体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。 目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。 设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07/2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。 方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C对第3代骨髓间充质干细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。 主要观察指标：相差显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。 结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显微镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7 d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延长，局部细胞呈重叠生长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14 d可形成倒置显微镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21 d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节呈黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。 结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

诱导分化过程中不同融合状态大鼠骨髓间充质干细胞成骨的差异

背景：诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方案已基本成熟，但是诱导过程中影响分化效果的因素仍处于探索阶段。 目的：观察诱导时机的选择对大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2006-08/2007-01在苏州大学江苏省干细胞重点实验室完成,省级重点实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠，雌雄不限，体质量150~200 g。 方法：采用Percoll淋巴细胞分离液分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×107 L-1密度分组培养，诱导组分别于接种当时、细胞达50%~60%融合时、细胞达85%~95%融合时加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导培养基诱导。非诱导组采用普通培养基培养。 主要观察指标：诱导后7，14 ，21，28 d行钙钴染色、Von-Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测成骨细胞能力。定期在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长状况。 结果：经钙钴染色后，诱导组大部分染色的细胞呈阳性反应，胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒，大多数多角形细胞呈阳性，如铺路卵石样排列，随着时间的延长，可见片状强阳性细胞，以细胞达85%~95%融合时诱导培养组数量最多，结节体积最大。非诱导组未见片状强阳性细胞。Von-Kossa 染色后可见深棕色致密结节。以细胞达85%~95%融合时诱导培养组形成结节较早，同期相比数量较其他组多。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明经成骨诱导剂诱导后与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高，表现细胞成骨分化特点。 结论：初始接种密度相同的情况下，细胞间相互接触程度越高，成骨能力越强。     

骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应*

背景：骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用。 目的：通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因。 方法：采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征。采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行基因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值。 结果与结论：①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化。②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio>2),下调的基因(sFrp 5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio<0.5)。成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kremen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个。提示Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用。     

胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养*★

目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。 方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行。①实验方法：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm；体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3 周，经检测诱导成功后，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周。②观察指标：通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞经成骨诱导，检测碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，证实诱导成功。②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好，经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24 h后,顺孔隙迁徙至支架内部，倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔壁贴附良好。③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定，能分泌细胞外基质，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。　 结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好，为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。     

低氧环境对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响☆

目的：目前公认肾上腺素能β1受体含量和环磷酸腺苷水平在心肌细胞处于低氧状态时会发生改变，然而诱导分化的骨髓间充质干细胞经慢性低氧作用后能否表现与心肌细胞相同的特性还未知，故检测其β1受体mRNA表达及第二信使环磷酸腺苷活性变化。 方法：实验于2006-02/2007-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院心研所实验室完成。①动物：清洁级成年昆明小鼠10只，新生1 d龄昆明小鼠40只，均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：成年小鼠麻醉后于肱骨及胫骨骨折处吸取适量骨髓，加入含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素G、80 U/mL链霉素的IMDM培养基，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。将新生鼠处死迅速取心脏，用Ⅱ型胶原酶消化离心，将生长较好的第1、2代心肌细胞制成1×109 L-1细胞裂解液，体外模拟心肌微环境诱导分化骨髓间充质干细胞。设立2组，空白对照组仅加入IMDM培养基，实验组加入IMDM培养基和心肌细胞裂解液，隔天换液，继续培养1周后又分为4个亚组：常氧组，常氧不加药物作用72 h；低氧组，用1%氧浓度作用72 h；异丙肾上腺素组，用1×10-5 mmol/L异丙肾上腺素作用72 h；低氧+异丙肾上腺素组，用1%低氧和1×10-5 mmol/L异丙肾上腺素联合作用72 h。③实验评估：RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平，放射免疫法测定骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷的活性。 结果：①骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平的表达：空白对照组不表达β1受体mRNA。作用72ｈ后，常氧组表达β1受体mRNA，低氧组β1受体mRNA水平升高100%，异丙肾上腺素组、低氧+异丙肾上腺素组β1受体mRNA水平均降低40%。②骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷活性检测：与常氧组比较，低氧组环磷酸腺苷活性无明显变化（P > 0.05）；异丙肾上腺素组环磷酸腺苷活性下降35%（P < 0.05）；低氧+异丙肾上腺素组与异丙肾上腺素组水平相当（P > 0.05）。 结论：①采用心肌细胞裂解液体外模拟心肌微环境诱导分化的骨髓间充质干细胞表达β1受体。②单纯低氧作用可明显升高骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平，环磷酸腺苷活性无变化。经异丙肾上腺素作用后，低氧环境无法显著改变β1受体mRNA水平和环磷酸腺苷活性。     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

