神经科学研究中绿色荧光蛋白报告基因的应用

随着研究手段的进步，人们对神经学的研究更加深入。绿色荧光蛋白作为一种新型的报告基因，具有荧光性质稳定、对生物体无毒性作用、检测时不需底物的特点，在神经细胞的基因表达、蛋白定位的研究上优于其他报告基因，尤其适合于活体细胞功能与形态相结合的研究。     

绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用

目的：了解绿色荧光蛋白标记在干细胞移植研究中应用的进展情况。资料来源：应用计算机检索Medline 1990-01／2005-11期间的相关文章，检索词为“green fluorescent protein，stemcell，labeling”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索重庆维普数据库、清华同方数据库和万方数据库1990-01／2005-11期间的相关文章，检索词为“绿色荧光蛋白，干细胞，标记”，并限定文章语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用研究相关。 排除标准：明显缺乏随机对照的实验研究、重复研究或综述类文献。 资料提炼：共收集到123篇相关文献，27篇文献符合纳入标准，排除的96篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的27篇文献中，关于绿色荧光蛋白的结构和功能7篇，关于绿色荧光蛋白标记干细胞的方式及其在干细胞分化、定量、示踪中的应用17篇，关于绿色荧光蛋白在细胞标记的毒副作用3篇。 资料综合：绿色荧光蛋白作为标记物时主要优点有：①不需加任何底物，监测方便。②分子量较小，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能影响小。③不影响或很少影响细胞的正常功能。④绿色荧光蛋白荧光表达稳定，可耐受一定的理化处理。绿色荧光蛋白被广泛地应用于干细胞移植的研究中。目前，常用的标记干细胞的方式有3种：质粒载体转染．病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。结合使用定量聚合酶链反应、激光共聚焦、荧光激活细胞分类计数和激光捕获显微切割技术等技术方法，可有效地监测移植干细胞在体内的分布和分化情况，并可定量分析其在组织中的含量。 结论：绿色荧光蛋白标记具有检测方便、表达稳定和不影响细胞功能等优点，从而被广泛地用于示踪移植干细胞在体内的分布、含量、分化等方面的研究。绿色荧光蛋白标记细胞还可能存在一定的毒副作用，应进一步加以改进，以利于其应用。     

绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用

目的:了解绿色荧光蛋白标记在干细胞移植研究中应用的进展情况。资料来源:应用计算机检索Medline1990-01/2005-11期间的相关文章,检索词为“greenfluorescentprotein,stemcell,labeling”,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索重庆维普数据库、清华同方数据库和万方数据库1990-01/2005-11期间的相关文章,检索词为“绿色荧光蛋白,干细胞,标记”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用研究相关。排除标准:明显缺乏随机对照的实验研究、重复研究或综述类文献。资料提炼:共收集到123篇相关文献,27篇文献符合纳入标准,排除的96篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的27篇文献中,关于绿色荧光蛋白的结构和功能7篇,关于绿色荧光蛋白标记干细胞的方式及其在干细胞分化、定量、示踪中的应用17篇,关于绿色荧光蛋白在细胞标记的毒副作用3篇。资料综合:绿色荧光蛋白作为标记物时主要优点有:①不需加任何底物,监测方便。②分子量较小,与目的基因融合后,对目的基因的结构功能影响小。③不影响或很少影响细胞的正常功能。④绿色荧光蛋白荧光表达稳定,可耐受一定的理化处理。绿色荧光蛋白被广泛地应用于干细胞移植的研究中。目前,常用的标记干细胞的方式有3种:质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。结合使用定量聚合酶链反应、激光共聚焦、荧光激活细胞分类计数和激光捕获显微切割技术等技术方法,可有效地监测移植干细胞在体内的分布和分化情况,并可定量分析其在组织中的含量。结论:绿色荧光蛋白标记具有检测方便、表达稳定和不影响细胞功能等优点,从而被广泛地用于示踪移植干细胞在体内的分布、含量、分化等方面的研究。绿色荧光蛋白标记细胞还可能存在一定的毒副作用,应进一步加以改进,以利于其应用。     

绿色荧光蛋白及其应用

源于水母（Aepuorea vietoria）等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是一种极具潜力的标记物。其内源荧光其团在受紫外光或蓝光激发时可高效发射清淅可见的绿光,且荧光性质稳定,与现在的标记物相比,GFP具有无可比拟的优势。因而自GFP被发现以来,一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白定位的理想标记。广泛应用于转基因动物的研究、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化,病原菌侵入活细胞的分子过程等。表明GFP是一类能在现代细胞生物学和分子生物学研究与临床检测中发现重要作用的较理想的基因表达标记物。     

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白.研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达.目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN.用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析.结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp.构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带.插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带.限制性内切酶法鉴定,750与6000 bp处有特异性条带.DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%.结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向.     

