猪卵透明带—3β融合蛋白在E.coli中的表达和鉴定

对全长猪卵透明带３β－（ｐＺＰ３β）ＤＮＡ的５′端重新测序分析，发现文献报道的该克隆基因５′端非编码序列中漏读了两个碱基，继而选择符合ｐＺＰ３βｃＤＮＡ阅读框的ｐＷＲ４５０－２载体质粒，通过双酶切构建了β－半乳糖苷酶／ｐＺＰ３β融合蛋白基因的细菌表达质粒。转化宿主菌后用ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明ｐＺＰ３β融合蛋白在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达，并在蛋白印迹鉴定中能同兔抗猪ＺＰ ＩｇＧ呈特异性     

胶质瘤单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的 构建并高效表达抗胶持瘤单链抗体（ＳｃＦｖ）,为基因工程双功能抗体的制备及进一步用于脑肿瘤的诊治奠定基础。方法 以重、轻链可变区基因构建ＳｃＦｖ基因,并克隆入表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１,在大肠杆菌ＢＬ２１ＤＥ３中诱导表达。以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达产物。结果 以限制性内切酶酶切及ＤＮＡ测序证实,基因构建正确,表达产物的相对分子质量（Ｍｒ）为５２０００,与理论值相符,表     

猪卵透明带-3α基因在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的通过遗传工程获得ＺＰ３α融合蛋白,以便用表达产物制备ＺＰ３α单克隆抗体。方法根据重新测序的猪ＺＰ３αｃＤＮＡ５＇端非编码碱基数,ｐＷＲ４５０表达质粒家族的ｐＷＲ４５０－２被选用来表达β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）／ＺＰ３α融合蛋白。带５＇端非编码区和信号顺序的全长ＺＰ３αｃＤＮＡ片段,用ＥｃｏＲⅠ酶切自ｐＺ５８质粒,然后被重组插入ｐＷＲ４５０－２质粒中被截短ＬａｃＺ＇基因的３＇端多克隆区。此重组质粒转化大肠杆菌ＴＧ１后,ＺＰ３α融合蛋白的表达通过ＩＰＴＧ诱导。结果在１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ存在下可观察到ＬａｃＺ／ＺＰ３α融合蛋白在大肠杆菌中的表达,表达量约占总细菌蛋白的５％。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上,融合蛋白显示相对分子质量为１０．２×１０４。在蛋白印迹实验中,融合蛋白显示了与兔抗猪ＺＰＩｇＧ的特异免疫学反应。结论猪ＺＰ３α融合蛋白的可获得性将有助于今后开展制备抗ＺＰ３α单抗和评价它的抗生育功效等研究     

突变和修饰IFN—α 2b基因的5‘和3’端对其在E.coli表达的调控作用

目的 对人ＩＦα２ｂ基因进行突变和修饰,从翻译水平上调控ＩＦα２ｂ基因在大肠杆菌中的表达。方法 采用ＰＣＲ技术,人工合成寡核苷酸引物,对人ＩＦＮ－α２ｂ基因进行了改造;在不改变氨基酸的前提下,将５‘端编码区的四个Ｇ、Ｃ位点突变为Ａ,Ｔ;去除３’端非编码区,将突变和修饰后的基因片段分别克隆入原核表达载体ｐＢＶ３２１;在大肠杆菌中进行表达,对表达产物进行活性效价测定。结果 ３‘端删除非编码区,表达水平     

钩体内鞭毛蛋白基因重组质粒的构建、表达和免疫保护性研究

对钩端螺旋体病的有效预防亟需广谱、高效、安全、价廉的疫苗。为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原,以探讨制备新疫苗的途径,我们设计一对引物（Ｐ１＝５’－ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＡＴ－３’,Ｐ２＝５’－ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＴＴＡＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧ－３’）,以赖型０１７株钩体ＤＮＡ为模板,利用ＰＣＲ扩增其编码基因完整的开放阅读框架,扩增产物经ＳａｌＩ、ＣｌａＩ双酶切消化后定向克隆于ｐＴ７－７载体上,构建原核表达重组质粒ｐＬＦ２。将该质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中,经Ｉ…     

抗胃癌鼠单抗3H11 Fab段载体的构建、表达及抗体活性检测

目的 构建和表达抗胃癌鼠单抗３Ｈ１１的Ｆａｂ段小分子抗体。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,利用第一骨架区通用引物扩增重链Ｆｄ段和ｋ链的基因,克隆到Ｆａｂ表达载体中,并根据已克隆的３Ｈ１１ ＶＬ的真实序列,重建设计ｋ链５‘端引物,将骨架区引物在ｋ链５’端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列,再次构建Ｆａｂ表达载体。结果 利用第一骨架区通用引物构建的Ｆａｂ在大肠杆菌中获得表达但未检测到抗原结合活性,将骨架     