摘要 背景：最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性。 目的：验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况。 方法：贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况。培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量。 结果与结论：发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞。骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养。结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 关键词：胶原蛋白;羟基磷灰石;骨组织工程;骨髓间充质干细胞;支架 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.014     

骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞的诱导**☆

背景：已经证实应用维甲酸和双丁酰环磷酸腺苷作为诱导剂,可以在体外建立胚胎干细胞分化为平滑肌细胞的模型。 目的：尝试应用维甲酸和双丁酰环磷酸腺苷诱导犬骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞分化,评价其作为血管壁种子细胞的可行性。 设计、时间及地点：随机对照,体外诱导细胞学实验,于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。 材料：成年杂种犬10只,雌雄不拘,用于取骨髓。 方法：骨髓穿刺法获取犬骨髓,密度梯度离心和贴壁生长的方式提取单个核细胞;取第2~4代细胞,用含维甲酸和双丁酰环磷酸腺苷的培养液诱导、分化为血管平滑肌样细胞。 主要观察指标：相差倒置显微镜观察细胞形态学;免疫荧光显微镜观察β肌动蛋白的表达;电镜观察细胞超微结构的改变。 结果：骨髓间充质干细胞经苷诱导2周后细胞融合成片形成峰谷样外观,β肌动蛋白呈阳性表达。透射电镜显示胞浆内可见肌丝形成,表现出比较原始的血管平滑肌细胞的特点。 结论：维甲酸和双丁酰环磷酸腺苷可诱导骨髓间充质干细胞在体外定向分化为具有平滑肌细胞特性的细胞,将其作为构建组织工程化血管的种子细胞是可行的。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

磷酸三钙多孔生物陶瓷复合自体骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死模型的超微结构观察

背景：股骨头坏死病灶清除后的骨缺损难以修复,磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞的复合培养体内成骨的超微结构仍不明确。 目的：通过观察磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞复合培养体内成骨的超微结构,了解其在股骨头缺损修复中的成骨效应,验证磷酸三钙多孔生物陶瓷作为组织工程载体材料的可行性。 设计、时间及地点：随机对照开放性动物体内实验,于2008-02/08在中日友好医院骨坏死与骨循环实验室完成。 材料：体外培养兔骨髓间充质干细胞,并与β-磷酸三钙多孔陶瓷材料复合共同培养2周。 方法：新西兰大白兔30只,随机分为3组,制作股骨头坏死缺损模型后,空白对照不作填充,磷酸三钙组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷,磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞的复合物。 主要观察指标：通过环境扫描电镜观察骨髓间充质干细胞与材料的复合情况;回植体内6,12周后,取材,通过电镜观察磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞体内成骨的超微结构,了解材料降解及骨组织的替代过程。 结果：磷酸三钙多孔生物陶瓷与骨髓间充质干细胞复合培养良好。空白对照组缺损区6,12周均见纤维组织结构,无骨小梁结构;磷酸三钙组6周材料和骨基质交界不清,材料开始降解,12周材料与周围组织边界模糊,材料部分降解,多孔框架结构不清;磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组6周新生骨从宿主骨长出,12周可见成熟骨组织的连续平行纤维结构网络,材料降解,表面有较多的成骨细胞。后2组在股骨头缺损修复成骨方面优于空白对照组,磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组成骨更佳。 结论：磷酸三钙多孔生物陶瓷是良好的组织工程支架材料,易与骨髓间充质干细胞复合,可用于股骨头坏死骨缺损的修复。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论。 目的：体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能。 方法：采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定。 结果与结论：经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征。提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