外源重组基因表达产物亚细胞定位的研究现状

目的：将外源基因通过重组然后在宿主细胞中表达,以研究其功能.资料来源：应用计算机检索Medlinel997-01/2004-12与外源基因重组表达产物亚细胞定位的相关文献,检索词“foreign recombined gene,subcellure location”等分别进行检索提炼,限定文献语种为English.资料选择：就检索到的500余篇资料进行初审,纳入标准：①有关外源基因重组策略.②与表达产物定位检测方法相关.排除标准：文献中重复研究、综述、Meta分析类文章.未排除文章中资料是否应用了随机、对照和盲法.资料提炼：共收集到80余篇关于外源基因重组表达后定位相关的文章.其中研究内容相似的,以近5年内发表在较权威杂志者优先.对符合标准的38篇文献进行分析.资料综合：外源重组基因在宿主细胞中表达后,可以通过多种方法进行亚细胞定位,如报告基因,免疫电镜,免疫荧光技术等,且大规模的外源重组基因亚细胞定位具有重要的意义.结论：因为外源重组基因表达产物的功能与其在宿主细胞中的定位有重要的关系,所以研究其在宿主细胞中的亚细胞定位,对研究外源重组基因表达产物的功能或未知新基因的功能来说有很重要的意义.     

增强型绿色荧光蛋白在人软骨细胞中的表达及修复重建人软骨示踪方法的研究

目的：检测增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)基因在原代培养的人鼻中隔软骨细胞的转染效率及瞬时表达，建立原代培养的人鼻中隔软骨细胞的示踪方法，为用组织工程法修复重建人软骨寻求示踪方法提供依据。方法：在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒，通过Amaxa细胞核转染仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人鼻中隔软骨细胞，应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况，流式细胞仪检测其转染效率。结果：增强型绿色荧光蛋白在基因转染24h后得到了明显表达，48h后流式细胞仪检测其转化率为35．37％，且未影响软骨细胞的贴壁过程。结论：经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人软骨细胞仍能在体外存活，pEGFP-N1是转染原代培养的人软骨细胞较为理想的瞬时表达载体．也是组织工程化软骨形成过程的良好示踪剂。     

增强型绿色荧光蛋白在人软骨细胞中的表达及修复重建人软骨示踪方法的研究

目的:检测增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)基因在原代培养的人鼻中隔软骨细胞的转染效率及瞬时表达,建立原代培养的人鼻中隔软骨细胞的示踪方法,为用组织工程法修复重建人软骨寻求示踪方法提供依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过Amaxa细胞核转染仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人鼻中隔软骨细胞,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率。结果:增强型绿色荧光蛋白在基因转染24h后得到了明显表达,48h后流式细胞仪检测其转化率为35.37%,且未影响软骨细胞的贴壁过程。结论:经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人软骨细胞仍能在体外存活,pEGFP-N1是转染原代培养的人软骨细胞较为理想的瞬时表达载体,也是组织工程化软骨形成过程的良好示踪剂。     

高效绿色荧光蛋白基因标记系统的建立及其初步应用

逆转录病毒载体编码的众多报告分子被广泛用于分析基因转导率、分选或示踪基因修饰靶细胞 ,特别在改进基因转导条件、阐明造血干细胞 (ＨＳＣ)生物学特性和判定白血病复发的细胞来源等方面发挥了重要作用[1,2 ] 。作为新一代的报告分子 ,增强型绿色荧光蛋白 (ＥＧＦＰ)最近已被用于造血细胞的基因转移和示踪肿瘤转移与血管形成等研究[3 ] 。我们曾建立双启动子逆转录病毒载体介导的ＥＧＦＰ基因转移系统 ,但发现转导靶细胞后荧光强度较低[4 ] 。为提高靶细胞ＥＧＦＰ的表达 ,我们构建了仅携带ＥＧＦＰ单基因的逆转录病毒载体Ｇ1ＦＰ ,并在不…     

