脂联素影响骨骼肌胰岛素抵抗模型中葡萄糖转运蛋白4表达的研究

目的：通过建立骨骼肌L6细胞胰岛素抵抗模型,探讨骨骼肌L6细胞中脂联素（ APN）的分泌,以及脂联素对骨骼肌胰岛素抵抗模型中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达的影响。方法（1）体外培养大鼠L6成肌细胞,诱导分化后,给予不同浓度的棕榈酸（PA）,测定不同时间细胞培养上清液葡萄糖浓度,观察PA对L6细胞摄取葡萄糖的影响,建立胰岛素抵抗模型;（2）根据实验条件的不同分为三组：NC组（正常对照组,即骨骼肌L6细胞组）;IR组（胰岛素抵抗模型组）;IR＋PIO组（胰岛素抵抗模型＋吡格列酮组）。应用Western blot方法分别测定上述三组APN和GLUT4表达水平。结果（1）0．4 mmol· L^-1的棕榈酸在作用12、24、36 h以及0．6～0．8 mmol· L^-1棕榈酸作用8～36 h后,细胞培养上清液中葡萄糖含量,明显高于对照组。胰岛素抵抗模型建立;（2）Western blot结果显示：①与NC组比较,IR组APN和GLUT4表达均减少,差异有统计学意义;②与IR组比较,IR＋PIO组其APN和GLUT4表达均增加,差异有统计学意义。结论（1）大鼠L6成肌细胞培养并诱导分化后,经过一定条件下PA刺激,可以建立胰岛素抵抗模型;（2）大鼠L6细胞可分泌和表达脂联素,骨骼肌源性脂联素上调L6细胞GLUT4的表达;（3）吡格列酮作为PPAR-γ激动剂,可增加大鼠L6细胞脂联素的分泌,进而改善胰岛素敏感性。     

过表达KLF4对棕榈酸所致L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响

目的探讨Krtippel样因子4（KLF4）过表达对大鼠L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响。方法采用棕榈酸诱导法建立大鼠IJ6骨骼肌细胞的胰岛素抵抗模型,随机分为对照组和转染组。对照组转染腺病毒空载体（Ad）,转染组转染KLF4腺病毒表达载体（Ad—KLF4）。采用Real—timePCR和Western—blot检测两组KLF4、胰岛素受体（IR）和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达水平,采用葡萄糖氧化酶法检测两组培养液中的葡萄糖浓度。结果与对照组比较,棕榈酸诱导组对葡萄糖的摄取量显著降低（P〈0．05）,KLF4、IR、GLUT4表达显著下调（P〈0．05）。KLF4过表达可显著提高细胞对胰岛素的敏感性,并上调IR、GLUT4表达。结论过表达KLF4可导致IR、GLUT4表达上调,并改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。     

p38 MAPK及其抑制剂在胰岛素调节GLUT4活性中的作用

目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及其抑制剂SB203580在胰岛素调节葡萄糖转运子4(GLUT4)活性机制中的作用。方法:分别测定胰岛素和SB203580孵育条件下骨骼肌细胞p38 MAPK的磷酸化水平和活性;检测p38 MAPK或SB203580是否与GLUT4直接结合;并测定SB203580对光化学标记细胞膜上的GLUT4的影响。结果:与胰岛素孵育0min时相比,100nmol/L胰岛素使p38 MAPK磷酸化水平增加,最大值为0min时的(2.43±0.21)倍;胰岛素还使p38α和p38βMAPK的活性分别增加了(10.13±0.48)和(7.92±2.17)倍;SB203580可抑制胰岛素的作用;p38 MAPK在体内不与GLUT4直接结合;SB203580仅抑制胰岛素刺激下的GLUT4光化学标记。结论:p38MAPK或SB203580不直接与GLUT4结合;对SB203580敏感的分子参与了胰岛素调节GLUT4活性的作用。     

胰岛素抵抗骨骼肌细胞中P-Ser473PKB及糖原合成酶-3表达

目的探讨棕榈酸(PA)诱导的胰岛素抵抗(IR)骨骼肌细胞中P-Ser473PKB及糖原合成酶(GSK)-3的表达。方法培养大鼠骨骼肌细胞,免疫荧光鉴定原代大鼠骨骼肌细胞;设立对照组、PA组(0.6mmol/L PA),在细胞培养6、122、4 h后,胰岛素刺激15 min,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联(GOD-POD)法测定培养液中葡萄糖的浓度;Western blot检测P-Ser473PKB及P-Ser21/9GSK-3α/β的蛋白表达。结果 90%以上的肌细胞-αsarcometric actin单克隆抗体染色呈阳性,证明培养的为骨骼肌细胞;培养24 h后,PA组培养液中葡萄糖浓度高于对照组,P-Ser473PKB蛋白水平低于对照组,而P-Ser21/9GSK-3α/β高于对照组(P值均<0.05)。结论 PA作用下,胰岛素刺激的骨骼肌细胞对葡萄糖的处理能力下降,即PA可诱导骨骼肌细胞产生胰岛素抵抗,其机制可能与P-Ser473PKB蛋白表达下调,P-Ser21/9GSK-3α/β表达增加有关。     