SV40TAg真核表达载体的设计与构建

目的 设计并构建SV40TAg真核表达载体。方法 采用重叠延伸拼接法从pUC19-SV40载体中克隆切除了内含子的SV40LT基因全长，在其5’端连上loxP位点，EcoR I、BamH I双酶切，同时采用重叠延伸拼接法从pEGFP-N1真核表达载体中克隆EGFP基因全长，并在3’端连上loxP位点，两个酶切产物连接后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体，DNA序列分析鉴定重组质粒。结果 SV40LT基因和两个loxP位点成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中。结论 本实验构建的SV40LT重组质粒为利用SV40T抗原进行黑素细胞发育、分化，黑素生成以及黑素瘤发生等研究提供了新的分子工具。     

CDKN 2/p16基因甲基化失活与肺癌关系的研究

目的 研究ＣＤＫＮ２／ｐ１６基因５’端调控序列区ＣｐＧ岛甲基化的状态与肺癌发展的关系。方法 采用甲基化敏感性核酸酶切基因组ＤＮＡ的方法,对８９例肺癌的ＣＤＳＮ２／ｐ１６基因进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。结果 ８９例肺癌发现该基因甲基化２１例,甲基化频率为２３．６％（２１／８９）,其中１７例发生于４２例Ｐ１６蛋白 阴性表达的患者。结论 ＣＤＫＮ２ｐ／１６基因５’端ＣｐＧ岛甲基化可能是该基因失活的重     

miR-196a靶向调控HOXA9基因的实验研究

目的:研究HOXA9基因的表观遗传学调控机制,筛选靶向调控HOXA9基因的microRNA。方法:利用Tar-getscan在线分析软件预测特异性靶向HOXA9基因3’端非编码区域(3’UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增HOXA9基因3’UTR序列,插入经XbaI和PstI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。构建miR-196a结合位点突变的HOXA9基因3’端非编码区域突变型荧光素酶报告载体,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶突变型重组质粒及miR-196a表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-196amimics以脂质体Hiperfect转染至MV4-11细胞,实时定量PCR及Westernblot检测HOXA9mRNA及蛋白的表达。结果:成功构建了含有1628bp的HOXA9基因3’UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-3’UTR,并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告实验提示miR-196a组荧光素酶活性明显低于对照组。成功构建了miR-196a的2个结合位点突变的HOXA9基因3’UTR序列的突变型荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-mut3’UTR,并通过基因测序方法的鉴定。miR-196a可以下调野生型质粒的荧光素酶活性,不影响突变型质粒的荧光素酶活性。MV4-11细胞中过表达miR-196a,可以明显下调HOXA9mRNA及蛋白表达。结论:miR-196a通过靶向结合HOXA9基因3’UTR的结合位点特异调控HOXA9基因。     

托斯卡那病毒核蛋白的表达及纯化

采用聚合酶链反应方法从含托斯卡那病毒Ｓ片段全序列的ｃＤＮＡ质粒ｐＧＥＭ３ＺＳ中获得核蛋白基因片段，通过多克隆接头与５’端含有６个组氨酸残基的ｐＱＥ３０表达载体连接，在大肠杆菌中高效表达核蛋白。     

HGV E1区5‘端基因的克隆,序列分析及表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ从庚型肝炎患者血清中扩增出庚型肝炎病毒Ｅ１区５’端基因Ｅｐ，经限制性内切酶化后克隆入ｐＵＣ１９质粒中，序列分析结果表明，该基因与中国河北株相关基因核苷酸的同源性为９２％，将该基因亚克隆入原核表达载体ｐＥＸ３１ｂ中，成功地构建了ｐＥＸ３１ｂ－Ｅｐ重组质粒，经４２℃诱导表达，在Ｍｒ２００００处可见一条明显的表达带，表达产物约占总菌体蛋白的８％，经尿白铜染洗脱法纯化蛋白，ＥＬＩＳＡ检测表     

汉滩病毒S片段基因cDNA3‘端非编码区对核蛋白在…

为了探讨汉滩病毒Ｓ片段ｃＤＮＡ３‘端非编码区基因对核蛋白表达的影响，先后构建了两个核蛋白的表达质粒，其中ｐＢＶＳ２２不含非编码区基因，ｐＢＶＳＸ含有３’端非编码区基因，比较两者在大肠杆菌中表达核蛋白的水平后发现３‘端非码区对核蛋白的表达有明显的负调控作用，表达量下降近５０％，可能的原因是非编码区中含有非常丰富的ＡＴ碱基。该研究结果为进一步提高汉滩病毒核蛋白的表达量积累了经验，也为高效表达其它病毒结     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

背景:有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道。目的:构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒。方法:对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定。结果与结论:实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒。     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失重组质粒的构建？…

