Caspase—6诱导肾癌细胞株GRC—1细胞凋亡的研究

目的 探讨Caspase-6在肾癌细胞株GRC－1中的表达及其对肾癌细胞的凋亡诱导作用。方法 应用RT－PCR方法检测了肾癌细胞株GRC－1中Caspase-6基因的表达水平；以腺病毒adv5作载体，构建了含Caspase-6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染GRC－1细胞株，用RT－PCR方法检测转染后GRC－1细胞中Caspase-6基因的表达。MTT法检测转染Caspase-6对GRC－1细胞株生长的影响。结果 肾癌细胞株GRC－1中未检出Caspase-6表达。RT－PCR法证实转染Caspase-6后GRC－1中Caspase-6表达明显，MTT检测显示对GRC－1细胞的生长有抑制作用，通过形态学观察及DNA电泳证实这种作用主要是通过促进细胞凋亡而实现的。结论 Caspase-6对肾癌细胞的生长有抑制作用，并可诱导肾癌细胞凋亡。     

GFP共表达的重构型Caspase-3基因对人成骨肉瘤细胞的凋亡诱导作用

目的探讨GFP共表达的Caspase-3基因的表达对人成骨肉瘤细胞的凋亡诱导作用。方法应用DNA重组技术将重构型Caspase-3基因亚克隆至带有GFP报告基因的真核表选载体pEGFP-C1中，脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞SOSP-9901，通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达；荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化；MTT法检测转染Caspase-3基因SOSP-9901细胞生长的影响。结果RT-PGR方法证实重构型Caspase-3基因可在SOSP-9901细胞内表达，形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征，MTT法结果表明Caspase-3对SSOP-9901的细胞生长有押制作用。结论重构型Caspase-3对成骨肉瘤细胞SOSP-9901的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘸细胞凋亡。     

TC-1蛋白高表达对子宫内膜腺癌细胞凋亡的影响

目的 构建甲状腺癌相关基因1(TC-1)基因的高表达真核表达系统pTRE3G-TC-1,获得重组高表达TC-1蛋白的子宫癌细胞株HEC-TC1,检测TC-1蛋白高表达时对子宫内膜腺癌(HEC)细胞凋亡的抑制作用,为进一步对TC-1基因或蛋白功能及药物研究提供良好模型.方法 采用真核表达载体p3FLAG-CMV构建表达TC-1基因的质粒,脂质体法转染HEC细胞,检测高表达TC-1蛋白,然后用同样的基因,构建pTRE3G-TC-1表达载体,转染HEC细胞,经数周筛选,获得稳定高表达TC-1蛋白的单克隆细胞株HEC-TC1,采用流式细胞术检测该蛋白对HEC细胞的凋亡影响.结果 获得了稳定高表达TC-1蛋白的单克隆细胞株HEC-TC1.免疫组化结果显示在子宫内膜癌组织中癌细胞上具有C8ORF4蛋白高表达现象.C8ORF4蛋白在子宫内膜癌细胞中,胞内与核内均有表达,但转染激活后该基因在胞内与核内有更高表达并具有生物活性;检测转染后激活的高表达C8ORF4基因的细胞株HEC-TC1分别在0h、24h、48h与对照组未转染的HEC细胞比较,转染后C8orf4高表达细胞凋亡数显著少于未高表达组,C8orf4基因表达的蛋白对肿瘤细胞凋亡有显著抑制作用.结论 获得高表达TC-1基因的细胞株,检测该基因对HEC细胞的凋亡具有显著抑制作用,C8ORF4基因可能参与调控HEC细胞凋亡过程.     

