利用XcmⅠ构建T载体

目的:构建能自我复制的T载体.方法:设计一对引物,引入XcmⅠ酶切位点,通过PCR方法用PET-28(a)+作模板扩增550bp,插入Pa载体后用限制性内切酶、PCR及DNA测序等方法作鉴定.结果:用XcmⅠ酶切可见540bp及3810bp双酶切条带,用此载体作模板可扩增出550bp片段,测序结果与预期序列一致.结论:带有两个XcmⅠ位点的环状载体被成功构建.     

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

【目的】构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入 T载体，用EcoR I和Kpn I分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoR I、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，经1mmol／LIPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoR I和Kpn I双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39．5kD的融合蛋白。【结论】成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。     

分泌型碱性磷酸酶示踪的TA克隆真核表达载体的构建

目的制备具有分泌型碱性磷酸酶示踪作用和真核表达功能的TA克隆载体。方法把CMV启动子区-TA克隆位点-BGH多聚腺苷酸区序列克隆到pSEAP2-control载体中,构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶（SEAP）的pcDNA5AP-前T载体。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆到pcDNA5AP-T载体上并进行EGFP表达分析和SEAP活性检测。结果 pcDNA5AP-EGFP以400ng/孔转染6孔板293T细胞,EGFP表达率达50%,SEAP活性比对照组高20倍。结论成功构建了具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶的pcDNA5AP-T载体。     

凝血栓蛋白—1 I型重复序列真核表达载体的构建

目的：构建凝血栓蛋白－1 I型重复序列真核表达载体。方法：采用RT－PCR技术，从人胎儿肺组织中扩增凝血栓蛋白－1I型重复序列基因，通过连接反应构建重组克隆载体和和重组表达载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，双酶切鉴定及测序。结果：获得了预期的扩增产物－凝血栓蛋白－1 I型重复序列基因，测序结果经GenBank分析，一致性为99％.结论：成功构建了pcDNA3.1^ /TSP-1 I型重复序列真核表达载体。     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响。结果:成功构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-HsPDF。该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达。HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征。结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础。     

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的：构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果：重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论：成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。     

噬菌体展示载体的构建

目的 构建适宜噬菌体展示的载体系统。方法 利用pCOMB3的LacZ强启动子，Pelb引导序列，包膜蛋白Ⅲ基因，用NHeI-XbaI双酶切，切除一个克隆位点；同时设计一对引物，用PET-28（a)^ 作模板扩增550bp片段，插入XhoI-SpeI位点之间，扩增质粒后用限制性内切酶，PCR，DNA测序等方法作鉴定。结果 切除了272bpNHeI-XbaI片段。插入片段后酶切鉴定显示：XhoI,SpeI单酶切，XbaI,NheI无酶切；所构质粒用XhoI SpeI双酶切及PCR扩增均可见550bp片段；测序结果正确。结论 成功构建了一种高拷贝，稳定，多用途，易于操作的噬菌体展示载体。     

反义乙型肝炎病毒S基因T载体克隆的构建

目的:构建含部分乙型肝炎病毒(HBV)S基因反义序列的基因克隆.方法:根据GenBank中HBV S基因序列和计算机软件mCLONE分析的结果,设计S基因2侧引物,直接扩增出适合长度的反义HBV S基因,与PMD18T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:获得226 bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆经PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段的反向序列与GenBank中该基因的序列同源性为97%.结论:成功构建了含反义HBV S基因部分序列的T载体克隆.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

心肌梗塞标志物肌钙蛋白T和肌钙蛋白I比较

1　生化特性肌钙蛋白T和肌钙蛋白I并不相同。肌钙蛋白I在体循环中更多地以复和物的形式存在 ,并会被蛋白裂解酶裂解 ,被氧化和磷酸化 ,相对而言 ,肌钙蛋白T则以游离态为主 ,进入人体循环后不发生变化。肌钙蛋白I存在形式的多态性 ,对其测定分析结果产生影响。1 1　标本　标本稳定性　抗凝剂不同肌钙蛋白I的测定所注明的标本稳定性并不相同 ,测定中采用不同的抗凝剂 ,如EDTA肝素 ,它们对于测定结果的影响也不同。血清作为测定样本的适应性是有条件的　肌钙蛋白I测定使用血清经常有假性升高 ,冠心病人血清由于肝素治疗而使血清分离不完全…     

