新生兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的:新生兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养方法,从各方面鉴定体外培养BMSCs的生物学特性。方法:采用贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续细胞的形态学观察。从形态学特征、表面标志物及其具有的向骨、脂肪分化的功能等多方面经行综合鉴定。结果:原代BMSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、呈放射状排列。传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速;可向成骨细胞、脂肪细胞分化。结论:贴壁筛选法可成功分离和培养新生兔的BMSCs,BMSCs能向成骨细胞、脂肪细胞分化,可以作为组织工程中种子细胞的来源。     

骨髓间充质干细胞多方向分化潜能实验研究

目的:分离和培养兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并向多向诱导分化。方法:经贴壁筛选法获得单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导,并进行鉴定。结果:骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的BMSCs经诱导后分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外培养具有多向分化潜能,可作为组织工程学种子细胞进行相关实验研究。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

PPARδ激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞分化的作用

目的：探讨过氧化物酶体增殖激活受体δ( PPAR δ)激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞( BMSCs)向成脂和成骨方向分化的作用。方法全骨髓培养法培养大鼠原代BMSCs后采用差速贴壁法纯化,流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物,实验分为PPAR δ激动剂组和对照组,分别进行成骨和成脂方向诱导培养,荧光定量PCR检测成骨细胞分化标志物(碱性磷酸酶、骨钙素)和脂肪细胞分化标志物(脂肪酸结合蛋白2、脂连素) mRNA的表达,油红O 染色检测脂肪细胞分化,茜素红染色检测成骨细胞矿化情况。结果与对照组比较,PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨细胞方向分化标志物表达,抑制向脂肪细胞方向分化标志物表达。茜素红染色显示PPAR δ激动剂组细胞矿化结节较对照组增加,油红染色显示PPAR δ激动剂组脂肪小滴明显减少。结论 PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨方向分化,抑制其向成脂方向分化。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞建立的成骨细胞培养模型的研究

目的：为骨折骨缺损治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型,观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养状态下的生长情况,对其向成骨细胞分化及分化能力进行研究.方法：采用全骨髓密度梯度离心法联合差速贴壁法从兔股骨骨髓中提取、分离、纯化BMSCs,取第3代BMSCs细胞分为两组进行培养,A组：为用含有诱导剂的低糖DMEM培养基的诱导培养组;B组：为常规培养组.倒置显微镜及HE染色观察记录各代次细胞形态等特征;CD44,CD90检测细胞表形,通过碱性磷酸酶（ALP）染色及标准化钙结节计数,鉴定细胞成骨活性.结果：兔骨髓间充质干细胞生长状态良好,培养7 d后各组细胞形态趋于一致,多呈长梭形,培养2 wk后对两组细胞进行ALP染色,可见A组细胞质内ALP染色阳性反应明显,B组染色显色弱.21 d时A组细胞茜素红染色后钙化结节数量多且较大,B组有少量钙结节形成,但较小.A组标准化钙结节计数显著高于B组差异具有显著统计学意义（P〈0.05）.结论：通过密度梯度离心法联合差速贴壁法所获得的BMSCs在常规培养或诱导培养时均可表现出成骨潜能,但诱导培养组的BMSCs的ALP活性更强,成骨能力更确切,可为骨组织工程远期实验研究提供理想的细胞模型.     

犬骨髓间充质干细胞体外分离培养及分化鉴定

目的:建立犬骨髓间质干细胞(dog bone mesenehymal stem cells,dBMSCs)的体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离d BMSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养。诱导dBMSCs向成骨、成脂细胞分化,并分别以矿化(钙)结节茜素红染色、油红O染色鉴定。结果:dBMSCs在体外分离培养扩增,形态呈长梭形成纤维细胞样,通过成骨、成脂诱导分化鉴定其为dBMSCs。结论:密度梯度离心法结合贴壁筛选法能有效的获取dBMSCs,所分离培养的d BMSCs同时具有多向分化潜能,是组织工程研究中理想的种子细胞。     

生殖细胞核因子在骨髓间充质干细胞增殖分化中的表达

目的:研究生殖细胞核因子在骨髓间充质干细胞增殖与分化中的表达.方法:取4～6周BALB/c小鼠,采用全骨髓贴壁筛选法体外培养小鼠BMSCs.取第3代小鼠BMSCs,定向诱导BMSCs向成骨细胞分化,通过检测碱性磷酸酶鉴定诱导后的细胞.采用RT-PCR及间接免疫荧光染色,从mRNA和蛋白水平检测GCNF在小鼠BMSCs诱导分化前后的表达.结果:RT-PCR与间接免疫荧光染色结果同时显示,第3代的小鼠BMSCs和向成骨方向诱导10d后的BMSCs均有GCNF表达.结论:GCNF在BMSCs增殖分化中有表达.     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究