人肝细胞生长因子真核质粒的克隆及活性测定

目的构建肝细胞生长因子的真核表达载体,为进一步利用基因治疗肝损伤打下基础。方法利用DNA体外重组技术,从胎盘提取HGFcDNA克隆到pcDNA3.1载体上,经限制性内切酶、PCR及测序鉴定重组体。转染HepG2和L02细胞并建立稳定细胞株,MTT法测其活性,并通过流式细胞技术检测细胞凋亡。结果pcDNA3.1-HGF重组体测序结果与GeneBank对照完全相同,MTT比色结果,转染HGF基因的HepG2细胞增殖速度明显低于未转染HGF基因的HepG2细胞（P〈0.05）,而转染HGF基因的L02细胞增殖速度明显高于未转染HGF基因的L02细胞（P〈0.05）,细胞流式技术检测结果也与之相符。结论成功构建了pcDNA3.1-HGF真核表达载体,pcDNA3.1-HGF对HepG2细胞有抑制作用而对L02细胞的生长有促进作用。     

Livin靶向RNA干扰对人胃癌细胞SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin靶向RNA干扰对SGC7901细胞株生物学特性的影响,探索胃癌基因治疗的新途径。方法设计和构建Livin特异性的siRNA真核表达载体,转染SGC7901细胞,应用RT-PCR分析LivinmRNA的表达情况,采用MTT法检测细胞的生长状况,通过流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。结果构建真核表达载体p-siRNA1并转染SGC7901细胞后,RT-PCR结果显示2条Livin siRNA真核表达质粒均能有效抑制Livin mRNA的转录表达,干扰组细胞与未转染组细胞比较,生长受到明显抑制,凋亡率明显增加。结论成功构建了Livin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人胃癌细胞Livin mRNA表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。     

Rapamycin抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路对胃癌MGC-803细胞影响

目的探讨rapamycin作用于胃癌细胞株MGC-803后对细胞生长影响及其作用机制。方法体外培养胃癌细胞株MGC-803,使用不同浓度rapamycin干预MGC-803细胞。采用MTT法检测细胞增殖变化;实时荧光定量PCR(QPCR)检测关键基因的表达;蛋白印迹法(WB)检测相关蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化。结果与对照组相比,rapamycin对胃癌MGC-803细胞的增殖活性有明显的抑制作用,呈现出剂量依赖性(P0.05)。Rapamycin显著抑制PI3K、AKT、m TOR、4EBP、P70S6K基因的m RNA表达,差异有统计学意义(P0.05);Rapamycin能抑制p-m TOR、p-P70S6K蛋白的表达;Rapamycin将细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导细胞凋亡(P0.05)。结论靶向m TOR抑制剂rapamycin可通过调控PI3K/AKT/m TOR信号通路进而调控胃癌细胞的生长。     

PDCD4参与异甘草素诱导宫颈癌细胞凋亡的实验研究

目的研究程序性细胞死亡4 (PDCD4)在异甘草素诱导宫颈癌细胞凋亡中的作用。方法宫颈癌细胞Si Ha经异甘草素处理以后,MTT检测细胞增殖,计算半数抑制浓度,Western blot和qRT-PCR检测细胞中PDCD4蛋白和mRNA水平。在Si Ha细胞中转染PDCD4过表达载体和阴性对照载体,用Western blot和qRT-PCR检测细胞中PDCD4表达变化。用半数抑制浓度的异甘草素处理过表达PDCD4的Si Ha细胞,MTT检测细胞增殖能力,克隆形成实验检测细胞克隆能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化型Caspase-3 (Cleaved Caspase-3)蛋白水平。结果异甘草素抑制宫颈癌细胞增殖,其半数抑制浓度为40μmol/L。40μmol/L异甘草素处理宫颈癌细胞,细胞中PDCD4 mRNA和蛋白表达水平升高。转染PDCD4过表达载体的宫颈癌细胞中PDCD4 mRNA和蛋白水平升高。过表达PDCD4或者异甘草素处理均可以降低宫颈癌细胞增殖和克隆能力,促进宫颈癌细胞凋亡和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达,并且异甘草素处理过表达PDCD4宫颈癌细胞对细胞增殖、克隆能力的抑制作用更强,细胞凋亡和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平更高。结论 PDCD4参与异甘草素诱导宫颈癌细胞凋亡过程,PDCD4高表达能够协同异甘草素诱导宫颈癌细胞凋亡。     