目的：构建ＨＳＶ－１型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以ｐＵＣ１８／ＴＫ重组质粒ＤＮＡ为模板,用ＰＣＲ方法扩增ＴＫ５＇端５０３ｂｐ基因片段,并将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中（ｐＵＣ１８／ＴＫ１）;用ＰｓｔＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切ｐＵＣ１８／ＴＫ,获得ＴＫ３＇端３８３ｂｐ片段,将此酶切片克隆入ｐＵＣ１８／ＴＫ１中,并进行测序。结果：构建成重组质粒ｐＵＣ１８／ＴＫ＾－。经酶切鉴定获     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨

目的：构建编码杀菌，通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法：采用RT-PCR技术，从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因，DNA序列分析鉴定；将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD／Thio-TOPO中，再次测序鉴定；通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达，然后以SDS-PAGE、Westerm blot对表达的重组蛋白进行分析。重组蛋白经初步纯化处理后，进行生物学活性检测。结果：RT-PCR扩增出一个835bp的DNA片段，DNA测序表明为所需目的基因。限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD／Thio-TDPO中，SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段。对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性。结论：成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，表达的重组蛋白具有一定的生物活性。     

丙型肝炎病毒基因组5‘非编码区酶切分型研究

对１０５例ＨＣＶＲＮＡ阳性标本用Ｓａｕ３ＡⅠ和ＨａｅⅢ两种酶对其５’ＮＣ区扩增产物进行酶切。结果呈现４种酶切类型。对不同酶切类型的扩增产物进行序列分析，结果显示，不同酶切类型的扩增产物都源于ＨＣＶ，核酸序列中的酶切点与酶切结果完全吻合。对文献中已经确定基因型的３３株ＨＣＶ作了比较，分析了酶切类型与基因型的关系。发现对ＨＣＶ５’ＮＣ区－２９７至－４１片段ＰＣＲ扩增产物用这两种酶分别酶切，可以把ＨＣＶ按Ｃｈａｎ氏分型（１９９２）分为１、２、３三组。本文１０５例标本，１组（包括Ⅰ、Ⅱ型）占８２．９％，２组（包括Ⅲ、Ⅳ型）占１５．２％，１、２组混合占１．９％，未发现３组。其中以１组（Ⅱ型）为最多，但不超过６９．５％。     

突变和修饰IFN-α2b基因的5’和3’端对其在E.coli表达的调控作用

目的对人 IFN- α2 b基因进行突变和修饰 ,从翻译水平上调控 IFN- α2 b基因在大肠杆菌中的表达。方法采用PCR技术 ,人工合成寡核苷酸引物 ,对人 IFN- α2 b基因进行了改造 :在不改变氨基酸的前提下 ,将 5’端编码区的四个 G、C位点突变为 A、T;去除 3’端非编码区。将突变和修饰后的基因片段分别克隆入原核表达载体 p BV32 1,在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行活性效价测定。结果 3’端删除非编码区 ,表达水平比删除前提高 4倍 ;5’端四个位点突变 ,表达水平比突变前降低 2倍。结论 IFN-α2 b基因的 3’端非编码区抑制其在原核系统的表达 ,删除该区可提高表达水平     

一种筛选原核高效表达克隆的方法

外源基因在大肠杆菌中的低表达往往与基因５’端核苷酸序列不利于翻译起始有关。未经修饰的ＧＭ－ＣＳＦ在大肠杆菌中表达量很低，我们选用ＧＭ－ＣＳＦ作为报道基因，在不改变氨基酸序列的前提下，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，构建了两类包含５’端１０个密码子的简并序列库，为便于快速筛选高表达的克隆，构建了四环素抗性（ＴｅｔＲ）选择载体筛选系统，其基本原理是外源基因与ＴｅｔＲ基因串联，高表达的ＧＭ－ＣＳＦ５’端带动ＴｅｔＲ的表达，逐渐提高四环素浓度就可以筛选出适合高表达的ＧＭ－ＣＳＦ５’端序列。最终在四环素浓度高达６０μｇ／ｍｌ的培养基上筛选了数个高表达克隆。这种系统对大肠杆菌中表达量低、但具有重大经济价值的细胞因子的表达有重要的意义     

单纯疱疹病毒Ⅰ型SM44株胸苷激酶基因的克隆及序列测定

为了分离、克隆单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）ＳＭ４４株胸苷激酶基因（ＴＫ）,采用原代兔婴肾细胞培养ＨＳＶ－Ｉ ＳＭ４４株病毒,提取病毒核酸作为模板,设计了ＨＳＶ－１ ＴＫ基因的上、下游引物,在引物的５‘端分别引入ＢａｍＨ１和ＥｃｏＲ１限制性内切酶位点,通过ＰＣＲ方法扩增出ＴＫ基因,经ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ １双酶切与ＰＵＣ１９质粒载体相连接,构建重组体转化受体菌ＪＭ１０９,通过筛选和酶切鉴定,获得