NNK诱发人支气管上皮细胞恶性转化及氧化损伤机理研究

本文研究ＮＮＫ诱发人支气管上皮细胞（ＢＥＰ２Ｄ）恶性转化及其氧化损伤机理。结果表明,５００μｇ／ｍｌ的ＮＮＫ作用后的第５代细胞具有抗清生长能力,第１５代细胞具有锚着独立生长特征,第２５代细胞具有裸鼠体内成瘤性,提示ＮＮＫ诱发ＢＥＰ２Ｄ细胞发生了恶性转化。ＮＮＫ作用后,ＢＥＰ２Ｄ细胞产生的过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）、超阴离子（Ｏ２）和羟自由基（．ＯＨ）,以及８－羟基脱氧鸟嘌呤（ＯＨ８ｄＧ）含量均显著增高,     

^238Puα粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究

目的 建立氡及其子体诱发细胞转化的模型,模拟氡致肺癌的过程,方法 利用＾２３８ＰｕＯ２释放的α粒子,照射体外培养的人支气管上皮细胞系ＢＥＰ２Ｄ,诱发转化。结果１．５Ｇｙ单次照射的Ｒ１５Ｈ细胞在连续培养２２周后获得了转化,转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变,生长失去接触抑制,ＣｏｎＡ凝集现象明显,获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力,与对照细胞相比均有统计学意义上的增强,结论：从ＢＥＰ２Ｄ到α粒子转化的Ｒ１５Ｈ细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程,可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。     

~(238)Puα粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究

目的　建立氡及其子体诱发细胞转化的模型 ,模拟氡致肺癌的过程。方法　利用2 3 8PuO2 释放的α粒子 ,照射体外培养的人支气管上皮细胞系BEP2D ,诱发转化。结果　 1.5Gy单次照射的R15H细胞在连续培养 2 2周后获得了转化 ,转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变 ,生长失去接触抑制 ,ConA凝集现象明显 ,获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力 ,与对照细胞相比均有统计学意义上的增强。结论　从BEP2D到α粒子转化的R15H细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程 ,可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。     

α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测

目的与方法:用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变.结果:细胞转化过程中,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变,改变从转化早期过程就持续存在;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化.结论:XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一.     

α粒子诱发 BEP2D细胞转化过程中肺癌相关基因表达的 cDNA Microarray研究

目的：探讨辐射诱发人支气管上皮细胞（BEP2D）转化过程中肺癌相关基因的表达。方法：用Cartesian PixSys5500cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。提取α离子辐射前BEP2D细胞（原代）和α粒子辐射后20代、35代细胞总RNA,经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中cDNA进行杂交。结果：原代细胞中检测到40个基因表达;20代检测到47个基因表达;35代检测到20个基因表达。所检测的基因中,抑癌基因的mRNA丰度的原代和20代后细胞中急剧下降;大多数癌基因的表达丰度在20代以后细胞中仅轻微下降;生长因子类基因大都在20代细胞表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮转化细胞中,抑癌基因的失活可能与细胞恶化有关,癌基因及生长因子类基因可能促进了细胞的转化。     

贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化

背景与目的：实验研究和流行病学调查结果表明,铀可广泛地影响人体健康,但其远期效应,特别是致癌性,还缺乏明确的结论。本文模拟人吸入贫铀（depleted uranium,DU)气溶胶的情形,研究难溶性贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化及肺癌相关基因表达谱。方法：用难溶性贫铀氧化物（dUO2)作用腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）,通过观察不同代龄细胞的倍增时间,血清抗性,半固体琼脂克隆形成率及裸鼠成瘤性,鉴定细胞的恶性转化特性;用213个肺癌相关基因的芯片对贫铀诱发的转化BEAS-2B细胞的基因表达谱进行检测。结果：贫铀作用后的第5代BEAS-2B细胞倍增时间明显缩短,血清抗性显著增强;第10代细胞具有锚着独立性生长特性（半固体琼脂克隆形成）;第15代裸鼠体内成瘤。二甲亚砜（DMSO）对贫铀诱发的BEAS-2B细胞恶性转化有明显保护效果。213个肺癌相关基因的芯片检测结果表明,转化细胞中有70多个基因的表达水平发生明显改变,其中10余个基因表达水平明显下降。结论：贫铀在体外具有致癌性。     