RNA干扰Caspase-3基因对镉诱导转化人胚肾293细胞凋亡的影响

目的 研究RNA干扰Caspase-3基因对镉致转化人胚肾293细胞凋亡的影响,探讨Caspase-3基因在镉致细胞凋亡中的作用.方法 选择转化人胚肾293细胞进行体外培养,以小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)处理细胞36 h后,再以40 μmol/L氯化镉分别处理12～24 h,以四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot法分别检测Caspase-3基因表达水平和蛋白表达水平,以流式细胞仪Annexin-V-PI双染法检测细胞凋亡率.结果 40μmol/L氯化镉处理转化人胚肾293细胞12 h后,Caspase-3基因mRNA水平显著增高,相对分子质量为20 kDa的活性亚单位条带显著增强;24 h后,细胞凋亡率显著增加(n=4,P＜0.01),RNA干扰显著抑制镉诱导的细胞Caspase-3基因mRNA和相对分子质量为20 kDa的蛋白表达水平,使细胞凋亡率显著降低(n=4,P＜0.01).结论 体外实验表明,RNA干扰Caspase-3基因对镉诱导转化人胚肾293细胞凋亡具有明显的抑制作用,Caspase-3基因在镉诱导转化人胚肾293细胞凋亡过程中起着重要的作用.     

EBl089抑制肝癌细胞增殖的研究

目的探讨维生素D类似物EBl089对肝癌细胞增殖的可能机制。方法体外培养了肝癌细胞株HHCC细胞，培养时添加100、10和1nmol／LEBl089分别作用2d、4d、6d后，用四唑蓝比色实验(MTT)、平板克隆形成实验检测细胞的存活和生长；用电子显微镜和流式细胞仪方法检测细胞凋亡；用Wester blot方法检测蛋白的表达。结果EBl089可以抑制肝癌细胞增殖(抑制率为17.50％～72.14％)，诱导肝癌细胞发生凋亡。10nmol／LEBl089作用肝癌细胞4d可使p27^kipl和PTEN蛋白表达增加。结论EBl089对于人肝癌细胞的增殖具有抑制作用，能机诱导肝癌细胞凋亡，增加肝癌细胞中D27^kipl和PTEN蛋白的表达。     

洛铂对卵巢癌细胞SKOV3增值抑制及对bax、bcl-2凋亡基因表达的影响

目的:研究洛泊作用于浆液性卵巢癌细胞SKOV3后其对凋亡基因bcl-2和bax表达的影响。方法:体外培养卵巢癌细胞SKOV3,用MTT比色法检测洛铂对SKOV3细胞株的增殖抑制作用,流式细胞仪检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2的表达。结果:体外培养的卵巢癌SKOV3细胞经不同浓度的洛泊处理后细胞生长明显受到抑制,洛泊作用于卵巢癌SKOV3细胞可诱导细胞的凋亡,同时随着洛铂浓度的增加,bax基因的表达增加,而bcl-2表达减少。结论:卵巢癌SKOV3细胞对洛泊具有药物敏感性,洛泊可诱导卵巢癌细胞的凋亡,bax蛋白的表达增加和bcl-2蛋白表达的减少可能是洛泊诱导卵巢癌细胞的凋亡机制之一。     

腺病毒介导TGF-β1对肾癌细胞增殖及凋亡的相关作用机制

目的研究腺病毒介导转化生长因子-β1(TGF-β1)对肾癌细胞增殖、凋亡的相关作用机制。方法将肾癌786-0细胞进行培养、传代,分为未转染组和转染组,转染组以腺病毒为载体对TGF-β1进行转染,未转染组不转染。对两组细胞TGF-β1表达、增殖率、凋亡率、Wnt/β-catenin通路蛋白表达量进行检测;采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对TGF-β1表达进行检测;采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)对肾癌细胞的增殖能力进行检测,按照肿瘤细胞增殖率计算公式,增殖率=(细胞组OD值/参照值-1)×100%,对两组肾癌细胞增殖率进行计算;使用流式细胞仪对两组肾癌细胞凋亡进行检测,利用发光信号测量仪对光子数值进行检测。结果与未转染组相比,转染组β-catenin(0.15±0.01)、Axin2(0.21±0.03)、GSK-3β(0.11±0.02)蛋白表达量及增殖降低,凋亡升高,具有统计学差异(P0.05)。结论 TGF-β1能够抑制肾癌细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调Wnt/β-catenin通路蛋白表达量有关。     