晚期糖基化终产物对心肌细胞葡萄糖转运蛋白1表达的影响及机制研究

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对心肌细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)表达的影响,以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在此过程中的作用。方法采用酶消化法原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立胰岛素抵抗模型,给予不同干预,用实时定量聚合酶链反应(real-Time PCR)和蛋白印迹方法检测m RNA及GLUT1和p38MAPK的蛋白表达水平。结果胰岛素抵抗心肌细胞有GLU1表达,其中对照组与BSA组GLU1表达比较差异无统计学意义(P>0.05),糖化白蛋白AGE-BSA可诱导其GLU1表达降低,AGE-BSA组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但在阻断p38MAPK途径后表达量明显上升(P<0.05),对照组与BSA组比较,p38MAPK磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05),AGE-BSA可导致p38MAPK磷酸化的增加,AGE-BSA组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论糖基化终产物AGEs可诱导胰岛素抵抗心肌细胞GLUT1 mRNA和蛋白表达降低,此过程与p38-MAPK磷酸化增加有关。     

JNK在棕榈酸致骨骼肌细胞胰岛素抵抗中的作用

目的:探讨棕榈酸造成L6GLUT4myc骨骼肌细胞胰岛素抵抗过程中c-JunN-末端激酶(JNK)所起的作用。方法:将L6GLUT4myc成肌细胞培养于24孔和6孔培养板中,随机分为溶剂组和棕榈酸组,分别用0.3mmol/L的棕榈酸盐和溶剂牛血清白蛋白(BSA)孵育16h,在棕榈酸组的后30min加入JNK的抑制剂,于胰岛素刺激前后用酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞膜上GLUT4myc的含量,免疫印迹法测定蛋白激酶B(Akt)、JNK和胰岛素受体底物1(IRS1)的磷酸化。结果:与溶剂组相比,棕榈酸组中胰岛素增加的GLUT4myc水平的倍数和Akt的磷酸化降低(P<0.05);JNK和IRS1的丝氨酸位点S307的磷酸化水平变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:棕榈酸导致L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的机制可能不涉及JNK,或JNK的作用很小。     

非诺贝特及罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞p38MAPK信号通路调控影响

目的：探讨非诺贝特及罗格列酮对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞（MC）p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号传导通路的影响。方法：大鼠系膜细胞分别培养在正常糖浓度（5．5mmol／L）、高糖浓度（25mmol／L）、25mmol／L葡萄糖＋非诺贝特（FB）100μmol／L及25mmol／L葡萄糖＋罗格列酮（RG）20μmol／L。ELISA法检测培养细胞上清液Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）;Phospho—ELISA法检测胞浆及胞核内p38MAPK和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）蛋白的表达：以及RT-PCR法检测p38MAPK的mRNA的表达。结果：与正常对照组比较,高糖组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ、FN增多;胞浆及胞核内P—p38MAPK的表达增加。非诺贝特及罗格列酮干预能使高糖培养系膜细胞合成Col-Ⅳ、FN显著减少,胞核内p-p38MAPK表达显著下调,但对胞浆内p-p38MAPK的表达则无显著影响。各组总p38MAPK蛋白水平及p38MAPK的mRNA表达则没有明显改变。结论：非诺贝特及罗格列酮能够显著下调高糖培养的Mc核内p38MAPK信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成。     

普伐他汀对高糖培养肾小球系膜细胞P38促分裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的探讨普伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(MC)p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号传导通路的影响。方法大鼠MC分别培养在正常糖5.5mmol·L-1(正常对照组),高糖25mmol·L-1(高糖组),葡萄糖25mmo.lL-1+p38MAPK特异性抑制剂SB203580(SB)10μmol.L-1,及葡萄糖25mmol·L-1+普伐他汀(PV)100μmol·L-1。ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤连蛋白(FN)含量;Phospho-ELISA法检测胞浆及胞核内p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白的表达;以及RT-PCR法检测p38MAPK mRNA的表达。结果与正常对照组比较,高糖组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ,FN增多;胞浆及胞核内p-p38MAPK的表达增加。SB或PV干预能部分或完全逆转这一变化。与高糖组比较,SB干预后,上清液中Col-Ⅳ含量下降〔48h:(21.19±3.21)vs(16.75±1.93)μg·L-1,n=6,P<0.05〕、FN减少〔48h:(13.47±1.27)vs(12.01±0.85)μg·L-1,n=6,P<0.05〕;胞浆及胞核内p-p38MAPK表达显著下调。PV干预后,上清液中Col-Ⅳ含量下降〔48h:(21.19±3.21)vs(14.97±3.04)μg·L-1,n=6,P<0.05〕、FN减少〔48h:(13.57±1.27)vs(11.99±0.98)μg·L-1,n=6,P<0.05〕;胞核内p-p38MAPK表达显著下调,但对胞浆内p-p38MAPK的表达则无显著影响。各组总p38MAPK蛋白水平及p38MAPK mRNA表达则没有明显改变。结论PV能够显著下调高糖培养的MC胞核内p38MAPK信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成,达到对糖尿病肾病的治疗作用。     

