒脂蛋白组差异未达到显著性意义。表明残粒脂蛋白通过激活氧化物酶体增殖物激活受体γ诱导人脂肪间充质干细胞的成脂分化,并上调脂联素mRNA的表达。     

杜仲诱导大鼠间充质干细胞成骨分化中成骨与成脂相关转录因子的表达

背景:杜仲对骨质疏松具有明显的干预和治疗作用,前期研究发现杜仲能够显著诱导骨髓间充质干细胞成骨分化和抑制成脂分化,而对于学术界广泛认同的成骨和成脂相关转录因子的表达变化还未见报道.目的:观察杜仲诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中成骨和成脂相关转录因子表达的变化. 方法:制备杜仲水,醇提取物,诱导培养罕第3代的SD大鼠间充质干细胞,提取物按牛药2g.定容至15 mL体积为原液,诱导时按10-3、10-4倍稀释度稀释.诱导实验分为6组:阴性对照组(加入与诱导物等最的PBS):阳性对照组(诱导物为地塞米松0.01 mmol/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L,L-抗坏血酸钠50 mg/L);杜仲水提取物10-4稀释度诱导组;杜仲水提取物10-3稀释度诱导组:杜仲醇提取物10-4稀释度诱导组;杜仲醇提取物10-3稀释度诱导组,各组于诱导之后的第15天终止培养.RT-PCR和荧光定量PCR方法检测成骨分化转录因子基因Runx2、Osterix和成脂分化转录因子基因过氧化物酶体增殖物激活受体V、脂肪酸结合蛋白的表达.结果与结论:Runx2除在10-3稀释度水提取物组表达下调,在10-4稀释度醇提取物组上调外.其他各组无显著变化;Osx在各诱导组的表达均明显下调:过氧化物酶体增殖物激活受体Y在各组中无显著变化:脂肪酸结合蛋白在各组均下调.提示杜仲诱导间充质干细胞成骨分化与成脂相关转录因子脂肋酸结合蛋白的表达抑制相关.     

葛根素干预激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的Wnt信号途径

背景：国内外学者研究证明,激素性股骨头缺血性坏死的发病机制与体内脂质代谢紊乱,尤其是大剂量激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关。目前葛根素抑制激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的Wnt信号转导途径还未经证实。〈br〉 目的：观察葛根素干预激素诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化过程中 Wnt 信号途径相关基因及关键蛋白β-catenin表达的变化。〈br〉 方法：第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞随机分为空白组、激素组、葛根素低、中、高剂量组,5组干预6 d后RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路主要成员Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的表达,Western blot法对β-catenin蛋白的表达进行检测分析。〈br〉 结果与结论：与激素组比较,葛根素各干预组Wnt10b mRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达水平均显著升高;GSK3βmRNA的表达水平显著降低。提示葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用可能是通过调节信号通路的Wnt10b mRNA、GSK3βmRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达来实现的。葛根素防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头局部的微循环,同时还与其抑制激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关。     

土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞PPARγ和aP2mRNA表达的影响

目的探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机理及土鳖虫防治该病的作用机制。方法通过大剂量激素诱导体外培养的骨髓间充质干细胞成脂分化,同时给予土鳖虫含药血清干预。检测干预6天后细胞内成脂标志物PPARγmRNA和aP2mRNA的表达。结果土鳖虫含药血清可对抗激素诱导下的BMSCs PPARγmRNA和aP2mRNA表达的增加。结论土鳖虫防治激素性股骨头缺血坏死的机理不仅是改善股骨头的微循环,同时还与其抑制激素诱导下的BMSCs成脂分化有关。     