人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

Annexin Ⅰ在α粒子转化细胞及肺癌组织中高表达

目的：探讨Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ表达与肺癌及细胞转化的关系。方法：Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹检测永生化 人支气管上皮 ＢＥＰ２Ｄ细胞及α粒子照射转化后 ＢＥＰ２Ｄ细胞中 Ａｎｎｅｘｎｉ　Ⅰ在 ｍＲＮＡ和蛋白质水平的表达,细胞免疫 化学检测 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在 ＢＥＰ２Ｄ细胞中的分布。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测肺癌病人正常组织与肿瘤组织中 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ蛋白质的 表达。结果： Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在α粒子照射转化后 ＢＥＰ２Ｄ细胞中 ｍＲＮＡ和蛋白质水平上的表达光密度均为永生化人支气 管上皮 ＢＥＰ２Ｄ细胞的 １.５倍; Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在 ＢＥＰ２Ｄ细胞中分布于胞浆及细胞膜。本研究收集了 ８例肺鳞癌、４例肺腺 癌病人的肺肿瘤组织及正常组织,Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在肺癌组织中的表达明显高于正常组织（Ｐ＜０.０１）,Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在肿瘤 组织中表达的光密度与正常肺组织之比为 ２．７。结论： Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在肺癌组织过表达,表明 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ可能与肺癌及 细胞恶性转化的发生发展有关。永生化及α粒子照射恶转 ＢＥＰ２Ｄ细胞为进一步研究 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ⅰ在恶性转化中的作 用提供了良好的模型。     

α粒子照射诱发 BEP2D细胞恶性转化模型的建立

目的：建立α粒子照射诱发BEP2D细胞恶性转化模型。方法：α粒子照射永生化BEP2D细胞,通过细胞传代培养,最终经裸鼠成瘤实验,病理切片鉴定,瘤组织培养获取肿瘤细胞系,角蛋白多克隆抗体免疫组化鉴定细胞上皮来源。结果：（1）α粒子照射BEP2D细胞后,培养35代,54代细胞接种裸鼠成瘤,照后20代BEP2D细胞及未照射永生化BEP2D细胞接种鼠不成瘤;（2）瘤体病理切片鉴定为鳞状上皮癌;（3）瘤组织培养得到肿瘤细胞系2个,角蛋白多抗免疫组化实验,细胞胞浆强阳性,证实为上皮来源。结论：1．5Gyα粒子照射诱发BEP2D细胞恶性转化,成功建立α粒子照射诱发肺癌的细胞研究模型。     

SAGE方法分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达

目的：采用基因表达系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE)方法,分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达。方法：细胞培养,收获永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞;提取细胞总RNA,分离mRNA,合成生物素标记的双链cDNA;采用SAGE方法获取标签序列,结合UniGene文库分析标签代表的转录本,最终通过SAGE软件分析标签丰度,比较两组细胞基因表达差异。选取SAGE实验得到的在两组细胞中表达的已知基因Smad7和CCR11,以RT-PCR方法制备探针,用两组细胞等量总RNA为样本,做Northernblot杂交。结果：建立了2个独立的SAGE文库。一个是1.5Gyα粒子照射诱发恶性转化BGEP2D细胞的SAGE文库,一个是永生化BEP2D细胞SAGE文库。从2具文库中分别挑取克隆53个、50个,进行测序,测序一共得到总标签2331个,代表单一转录本252个,有70%的SAGE标签可找到与之一一对应的基因,有84个核糖体蛋白基因,约占33%;有12个转录本（4.8%)找不到与之理想匹配的已知基因;2个SAGE文库间,大多数基因表达丰度相近,对2个SAGE文库进行比较发现有在永生化细胞中高表达的基因,也有在恶转细胞中高表达的基因。Northernblot杂交证实SAGE方法得到的TGF-β诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交,证实TGF-βr诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达,提示Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交,证实TGF-β诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达,提示Smad7基因参与细胞恶转,CCR11基因对维持细胞正常生长有作用。（3）SAGE方法同时定量比较两组或两组以上mRNA间基因表达水平,简便、快捷,尤其适于筛查已知基因的新功能。     

结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的:研究结晶型硫化镍(NiS)诱发SV-40 Large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用.方法:体外用不同浓度结晶型NiS多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度.结果:细胞培养至35代,发现NiS可诱导16HBE恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P＜0.01),并呈时间剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌.结论:结晶型NiS有较强的诱导人支气管上皮细胞恶性转化能力；该转化模型为镍致癌机制的分子水平研究提供了理想的研究系统。     

环磷酰胺、噻替哌诱发人支气管上皮细胞的染色体畸变

目的与方法：以永生化人支气管上皮细胞（ＢＥＡＳ－２Ｂ）受环磷酰胺、噻替哌诱导并发生癌性转化的细胞为模型,运用染色体Ｇ－显带技术,观察环磷酰胺、噻替哌的遗传病毒作用引起的细胞转化过程中的染色体动态畸变。结果：ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞染色体众数４６条,近二倍体,核型稳定,携带有Ｍ１,Ｍ２,Ｍ３三个标志染色体。环磷酰胺转化细胞（ＢＥＡＳ－ＣＰ）为二倍体核型,丢失了１个１４号染色体,增加了Ｍ４异常染色体,该畸变可能与细胞转化的始动,促进和进展有关。噻替哌转化细胞（ＢＥＡＳ－Ｔ）在培养过程中渐趋多倍体细胞,１５代以后部分细胞的１４和２１号染色体各丢失１条,ＢＥＡＳ－Ｔ ２３代在软琼脂上形成克隆的细胞（ＢＥＡＳ－ＳＴ）是多倍体细胞,并具有高频率的非稳定性畸变,ＢＥＡＳ－Ｔ ２５代时为３％,ＢＥＡＳ－Ｓ为３４％,多倍体背景上出现２     