依达拉奉抗单肺通气患者炎性反应时的p38丝裂原活化蛋白激酶表达

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路在依达拉奉抗单肺通气患者炎性反应中的作用。方法择期拟行肺叶切除术肺癌患者40例,随机分为两组,每组20例。常规麻醉诱导后,依达拉奉组给予依达拉奉0.5 mg·kg-1加入氯化钠注射液100 m L,静脉滴注;对照组给予等容量氯化钠注射液。两组麻醉维持用药相同,均在麻醉后切皮前(T1)、膨肺后60 min(T2)、术后1 h(T3)测定血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)浓度和磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、p38 MAPK表达水平,以p-p38 MAPK/p38 MAPK反映p38 MAPK激活程度。结果两组手术时间、单肺通气时间均无显著差异(P>0.05),围手术期血流动力学平稳。与T1时比较,两组T2、T3时TNF-α、IL-6血浆浓度和p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平及p38 MAPK激活程度均上升(P<0.05);依达拉奉组TNF-α、IL-6血浆浓度和p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平及p38 MAPK激活程度均低于对照组(P<0.05)。结论依达拉奉可抑制机体TNF-α和IL-6的生成和释放,p38 MAPK信号通路参与了其抗单肺通气患者炎症反应过程。     

黄连素通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶/葡萄糖转运蛋白4信号途径改善胰岛素抵抗的机制研究

目的研究黄连素对胰岛素抵抗细胞3T3-L1细胞磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRNA和蛋白表达的影响,探讨黄连素改善胰岛素抵抗的分子机制。方法将3T3-L1脂肪细胞随机分为正常对照组、胰岛素抵抗、黄连素3组,应用地塞米松诱导细胞胰岛素抵抗,黄连素组同时加入黄连素。以葡萄糖氧化酶法测定3组细胞上清液中葡萄糖消耗量,观察黄连素对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响;应用免疫印迹技术(Western blotting)技术测定脂肪细胞AKT和GLUT4的蛋白水平变化;应用实时荧光定量PCR技术检测脂肪细胞AKT和GLUT4的mRNA表达变化。结果与正常对照组相比,胰岛素抵抗组的AKT和GLUT4 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05),经黄连素干预后,AKT和GLUT4 mRNA和蛋白表达水平有一定升高,但仍显著低于正常对照组(P<0.05)。结论黄连素通过上调AKT基因和蛋白的表达进而增加GLUT4的水平,改善胰岛素抵抗状态。     

氟伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞CTGF mRNA的影响及其作用机制的研究

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的表达以及HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀对其的影响及作用机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,实验分为4组：低糖组（LG组,5.5 mmol/L葡萄糖）;低糖＋甘露醇组（LG＋M组,5.5 mmol/L葡萄糖＋24.5 mmol/L甘露醇）;高糖组（HG组,30 mmol/L葡萄糖）;高糖＋氟伐他汀组（HG＋Flu组,30 mmol/L葡萄糖＋10μmol/L氟伐他汀）。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测CTGF和纤维粘连蛋白（FN）mRNA的表达,Western印迹检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）及其下游因子cAMP反应元件结合蛋白1（p-CREB1）。结果与LG＋M组相比,HG组系膜细胞增殖明显,p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,CTGF和FN mRNA的表达增加。与HG组比较,HG＋Flu组可抑制系膜细胞增殖,p-p38 MAPK、p-CREB1的表达明显下调,CTGF和FN mRNA的表达降低。结论高糖状态下肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达增强,p-p38 MAPK和p-CREB1表达明显升高,氟伐他汀抑制肾小球系膜细胞CTGF mRNA和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK及其下游核因子CREB1的激活而实现。     