EB1089抑制肝癌细胞增殖的研究

目的　探讨维生素D类似物EB10 89对肝癌细胞增殖的可能机制。方法　体外培养了肝癌细胞株HHCC细胞 ,培养时添加 10 0、10和 1nmol LEB10 89分别作用 2d、4d、6d后 ,用四唑蓝比色实验 (MTT)、平板克隆形成实验检测细胞的存活和生长 ;用电子显微镜和流式细胞仪方法检测细胞凋亡 ;用Westerblot方法检测蛋白的表达。结果　EB10 89可以抑制肝癌细胞增殖 (抑制率为 17 5 0 %～ 72 14 % ) ,诱导肝癌细胞发生凋亡。10nmol LEB10 89作用肝癌细胞 4d可使p2 7kip1和PTEN蛋白表达增加。结论　EB10 89对于人肝癌细胞的增殖具有抑制作用 ,能机诱导肝癌细胞凋亡 ,增加肝癌细胞中p2 7kip1和PTEN蛋白的表达。     

COX-2抑制剂对食管癌ECa-109细胞的放射增敏作用

目的：探讨选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂NS-398作用于食管癌细胞株ECa-109,观察其放射增敏作用,并对其可能增敏机制进行初步探讨。方法应用MTT法检测NS-398对细胞的生长抑制率;克隆形成实验分析放射增敏效应,流式细胞术（ FCM）定量检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2及BaxmRNA表达。结果 NS-398可显著增强ECa-109细胞的放射敏感性,对细胞的生长抑制作用呈时间与剂量依赖性;Ns-398显著增加放射诱导的细胞凋亡,上调BaxmRNA表达,而Bcl-2表达无明显变化（P＞0．05）。结论 NS-398可增强食管癌细胞 ECa-109的放射敏感性,其机制可能与上调Bax表达,上升Bax/Bcl-2比例,激活线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡相关。     

Endo G基因过表达对镉诱导HEK-293细胞凋亡影响

目的 观察细胞凋亡因子核酸内切酶G( endonuclease G,Endo G)基因过表达在镉诱导人胚胎肾细胞HEK-293凋亡中的影响.方法 从人肝癌细胞系(human hepatocarcinoma cells,HepG 2)中提取RNA,经逆转录获取互补DNA cDNA),通过聚合酶链反应(PCR)扩增Endo G基因,与pcDNA 3.0相连,构建pcDNA 3.0-Endo G真核表达载体,转染HEK-293细胞,并结合不同浓度氯化镉处理细胞;通过蛋白印迹实验(Western blot)验证基因过表达,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染法及流式细胞术(FCM)检测Endo G基因过表达对镉诱导HEK-293细胞凋亡的影响,噻唑蓝法(MTT)检测细胞存活率.结果 成功构建pcDNA 3.0-EndoG真核表达载体,Endo G基因扩增片段大小约1 100 bp;该载体转染细胞后,Endo G成功过表达,使HEK-293细胞凋亡率＞37％,且随氯化镉浓度增加,Endo G表达量先上升后下降.结论 Endo G以诱导细胞早期凋亡和晚期凋亡为主要形式.     