脐带来源间充质干细胞在成脂培养条件下骨形态发生蛋白2的表达

背景：脐带间充质干细胞在成脂培养条件下成脂相关信号因子过氧化物酶体增殖体激活受体Y的表达水平增高,同时成骨相关信号因子骨形态发生蛋白的表达水平也增高。目的：检测成脂诱导条件下脐带间充质干细胞的过氧化物酶体增殖体激活受体Y及骨形态发生蛋白2的表达水平变化,并对结果进行初步探讨。方法：取脐带来源的间充质干细胞,以成脂诱导体系对细胞进行诱导分化培养,倒置显微镜下观察细胞体外培养生长情况：油红O染色法观察成脂现象,茜素红及von kossa染色观察是否有沉淀形成：荧光定量PCR方法检测成脂相关因子过氧化物酶体增殖体激活受体Y及骨形态发生蛋白2的表达变化情况。结果与结论：获得脐带来源间充质干细胞,并成功进行了成脂诱导分化。荧光定量PCR检测发现在成脂诱导条件下脐带间充质干细胞的过氧化物酶休增殖体激活受体Y和骨形态发生蛋白2的表达水平令都呈升高趋势,但是前肯对分化方向的调控起主要作用。     

pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在免骨髓间充质干细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子,通过调节其他转录因子的表达,参与调节骨髓间充质干细胞的分化。目的：构建pEGFP．N1过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体,体外转染兔骨髓间充质干细胞,为过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007—09／2008—07在南华大学附属一医院临床研究所完成。材料：选择雄性2～5月龄新西兰大白兔,用于分离培养骨髓间充质干细胞。方法：应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,贴壁法不断纯化。从正常小鼠的肝组织中提取总RNA,反转录-聚合酶链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA,经XhoI,ApaI双酶切,定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP—N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ。主要观察指标：经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性,脂质体介导下体外转染骨髓间充质干细胞,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率,提取总RNA和总蛋白,进行反转录聚合酶链反应和Westernblot检测。结果：获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确,重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确,成功转染骨髓间充质干细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达。结论：实验成功构建了pEGFP-N1过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒,同时存转染的骨髓间充质干细胞中获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达。     

去势大鼠骨髓间充质干细胞的成脂向分化

背景：骨髓间充质干细胞在适宜条件下,其成脂向分化增强可促进机体内脂肪细胞的生成。目的：观察去势对大鼠体质量的影响,从骨髓间充质干细胞功能变化角度分析其病理机制。方法：选用同一批次、周龄相同、体质量相近的健康雌性SD大鼠,分为2组,去势组行双侧卵巢切除建立骨质疏松症模型,假手术组部分切除双侧卵巢附近脂肪组织。3个月后显微CT检测两组大鼠股骨骨质量及体质量。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,体外传至第5代,成脂诱导后脂滴油红O染色法检测骨髓间充质干细胞成脂能力;反转录-聚合酶链反应法检测骨髓间充质干细胞成脂相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ及脂蛋白酯酶mRNA表达。结果与结论：去势3个月后,大鼠骨质疏松症模型成功构建。与假手术组相比,去势组大鼠股骨骨质量明显降低,体质量有明显增加,骨髓间充质干细胞成脂向分化增强（P〈0.05）。提示骨髓间充质干细胞成脂向分化增强可能是大鼠去势后体内脂量生成增多,引起体质量肥胖性改变的重要原因。     

激素对兔骨髓间充质干细胞神经递质表达的影响

背景：激素性股骨头坏死的确切发病机制仍未清楚,研究发现神经系统可通过多种途径调控骨髓间充质干细胞的分化,激素可能通过影响其调控机制而引起骨坏死。目的：观察在激素作用下,骨髓间充质干细胞中神经递质或其受体mRNA表达的变化。方法：密度梯度离心和贴壁培养获得兔骨髓间充质干细胞。将传代培养的第3代细胞随机分为两组,实验组加入浓度为10-7mol/L的地塞米松,对照组正常培养。分别于诱导后第4,7,11,15天,测定细胞中神经生长因子、成纤维细胞生长因子、降钙素相关基因肽受体、血管活性肠肽受体、P物质受体及过氧化物酶体增殖子活化受体γ的mRNA表达。结果与结论：实验组神经生长因子、成纤维细胞生长因子、降钙素相关基因肽受体、血管活性肠肽受体和P物质受体的mRNA表达较对照组明显降低,而过氧化物酶体增殖子活化受体γmRNA表达较对照组明显增高,差异均具有显著性意义（P〈0.01）,实验组各因子在不同时间点间进行比较却无明显差异（P〉0.05）。结果表明大剂量激素可使骨髓间充质干细胞中具有成骨或成血管作用的神经递质或其受体表达下降,这可能与激素性股骨头坏死发生的机制有关。     