目的：建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法.方法：体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达鉴定BMSCs,用含10 μg/L bFGF的L-DMEM及含200μmoVLBHA、2％ DMSO的无血清L-DMEM诱导BMSCs向神经元样细胞分化;免疫细胞化学检测分化细胞的巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达,以确定其分化特性;用尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）标记分化好的细胞,移植到改良Pulsinelli＇s四血管复制的血管性痴呆（VaD）模型大鼠侧脑室内,免疫组织化学检测BrdU表达以反映移植BMSCs在大鼠脑内的生长情况,Moms水迷宫检测大鼠学习记忆能力.结果：大鼠BMSCs可通过贴壁筛选法成功分离并在体外大量扩增,流式细胞仪检测显示BMSCs第5代表面标志可达90％以上,细胞表型CD90、CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;bFGF/BHA诱导BMSCs分化后有Nestin和NSE表达,分化细胞具有神经细胞的形态;与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第1次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义（P ＜0.05）;BrdU成功标记诱导后的BMSCs,并可在移植大鼠脑内检测到BrdU标记阳性细胞.结论：体外成功分离、培养大鼠BMSCs,生长稳定、可多次传代,bFGF/BHA可诱导BMSCs分化为神经元细胞,BMSCs成功移植到VaD大鼠,BMSCs有望为神经疾病细胞移植治疗提供丰富、易得的细胞来源.     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性，为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法 密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离纯化人骨髓间充质干细胞，并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果 分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长，呈梭形。细胞传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象；传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L—DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论 采用Percoll细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSC，是简便有效使用可行的方法；骨髓MSCs体外增殖和传代能力强，通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增；     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为心肌样细胞的条件。方法抽取大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离MSCs进行培养、传代,在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,应用荧光免疫组织化学方法进行鉴定。结果大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观。诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,肌钙蛋白及Connexin43表达强阳性。结论大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。     

人胚胎关节软骨来源的间充质干细胞

目的: 研究从人胚胎关节软骨中分离的细胞的特性、对其表面标志进行鉴定,探讨其多向分化潜能.方法: 从12～20周人胚胎关节软骨中分离细胞,观察细胞的形态、生长状态,采用流式分析的方法对其表面标志进行鉴定并探讨其成骨、成脂、成软骨以及成神经元样细胞的多向分化的潜能.结果:(1)从人胚胎关节软骨中分离的细胞,细胞形态均一,以梭形为主,生长旺盛,可传20代.(2)对不同代的细胞进行流式鉴定,发现其表面标志CD 44、CD 147、CD 90为阳性,CD 34、CD 45、HLA-DR为阴性,与骨髓来源的间充质干细胞的表面标志相似.(3)对其进行成骨、成脂、成软骨、成神经元样细胞的诱导,发现软骨来源的细胞具有多向分化的能力.结论: 从人胚胎关节软骨中可获得间充质干细胞.     

小鼠骨髓中持续携带单纯疱疹病毒I型的初步研究

目的：探讨单纯疱疹病毒I型（HSV-1）感染后在宿主骨髓是否形成潜伏感染。方法：尾静脉注射HSV-1感染小鼠,分别于病毒接种后5、15、30d处死实验组和对照组小鼠,取股骨分离培养原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并对其进行成骨细胞诱导和树突状细胞诱导的鉴定,PCR法检测骨髓及BMSCs中HSV-1特异条带。结果：BMSCs成骨诱导碱性磷酸酶和钙结节染色均呈阳性,培养出形态典型的树突状细胞。各实验组骨髓及其对应的BMSCs的第1、2代均检测到HSV-1的特异DNA片段。结论：骨髓是HSV一1形成潜伏感染的靶器官之一,且能随细胞增殖而持续携带HSV-1。     

骨髓间充质干细胞在博莱霉素致小鼠肺损伤的疗效观察

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对博来霉素致小鼠肺损伤动物模型的疗效。方法体外分离、培养雄性6周C57BL/6J小鼠间充质干细胞。15只雌性8周C57BL/6J小鼠随机分为3组:阴性对照组(P组),阳性对照组(B组),BMSCs治疗组(B+M组,每组5只)。P组于气管内注入PBS 50μL,B组及B+M组按5μg/g剂量气管内注入博莱霉素50μL制备肺纤维化模型,B+M组于造模后6 h经尾静脉注射BMSCs 1×107/mL,200μL。实验第28天统一处死小鼠,留取肺组织行病理HE染色、羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量测定,提取肺组织的DNA,通过聚合酶链反应(PCR)-琼脂糖电泳法检测雄鼠的性别决定基因(sry基因),以判断外源给予的BMSCs是否在雌性小鼠肺组织中存在。结果①肺组织病理:B+M组的肺泡炎及肺纤维化程度均较B组减轻。②HYP含量:B组的HYP含量明显高于P组及B+M组,B+M组的HYP含量与P组无明显差异。③B+M组有雄性小鼠的sry基因存在。结论①外源性BMSCs经尾静脉注射可以到达肺损伤部位;②外源性BMSCs可以减轻肺泡炎、肺纤维化的程度。