外源重组基因表达产物亚细胞定位的研究现状

目的：将外源基因通过重组然后在宿主细胞中表达，以研究其功能。 资料来源：应用计算机检索Medline 1997-01／2004-12与外源基因重组表达产物亚细胞定位的相关文献，检索词“foreign recombined gene，subcellure location”等分别进行检索提炼，限定文献语种为English。 资料选择：就检索到的500余篇资料进行初审，纳入标准：①有关外源基因重组策略。②与表达产物定位检测方法相关。排除标准：文献中重复研究、综述、Meta分析类文章。未排除文章中资料是否应用了随机、对照和盲法。 资料提炼：共收集到80余篇关于外源基因重组表达后定位相关的文章。其中研究内容相似的，以近5年内发表在较权威杂志者优先。对符合标准的38篇文献进行分析。 资料综合：外源重组基因在宿主细胞中表达后，可以通过多种方法进行亚细胞定位，如报告基因，免疫电镜，免疫荧光技术等，且大规模的外源重组基因亚细胞定位具有重要的意义。 结论：因为外源重组基因表达产物的功能与其在宿主细胞中的定位有重要的关系，所以研究其在宿主细胞中的亚细胞定位，对研究外源重组基因表达产物的功能或未知新基因的功能来说有很重要的意义。     

绿色荧光蛋白报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达:用做转染报道基因的可行性鉴定

目的:将经过"人类化"改造的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因质粒导入鼻咽癌CNE1细胞系内,观察GFP报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达情况.方法:实验于2004-07/2007-07在广东医学院病理学实验室完成.将带有GFP报道基因的质粒PAT-GFP及PAT-GFP-LMP1在电容960 μ F,280 V条件下电导转染到鼻咽癌CNE1细胞系中,用选择培养液(嘌呤霉素筛选)继续换液培养直至长出抗性细胞克隆,胰酶消化收集细胞.存488 nm光激发下,用荧光显微镜检测及流式细胞仪观察转染细胞在活的、固定后或裸鼠体内移植后3组细胞的GFP的表达情况并计算转染效率,并用免疫组化法及Western blot法观察插入目的基因LMP1的表达情况.结果:温度在28～32℃的条件下活细胞有GFP基因稳定而持续地表达,但表达较低,表达率为(16.20±1.70)%,且目的基因LMP1的插入明显影响GFP基因的表达,表达率为(3.48±0.28)%,而在固定后或裸小鼠体内移植后均无表达;目的基因LMP1则能稳定而持续地表达.结论:绿色荧光蛋白报道基因GFP在CNE1细胞系中能稳定而持续地表达,且不影响插入目的基因的表达,可用做转染报道基因.     

Improved green fluorescent protein reporter gene-based microplate screening for antituberculosis compounds by utilizing an acetamidase promoter

The green fluorescent protein (GFP) gene offers many advantages as a viability reporter for high-throughput antimicrobial drug screening. However, screening for antituberculosis compounds by using GFP driven by the heat shock promoter, hsp60, has been of limited utility due to the low signal-to-noise ratio. Therefore, an alternative promoter was evaluated for its enhanced fluorescence during microplate-based culture and its response to 18 established antimicrobial agents by using a green fluorescent protein microplate assay (GFPMA). Mycobacterium tuberculosis strains H37Rv, H37Ra, and Erdman were transformed with pFPCA1, which contains a red-shifted gfp gene driven by the acetamidase promoter of M. smegmatis mc(2)155. The pFPCA1 transformants achieved higher levels of GFP-mediated fluorescence than those carrying the hsp60 construct, with signal-to-noise ratios of 20.6 to 27.8 and 3.8 to 4.5, respectively. The MICs of 18 established antimicrobial agents for all strains carrying pFPCA1 in the GFPMA were within 1 to 2 twofold dilutions of those determined by either the fluorometric or the visual microplate Alamar Blue assay (MABA). No significant differences in MICs were observed between wild-type and pFPCA1 transformants by MABA. The optimized GFPMA is sufficiently simple, robust, and inexpensive (no reagent costs) to be used for routine high-throughput screening for antituberculosis compounds.     

用标记技术实时观察中性粒细胞吞噬病原体

目的　试图建立一种快速、直接判断中性粒细胞的吞噬、杀菌功能的标准方法 ,并对该方法进行分析与评价。方法　将带有绿色荧光蛋白 (GFP)基因的PRSETB质粒转化为大肠埃希菌BL2 1 ,利用BL2 1 高效表达GFP后发出强烈绿色荧光的特点 ,用电荷耦合器件 (CCD)耦合荧光显微镜连续记录中性粒细胞对大肠埃希菌粘附、内吞、消化和残体外排的全过程。结果　粘附过程 :BL2 1 在中性粒细胞膜表面停顿约 1 5s(1 5 0± 0 15s) ,为抗原识别过程 ;内吞过程 :中性粒细胞膜内陷、伸出伪足将大肠埃希菌包裹 ,并向细胞中心移动 ,持续时间可达 132s(132± 14s) ;消化过程 :当大肠埃希菌进入中性粒细胞胞体后 ,其杆状体逐渐变短 ,GFP发出的荧光强度逐渐变弱 ,持续时间约为 35 0s(35 0± 32s) ;残体外排过程 :可观察到溶酶体残体由中性粒细胞中心向胞膜运动 ,最后排出 ,持续时间约为 140s(140± 2 7s)。结论　该方法利用光子学显像和基因标记相结合的技术可以实时、连续观察中性粒细胞对大肠埃希菌的吞噬杀菌过程 ,对临床治疗有重要意义。     

Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy.