快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系

背景：目前常用的成脂刺激剂主要由胰岛素、地塞米松、IBMX 和吲哚美辛组成,该体系涉及处理因素多、诱导周期长且对细胞毒性大,不利于脂肪形成抑制效应的研究.目的：建立快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系.方法：大鼠全骨髓细胞原代培养,胰酶消化传代,富集形态均质的间充质干细胞,利用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂噻唑烷二酮类药物罗格列酮和吡咯列酮体外单独诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化,设立无糖、低糖和高糖 DMEM 三种基础培养体系,以经典的成脂刺激剂作为阳性对照,在诱导的不同时间点对分化细胞进行形态学观察和油红O染色.结果与结论：与经典成脂刺激剂相比,罗格列酮或吡咯列酮单独均能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,吡咯列酮诱导48 h和罗格列酮诱导72 h均可观察到富含脂滴或脂泡以及油红O染色的阳性细胞,吡咯列酮与罗格列酮的最佳诱导浓度分别为0.125 mmol/L和10μmol/L,而高糖环境利于大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化.说明基于高糖培养环境的以吡咯列酮或罗格列酮做为成脂刺激剂的培养体系可快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响简

背景：中药淫羊藿一直以来被用于骨质疏松的治疗和骨缺损的修复。目的：探讨淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响。 方法：应用数据库文献检索的方法获取淫羊藿对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响研究的文献,对符合研究标准的文献进行深入的分析。通过检测淫羊藿诱导骨髓间充质干细胞成骨性分化过程中碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、转化生长因子β、骨形态发生蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等,了解淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的机制。结果与结论：淫羊藿对骨髓间充质干细胞的影响呈剂量依赖性,在诱导培养的早期淫羊藿苷可以提高细胞的磷酸酶活性,在诱导培养的晚期增加细胞钙化结节数,促进骨钙素分泌量,显著提高转化生长因子β1、骨形成蛋白2、胰岛样生长因子1、骨桥蛋白和骨涎蛋白等的表达水平。淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨性分化有促进作用,可作为一种良好的骨诱导活性因子。     

胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

背景：间充质干细胞最先在骨髓中发现,且骨髓间充质干细胞的相关研究也最多,但是骨髓间充质干细胞来源有限且含量极低。近年来,已经从人胚胎组织分离出间充质干细胞,其与骨髓间充质干细胞在生物学特性上有很多相似之处,但是二者的成脂诱导能力比较尚无明确报道。目的：比较人胚胎组织与骨髓来源间充质干细胞体外增殖能力及成脂诱导能力。方法：采用全骨髓法获得骨髓间充质干细胞,胶原酶消化法获得胚胎组织间充质干细胞。流式细胞术鉴定两种间充质干细胞表面分子标记。用细胞计数方法检测两种间充质干细胞增殖能力。分别向两种细胞培养体系中加入成脂诱导剂诱导14d,经油红O染色后观察并计数,计算不同来源间充质干细胞的成脂诱导分化率。结果与结论：从两种不同组织中均可获取梭形贴壁的间充质干细胞,表面标记物CD44、CD73、CD90和CDl05均呈阳性表达,CDl4、CD34和CD45均为阴性表达;胚胎组织间充质干细胞的增殖能力明显强于骨髓间充质干细胞（P〈0．01）。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经过成脂诱导液诱导14d后,油红O染色结果均为阳性,但是骨髓间充质干细胞体外成脂能力明显强于胚胎组织间充质干细胞（P〈0．01）。     