表皮生长因子干预小鼠非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成及向神经元样细胞的分化**

背景：非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位，并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，表现出一定的多分化潜能。 目的：探讨表皮生长因子对非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落的影响，及其在体外向神经细胞分化的能力。 方法：分离小鼠双侧股骨、胫骨，全骨髓法分离总骨髓细胞，采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法纯化非黏附骨髓间充质干细胞。取第5代总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞，加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞诱导液培养2周。观察非黏附骨髓细胞产生成纤维细胞集落形成单位的能力，表皮生长因子对成纤维细胞集落形成单位的影响，甲苯胺蓝和免疫细胞化学染色鉴定相关蛋白的表达。 结果与结论：总骨髓细胞、反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位。给予表皮生长因子处理后，非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位的效率明显增高。诱导2周后，免疫细胞化学染色显示，总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞均表达神经细胞特异性蛋白NeuN和NF-200；经甲苯胺蓝染色在部分细胞中可见神经元特异性标记尼氏体。证实表皮生长因子可有效促进小鼠非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落形成单位的效率，经反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞能够诱导分化为神经细胞。     

骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的分化☆

背景：特定环境下体外可定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞分化。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为甲状腺细胞的实验方法。 方法：采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素和胰岛素诱导,以未诱导组为平行对照。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达,第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达;对照组未见变化。形态学与生物学证实了骨髓间充质干细胞可诱导培养为甲状腺细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞与成骨细胞共育环境下Ⅰ型胶原的表达

背景：骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分别分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等。 目的：与成骨细胞共培养的条件下，观察大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。 材料：3月龄SPF级SD大鼠6只用于骨髓间充质干细胞的分离与扩增，1 d龄以内清洁级SD乳鼠10只用于成骨细胞的分离与扩增。 方法：贴壁法分离骨髓间充质干细胞，扩增后以流式细胞仪检测其均一性及细胞表型。采用酶消化法分离培养成骨细胞，以磷酸酶染色观察细胞分泌情况。利用Transwell培养板将成骨细胞和骨髓间充质干细胞在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内培养，以采用普通培养板单独培养的骨髓间充质干细胞为对照。 主要观察指标：观察骨髓间充质干细胞的形态学变化及矿化能力，20 d后半定量RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。 结果：流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好，2代细胞均一性在90%以上，CD34、CD45表达为阴性，CD44表达阳性。成骨细胞原代培养20 d时出现不透光的钙化结节，生长期细胞分裂相多见，细胞突起相互连接，汇合时呈铺路石状。茜素红染色矿化结节呈现酒红色，骨碱性磷酸酶染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。共培养的骨髓间充质干细胞形成的钙化结节数高于对照组(P < 0.05)；与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达量明显高于对照组(P < 0.01)。 结论：与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达量高，成骨能力强。     

脐血间充质干细胞生物学特性及其成骨成脂分化潜能

背景：对于脐血来源间充质干细胞的研究是干细胞研究领域的重点和热点,但目前国内外研究对其报道尚较少,许多方面存在争议。 目的：观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,并探讨其向成骨、成脂肪细胞诱导分化的能力。 方法：从不同胎龄脐血中分离培养间充质干细胞;通过倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态、生长增殖情况及其超微结构;并描绘细胞生长曲线;用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测。分别用成骨及成脂诱导液对脐血间充质干细胞进行诱导,通过茜素红染色检测脐血间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力;通过油红O染色检测其向脂肪细胞诱导分化的能力。 结果与结论：倒置相差显微镜下观察脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜观察脐血间充质干细胞细胞核大,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞均稳定表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29,CD44和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45。脐血间充质干细胞成骨诱导后3周时茜素红染色可检测到大量钙化基质的形成;成脂诱导3周时油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,具有强大的生长增殖与自我更新能力。脐血间充质干细胞在体外诱导条件下可以向成骨细胞及脂肪细胞等间质组织细胞定向分化。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞中的钙离子检测

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞经丹参注射液诱导分化的神经元样细胞内钙离子浓度,以期为骨髓间充质干细胞应用于神经系统疾病的治疗提供理论依据.方法 从成年大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞,体外扩增培养,经碱性成纤维生长因子预诱导后施加10mL/L丹参注射液于骨髓间充质干细胞培养液中.运用免疫荧光检测神经元特异性核蛋白(NeuN)在诱导后细胞与经新生大鼠海马获取的体外培养海马神经元中的表达.激光共聚焦技术检测诱导后的细胞内钙离子浓度.并与原代培养海马神经元内的钙离子浓度进行比较.结果 大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维生长因子和丹参注射液处理后,可表达NeuN,并具有神经元样的表型.诱导分化的神经元样细胞内钙离子浓度为984.75±79.51,原代培养海马神经元内钙离子浓度为769.42±60.93,两者比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞具有神经元的某些特征.     