维生素D类似物EB1089对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨维生素D类似物EB1089对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养维生素D3受体(VDR)阳性和阴性的肝癌细胞株HepG2和HCCT细胞,培养时添加100、10和1nmol/LEB1089,分别作用2、4和6d后,用四唑蓝比色实验(MTT)、平板克隆形成实验检测细胞的存活和生长;用反转录PCR(RTPCR)检测VDRmRNA的表达;用流式细胞仪和电子显微镜检测细胞凋亡。结果EB1089对VDRmRNA表达阳性的HepG2细胞的抑制率为175%～721%,对VDRmRNA表达阴性的HCCT细胞没有抑制作用;电镜结果显示EB1089可诱导HepG2细胞凋亡,流式细胞仪结果显示凋亡细胞的百分比为214%,并可阻滞细胞周期于G1期。结论EB1089对人肝癌细胞株HepG2的增殖具有抑制作用,可通过VDR受体抑制人肝癌细胞的增殖,并可诱导HepG2细胞凋亡。     

β-胡萝卜素抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的研究

为了探讨 β 胡萝卜素抑制肝癌细胞增殖的机制 ,在体外培养肝癌细胞株SMMC 772 1,培养基添加2 0、40及 80 μmol Lβ 胡萝卜素作用 12、2 4和 48h后 ,用四唑盐比色试验 (MTT)检测细胞的存活和生长 ;台盼蓝拒染法绘制生长曲线 ;DNA凝胶电泳检测肝癌细胞凋亡。MTT检测结果显示 2 0～ 80 μmol L的 β 胡萝卜素均对SMMC 772 1细胞株有显著的抑制作用 ,且呈剂量 效应关系。DNA凝胶电泳结果显示 β 胡萝卜素能够诱导SMMC 772 1细胞凋亡。结论认为 β 胡萝卜素对人肝癌细胞株SMMC 772 1的增殖具有显著的抑制作用 ,其机制可能是通过干扰肝癌细胞的DNA代谢和诱导肝癌细胞凋亡     

单纯疱疹Ⅱ型microRNA-H3真核过表达载体的构建及对Hela细胞活性的影响

目的人宫颈癌细胞(Hela)中表达Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)编码的microRNA-H3(miR-H3),检测该mRNA对Hela细胞活性的影响。方法 PCR扩增microRNA-H3的前体序列,将其插入到pmRmcherry(cherry)载体中,并酶切测序同时验证;重组质粒转染Hela细胞,q PCR检测microRNA的相对表达水平,转染受体细胞,并用放线菌素D(Act D)诱导凋亡,MTT法、流式细胞术和Edu染色共同检测Hela细胞活性。结果双酶切、测序表明cherry/miR-H3重组质粒构建成功,q PCR检测miR-H3大量表达,MTT法、Edu染色和流式细胞术检测表明转染重组质粒cherry/miR-H3并经诱导凋亡组细胞的活性明显比空质粒转染组和未转染组细胞活性高,具有统计学意义,而与正常细胞对照组无显著差异。结论 cherry/miR-H3真核表达载体可在Hela细胞中高效表达,并具有抗Act D诱导的细胞凋亡作用。     

miR-26b调控MCF-7细胞MCL-1蛋白的表达并诱导凋亡

目的探讨microRNA-26b(miR-26b)的作用靶点及其对MCF-7细胞的抑制作用。方法通过荧光定量PCR方法及Western blot方法检测正常乳腺细胞系MCF-10A及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及MDAMB-435的miR-26b及MCL-1的表达水平。MTT法检测miR-26b转染对MCF-7细胞活力的影响,Annexin V/PI染色法检测miR-26b转染对MCF-7细胞凋亡的影响。通过生物信息学分析预测miR-26b的靶基因,并将miR-26b转染入MCF-7细胞,检测miR-26b对MCL-1表达水平的影响。结果相比于MCF-10A细胞,乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及MDA-MB-435的miR-26b表达水平均显著下降,同时MCL-1表达水平均显著上升,提示miR-26在乳腺癌中其肿瘤抑制作用可能调节细胞MCL-1的表达。进一步研究发现MCL-1基因的3'-UTR区存在miR-26b的假定结合位点,且在乳腺癌细胞中转染miR-26b后,MCL-1的表达下降。转染miR-26b可抑制MCF-7细胞的活力并诱导其发生凋亡。结论 miR-26b下调MCF-7细胞MCL-1蛋白的表达并诱导其发生凋亡。     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。