骨髓间充质干细胞的分化与静水压力刺激强度和持续时间

背景：力学信号与骨骼系统的生长发育、修复重建和疾病发生发展有密切联系,其对骨髓间充质干细胞的影响和作用机制值得关注。目的：探讨静水压力刺激对骨髓间充质干细胞分化的影响及相关机制。方法：①短期实验：将人骨髓间充质干细胞分别接种于正常DMEM培养基、成骨诱导培养基或含细胞外信号调节激酶1,2抑制剂U0126的DMEM培养基中,利用自制压力加载系统对其施加0,40,80kPa的静水压强1,4h。②长期实验：将人骨髓间充质干细胞分别接种于正常DMEM培养基或成骨诱导培养基,施加40kPa的静水压强4hid,持续14d,以不施加静水压的细胞作对照。结果与结论：实时定量反转录PCR结果显示,经成骨诱导或40kPa静水压刺激4h后,骨髓间充质干细胞内核心结合因子a1、骨钙素mRNA表达增加,过氧化物酶体增殖物活化受体v2和脂肪酶mRNA表达降低,80kPa静水压刺激没有出现这一规律;40kPa静水压的成骨诱导作用可被U0126部分拮抗。组织化学染色显示40kPa静水压刺激7d,骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶表达和活性均增加;持续刺激14d,过氧化物酶体增殖物活化受体v2和脂肪酶mRNA表达增加。说明一定强度和作用时间的静水压刺激可调节骨髓间充质干细胞分化,其作用部分依赖于细胞外信号调节激酶1／2信号途径。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓问充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。结果与结论：慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上。F盯．PCR和Westernblot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。     

土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞的蛋白组学差异

背景：国内外学者对股骨头缺血性坏死做了大量研究,但股骨头缺血性坏死的确切发病机制仍未完全清楚。目的：探讨土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞后抑制成脂分化和促进成骨分化的靶位蛋白或相关蛋白。方法：第3代骨髓间充质干细胞分为空白对照组、激素组、土鳖虫组,分别用含空白血清、地塞米松磷酸钠注射液、土鳖虫含药血清＋地塞米松磷酸钠注射液的DMEM培养基干预。3组干预6d后运用同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）标记3组样本的蛋白,二维液相色谱质谱仪（2DLC-MS/MS）鉴定蛋白并进行相对定量分析。结果与结论：以激素组为对照,在空白对照组中共有15种蛋白质出现显著的表达上调,12种出现下调蛋白;在土鳖虫组中共有16种蛋白质出现显著的表达上调,14种出现显著下调。其中Hspa1L和PrxⅤ蛋白可能是土鳖虫抗细胞凋亡的作用靶点。Serpinh1和ADP/ATP translocase 1蛋白可能是土鳖虫促进成骨分化的作用靶点。     

钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：研究发现人和动物的多种间充质干细胞均存在河豚毒素敏感性钠离子通道,但钠离子通道是否会影响间充质干细胞向心肌细胞分化尚无共识。目的：观察钠离子通道特异性阻断剂河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：利用Percoll’s密度梯度离心法结合差速贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,用主动脉逆行生物酶灌流法分离大鼠成体心肌细胞。将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与成体心肌细胞混合培养,应用0,10,100pmol／L的河豚毒素进行干预,1周后观察骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化情况。结果与结论：免疫荧光细胞化学染色显示,大鼠骨髓间充质干细胞和成体心肌细胞混合培养1周后,骨髓间充质干细胞显著表达心肌特异性蛋白结蛋白和肌球蛋白,而10,100μmol／L的河豚毒素均可完全抑制结蛋白和肌球蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达。提示钠离子通道是骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的必要条件。