DNA依赖蛋白激酶在人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中的异常表达

目的:探讨辐射诱发人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase, DNA-PK)的激酶活性或表达变化。方法:用Western blot和p53蛋白为特异性底物的磷酸化反应分别检测癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性,用免疫组化结合病理图像定量分析技术检测肺癌组织和癌旁组织中DNA-PKcs蛋白的表达情况。结果:a粒子辐射诱发的人支气管上皮细胞癌变株BERP35T-1的DNA-PKcs表达水平比亲本细胞BEP2D提高30%,激酶活性显著提高。所检测的14例非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs蛋白表达水平普遍高于相对应的癌旁组织,两组之间有显著性差异(P < 0.05)。结论:非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs表达增加,可能成为肺癌的一个生物标记物。     

NNK及X-射线诱导大鼠气管上皮细胞转化的研究

本文采用无血清F12培养基培养大鼠气管上皮(RTE)细胞。RTE细胞可在该种培养基中生长,增殖。形成典型的上皮细胞集落。当无血清培养基换成含血清的选择性培养基时,正常细胞停止生长进而退化死亡,而转化的RTE细胞则可以继续生长,成为转化集落。转化集落经多次传代可在裸鼠体内引起肿瘤。大鼠暴露于致癌物NNK或X射线后,收集其RTE细胞,先在体外进行无血清培养然后再进行选择性培养,其转化率明显高于对照组。RTE细胞体内—体外转化实验对于探究人类肺癌发生机制有一定意义。     

MALIGNANT TRANSFORMATION IN BALB/c-3T3 CELLS INDUCED BY CRYSTALLINE NICKEL SULFIDE

采用细胞灶法测定结晶型硫化镍对ＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３诱发细胞转化的活性,结果表明当硫化镍浓度≥０．２５μｇ／ｃｍ２时转化率增高（Ｐ＞０．０５）,且有剂量反应关系。各剂量组转化灶细胞共６份经软琼脂培养试验均获阳性结果,而对照细胞则为阴性,提示硫化镍诱发的转化细胞具有锚着不依赖性,即恶性特征。     

人鼻咽癌细胞USPF及其放射效应

目的探讨未能被５－溴－２′－脱氧尿苷（ＢｒｄＵ）标记的，具有Ｓ期细胞ＤＮＡ含量的时相比例（ＵＳＰＦ）存在的另一种可能机制，即所谓“半成品库”机制。方法运用ＢｒｄＵ／ＤＮＡ双参数流式细胞计量术分析了不同培养状况下人鼻咽癌ＣＮＥ细胞放射前后有关细胞增殖特性参数的变化情况，并进行统计学处理。结果（１）ＵＳＰＦ和ＬＳＰＦ之间存在可逆性；（２）可逆性ＵＳＰＦ存在可以不伴有Ｓ期时间的变化；（３）上述可逆性与放射引起的细胞再增殖速率有关。结论除了ＢｒｄＵ弥散不均和Ｓ期阻滞（流产）机制外，还可能存在“半成品库”机制。后者存在的合理性在放射效应试验中已得到证实。     

HPV18 E6 E7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化和恶性转化细胞端粒长度和端粒酶活性

目的：探讨端粒长度、端粒酶活性以及端粒酶亚单位组分（hTERT、hTR）的表达与食管上皮细胞永生化和恶性转化之间的关系。方法：对HPV18E6E7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化细胞系SHEE和恶性转经细胞系SHEEC,通过Southern blot检测端粒长度（TRF）,TRAP法测定端粒酶活性,RT－PCR研究端粒酶催化亚单位（hTERT)端粒酶RNA成分（hTR）的表达。结果：SHEE细胞和SHEEC细胞的端料平均长度比正常食管上皮细胞的明显缩短,但稳定维持在一定长度范围内。SHEE细胞和SHEEC细胞均具有端料酶活性,并均有hTERT和hTR表达。结论：端粒酶表达活化使端粒维持在一定长度是永生化食管上皮细胞SHEE和恶性转化细胞SHEEC能够稳定分裂增殖的重要因素之一。     

鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LMP1基因对上皮细胞增殖的影响

目的研究鼻咽癌细胞系ＳＵＮＥ中ＥＢＶ┐ＬＭＰ１基因对上皮细胞增殖的影响,探索ＬＭＰ１在鼻咽癌发生中所起的作用。方法用ＬＭＰ１基因真核表达质粒转染人胚肾上皮细胞,检测ＬＭＰ１的表达,观察细胞在软琼脂中的集落形成能力,ＭＴＴ吸收能力以及ＰＣＮＡ的表达情况。结果被ＬＭＰ１基因转染的细胞生长旺盛,能在软琼脂中形成多个集落,ＭＴＴ吸收能力增强,ＰＣＮＡ的表达水平增高。结论ＬＭＰ１基因能明显改变上皮细胞的生物学行为,促进细胞的生长、增殖和转化,使转染的上皮细胞获得肿瘤细胞的生长特征。