贴壁和缩短胰酶消化时间培养大鼠骨髓间充质干细胞☆

背景：对于骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增目前已有几种方法，各自均有不同的优劣性。 目的：观察贴壁法和缩短胰酶消化时间的方法体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的特点。 方法：培养初期频繁换液，去除混杂细胞；传代后加入不同诱导剂定向诱导分化，使之分别向脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞方向分化。 结果与结论：该分离培养方法在第3代可以得到纯化的骨髓间充质干细胞。分离培养的细胞纯度高，有良好的增殖和分化潜能。定向诱导培养的细胞能向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞方向分化。     

体外大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞等不同组织细胞多向分化的潜能。方法从SD大鼠股骨骨髓中获得间充质干细胞,原代培养后1∶2传代,传至第5代后分为普通传代培养组、神经细胞诱导组、成骨细胞诱导组和脂肪细胞诱导组。倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况、形态变化以及矿化结节和脂肪细胞的形成;流式细胞检测第5代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45;免疫组织化学检测普通传代培养组和神经细胞诱导组细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶等神经细胞相关蛋白的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞呈贴壁生长,细胞扩增至第5代时形态趋于一致,呈梭形。大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)均呈阳性表达,CD31(0.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)无表达。在体外,普通传代培养细胞仅巢蛋白呈阳性表达;由神经细胞诱导的细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,且形态类似神经细胞;由成骨细胞诱导的细胞质内可见矿化结节形成;由脂肪细胞诱导的细胞质内出现多个猩红色呈簇状的脂肪滴。结论大鼠骨髓间充质干细胞易于提取、纯化和扩增,可于体外自发表达神经干细胞标志蛋白,并可通过诱导向神经细胞、成骨细胞及脂肪细胞分化。提示骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能,而且可能具有自发向神经干细胞分化的特性。     

人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及

背景：间充质干细胞由于具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能,近年来已成为细胞领域的研究热点。 目的：对比观察脐带血与骨髓来源的间充质干细胞其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性比较。 设计：体外细胞学对比观察。 材料：新鲜脐带血在征得产妇同意后采集。骨髓由健康的成年志愿者捐赠。 方法：取脐带血和成人骨髓分离、培养并纯化间充质干细胞,对获得的间充质干细胞进行形态学观察。 主要观察指标：两种来源间充质干细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面抗原的表达情况;对脐带血间充质干细胞多向分化的能力进行鉴定。 结果：两种来源的单个核细胞经体外培养贴壁后均出现间充质样细胞,原代骨髓间充质干细胞的贴壁时间和培养时间均短于脐带血间充质干细胞,两种细胞传代生长呈共同特性：传代培养潜伏期为24~36 h,传代培养对数增殖期为接种后3～7 d,接种后八九天,生长进入平台期;脐带血来源的间充质干细胞表达相关抗原CD29、CD44、CD105;但不表达造血细胞抗原CD34、CD45;脐带血间充质干细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞。 结论：人脐带血和骨髓来源间充质干细胞均可在体外分离培养、扩增;脐带血的间充质干细胞原代贴壁时间、形成细胞克隆的时间、集落交错融合的时间均较骨髓间充质干细胞晚,传代培养的细胞形态,生长速度均无明显差异;两种来源的间充质干细胞具有相同的表面标志物;脐带血间充质干细胞有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞、成骨细胞。     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白，可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化。LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力。 目的：观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果，及对其分化的影响。 方法：大鼠骨髓间充质干细胞分离培养，传代后，检测特异性标记物CD44的表达情况，矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率，RT-PCR及Western blot验证感染效果，观察感染Ad-LMP-1 2，7，14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响。 结果与结论：传代细胞形态一致，排列紧密。矿化液诱导后，细胞形态明显改变。茜素红染色结果表明，诱导后出现钙化结节。观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变，14 d出现类钙化结节，但不伴有细胞增殖活力改变。结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞分化。