人促血管生成素-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人促血管生成素-2(Ang-2)反义真核表达载体。方法应用基因重组技术将Ang-2 cDNA反向克隆到真核表达载体pECFP-N1中。结果XhoⅡ、BamhⅠ双酶切后．反义重组基因为5．4kb和0．726kb两条带。与理论计算相符。结论成功构建人Ang-2真核表达载体，为肿瘤细胞的Ang-2反义基因治疗研究创造了条件。     

MHC I类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达

目的：构建BALB/c小鼠MHC I类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中，并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果：用EcoR I和XhoI双酶切鉴定证实，H2D^d基因正确插入载体pMSCV。重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2D^d基因，且能转录为mRNA，在其细胞膜上有H2D^d分子的表达。结论：成功构建小鼠H-2D^d编码基因的逆转录病毒载体，该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内，且在细胞中得到表达。     

HLA-DRα基因片段TA克隆载体的构建

目的应用TA克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体，作为实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HLA-DRα基因的标准模板。方法利用RT-PCR法，从提取的外周血单核细胞总RNA中特异地扩增含635bp的HLADRα cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论成功地构建了HLA-DK基因片段TA克隆载体。为实时荧光定量RT-PCR法检测HLA-Dα,mRNA表达提供标准模板。     

突变型IκBα cDNA的克隆及其表达载体的构建

大量研究显示，慢性粒细胞白血病、急性髓系白血病以及淋巴细胞性白血病等均具有持续活化的核因子κB（nuclearfactor—κB，NF—κB）。因此，NF—κB的活化可能与白血病发生及其进展密切相关。NF—κB活化后，除了可调节参与细胞生长和增殖相关基因的表达外，还可上调凋亡抗性分子如cIAP1和TRAF1等基因的表达，从而使肿瘤细胞逃避凋亡。相反，抑制NF．κB活性，则能诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。因此，研究白血病细胞NF—κB的活化及其调控对揭示白血病的发病机制以及寻找白血病治疗新的靶分子具有重要意义。     

胃黏膜特异表达JC病毒T抗原质粒构建及表达鉴定

 目的利用鼠胃黏膜上皮细胞中高活性的角蛋白19(K19)启动子构建K19-JCVT抗原表达质粒并进行鉴定。方法利用PCR方法突变JC病毒T抗原中的NdeⅠ位点,并在两端插入BclⅠ位点,通过BamHⅠ位点将DNA片段与K19启动子连接,构建K19-JCVT抗原质粒。利用酶切和DNA测序确认其DNA序列。免疫组化筛选细胞角蛋白19阳性胃癌细胞,对细胞角蛋白19表达阳性的胃癌细胞系AGS进行K19-JCVT抗原质粒转染,用Western
      blot方法检测JCVT抗原的表达情况。结果K19-JCVT抗原表达质粒成功构建,AGS胃癌细胞系高表达细胞角蛋白19并用于K19-JCVT抗原表达质粒转染,转染K19-T抗原质粒的AGS细胞系有T抗原表达。结论同义突变和相似连接在质粒构建中起到关键作用,酶切位点的甲基化也是值得注意的问题。     

影响载体构建的关键因素

本文旨在介绍载体构建的关键影响因素。通过总结实验过程中载体构建的各个环节的经验教训,分析分子克隆中的关键影响因素,为载体构建提供方法依据。     

真核表达载体pcDNA6/myc-hisB-GFP的构建

目的 构建带绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA6/myc-hisB的真核表达载体. 方法 采用亚克隆的技术扩增得到GFP的开放阅读框序列,Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ双酶切后插入pcDNA6/myc-hisB,重组体经质粒PCR和酶切鉴定,并转染HEK 293T细胞后观察绿色荧光的表达,同时经Western blot检测GFP和标签蛋白myc的表达. 结果 PCR扩增得到特异的GFP开放阅读框序列,质粒PCR和酶切鉴定显示pcDNA6/myc-hisB-GFP构建成功,细胞转染结果 表明重组体可以表达GFP和myc蛋白.结论 获得带有绿色荧光蛋白的pcDNA6/myc-hisB-GFP的真核表达载体,为此载体的应用拓展了更大的空间.