Green fluorescent protein (GFP) is a widely used intracellular reporter molecule to assess gene transfer and expression. A potential use for GFP is as a co-expressed marker, to select and enrich gene-modified cells by flow cytometry. Processed peptides derived from GFP and presented by the major histocompatibility complex on the cell surface could potentially induce T cell immune responses against GFP+ cells. Thus, clinical application of GFP is premature, since in vivo studies on its immunogenicity are lacking. Therefore, we investigated immune responses against EGFP (enhanced-GFP) in two transplantable murine models: the BALB/c (H-2d) BM185 pre-B leukemia and the C57BL/6 (H-2b) EL-4 T cell lymphoma. BM185 and EL-4 cell lines modified to express high levels of EGFP showed drastic reduction of disease development when transplanted into immunocompetent mice. BM185/ EGFP did lead to rapid development of disease in immunodeficient Nu/Nu mice. Mice surviving BM185/EGFP leukemia challenge developed high cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses against EGFP-expressing cells. Furthermore, immune stimulation against BM185/EGFP cells could also be induced by immunization with EGFP+ transduced dendritic cells. The effects of the co-expression of EGFP and immunomodulators (CD80 plus GM-CSF) were also investigated as an irradiated leukemia vaccine. EGFP co-expression by the vaccine did not interfere with the development of CTLs against the parental leukemia or with the anti-leukemia response in vivo. These results indicate that the immune response against EGFP may interfere with its applicability in gene insertion/replacement strategies but could potentially be employed for leukemia cell vaccines.     

P—选择素凝集样区和绿色荧光蛋白融合基因的构建

目的 构建P-选择素凝集样区与绿色荧光蛋白融合基因（pEGFP-N1/L）,为进一步明确P-选择素不同表位与功能间的关系,为阐明P-选择素生理病理意义奠定基础。方法 应用PCR技术扩增质粒pCDM1/cDNA凝集素校区,用T4连接酶将其插入载体pEGFP-N1;经酶切和测序对插入片段进行分析、鉴定。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建pEGFP-N1/L融合基因成功,为绿色荧光蛋白作为主生物标记分子来研究P-选择素分子的构效关系打下良好的基础。     

Retrovector encoding a green fluorescent protein-herpes simplex virus thymidine kinase fusion protein serves as a versatile suicide/reporter for cell and gene therapy applications

Expression vectors encoding herpes simplex virus thymidine kinase (HSVTK) have been extensively used in cell and gene therapy applications either as anticancer "suicide" or as "self-destruct" transgenes in adoptive immunotherapy applications. In both gene therapy applications, reliable detection of HSVTK transgene expression is required in genetically engineered cells. Direct fluorescent labeling of the HSVTK protein may be the remedy. We designed a retrovector encoding a chimeric GFP-HSVTK fusion protein that can serve as a bifunctional suicide and reporter transgene. The fusion gene was incorporated in a VSV G-pseudotyped retrovector (vGFPTKfus) and high-titer stable retroviral producer was generated ( approximately 3 x 10(6) retroparticles/ml). Tumor cell lines transduced at an MOI of 8 for 3 days led to >90% gene transfer efficiency. Southern blot analysis confirmed that unrearranged proviral genomes integrated in chromosomal DNA. Protein extract immunoblot with HSVTK antisera revealed the presence of a 70-kDa protein consistent with the predicted size of an HSVTK-GFP fusion protein. Fluorescence microscopy and FACS analysis revealed that GFPTKfus-mediated fluorescence was nuclear localized and was 30-fold greater than that observed in a bicistronic HSVTK-GFP vector. Growth of cell lines expressing vGFPTKfus was significantly suppressed in the presence of ganciclovir. The DA3 mouse mammary carcinoma cell line was transduced with vGFPTKfus and implanted in syngeneic BALB/c mice. Preestablished tumors completely regressed in seven of nine mice treated with ganciclovir. Normal human peripheral blood T lymphocytes were transduced with vGFPTKfus and nucleus-restricted green fluorescence was observed. Sorting of green fluorescent lymphocytes allowed for selection of engineered cells. In conclusion, we demonstrate the utility of vGFPTKfus as a suicide/reporter transgene in tumor cells in vitro and in vivo. Furthermore, its potential use as an analytical and therapeutic tool targeting human T lymphocytes is shown.