缬沙坦对高糖培养的肾小球系膜细胞p38MAPK传导通路的影响

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、其上游因子MAPK激酶3/6(MKK3/6)和下游因子cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)的表达以及血管紧张素受体1拮抗剂(AT1Ra)缬沙坦的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和缬沙坦干预,采用Western bolt检测MKK3/6、p38 MAPK和CREB1及其磷酸化蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测系膜细胞内TGF-β1和FN mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中纤维连接蛋白(FN)和IV型胶原的含量。MTT法检测缬沙坦在不同时间、不同药物浓度对细胞增殖状态的影响。结果①与低糖对照组相比,高糖组系膜细胞p-p38 MAPK、p-MKK3/6和p-CREB1表达明显上调,TGF-β1和FN mRNA的表达增加,FN和IV型胶原含量增加。②缬沙坦组p-p38 MAPK、p-MKK3/6和p-CREB1的表达明显下调,TGF-β1和FN mRNA的表达降低,同时FN和IV型胶原的含量减少。③MTT法检测显示不同浓度的缬沙坦对细胞增殖状态都有所抑制,并随药物浓度的增加而作用增强。结论缬沙坦抑制肾小球系膜细胞TGF-β1的表达和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK传导通路的激活来实现的。     

唑来膦酸盐通过p38 MAPK信号通路调控高糖微环境下成骨细胞分化

目的 探讨唑来膦酸盐（ZOL）对高糖微环境下小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路的调节作用。方法 体外培养MC3T3-E1细胞并分为低糖（LG）组、LG+ZOL组、高糖（HG）组、HG+ZOL组。ZOL为0.1μmol/L,LG、HG的葡萄糖浓度分别为5.5 mmol/L和16.5 mmol/L。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖水平;鬼笔环肽染色观察细胞骨架;试剂盒检测细胞碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色检测细胞矿化结节生成情况;免疫荧光法检测Wnt5a、p38 MAPK的荧光表达强度。另设HG+ZOL+p38 MAPK通路抑制剂（SB203580）组,SB203580为10μmol/L。Western blot检测5组细胞中Wnt5a、p38 MAPK、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、骨形态发生蛋白2(BMP2)和Ⅰ型胶原蛋白（COLⅠ）的表达水平。结果 4组细胞增殖水平差异无统计学意义（P>0.05）。与LG组比较,LG+ZOL组细胞骨架清晰程度,ALP活性,茜素红矿化结节生成,W...     

p38MAPK在戊地昔布诱导Eca109细胞凋亡中的调控作用

目的探讨p38MAPK信号转导途径在戊地昔布诱导食管癌Eca109细胞凋亡中的调控作用。方法将正常培养的人食管癌Eca109细胞随机分为正常对照组、戊地昔布组和戊地昔布+SB203580组;采用流式细胞术和DNA Ladder检测凋亡情况;RT-PCR检测p38mRNA的表达变化;流式细胞术和免疫细胞化学检测p38蛋白的表达变化。结果①戊地昔布能够诱导Eca109细胞发生凋亡,并呈剂量依赖性,而SB203580能够部分降低戊地昔布诱导的Eca109细胞的凋亡率;②戊地昔布能够上调Eca109细胞中p38mRNA和蛋白的表达,而戊地昔布+SB203580组p38mRNA和蛋白的表达下降;③p38蛋白表达与凋亡率呈正相关。结论戊地昔布能够通过部分激活p38MAPK信号途径诱导Eca109细胞发生凋亡。     

β-蜕皮甾酮对高糖诱导的大鼠成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响

目的 探讨β-蜕皮甾酮对高糖诱导的大鼠成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响及分子机制.方法 将大鼠成骨细胞随机分为空白组(5.5 mmol·L-1葡萄糖)、模型组(25 mmol·L-1葡萄糖)、低、中、高剂量实验组(1,5,25μmol·L-1β-蜕皮甾酮+25 mmol·L-1葡萄糖)、p38 MAPK激活组(10μmo...     

西红花酸对AGEs诱导血管内皮细胞通透性增加的抑制作用

目的研究西红花酸对晚期糖基化终产物(advancedglycation end products,AGEs)诱导血管内皮细胞通透性增加的抑制作用并探讨其机制。方法用不同剂量西红花酸(0.01、0.1、1μmol.L-1)预孵牛主动脉血管内皮细胞(bo-vine vascular endothelial cells,BECs)12 h后,AGEs(100μg.L-1)刺激内皮细胞,以HRP作示踪剂检测内皮细胞单层通透性变化,ELISA法测定细胞上清MCP-1和TNF-α水平,罗丹明-鬼笔环肽荧光染色检测细胞骨架蛋白F-actin变化,Cell-based ELISA法和液闪法分别测定磷酸化p38 MAPK蛋白表达量和活性变化。同时设定正常对照组(control)、AGEs(100 mg.L-1)模型组和葛根素(1 g.L-1)阳性对照组。结果与AGEs模型照组相比,西红花酸(0.1、1μmol.L-1)预孵细胞后,F-actin骨架蛋白破环程度有所减轻,细胞单层通透性减小(P<0.01或0.05),TNF-α和MCP-1分泌降低,磷酸化p38MAPK的数量下降且活性被抑制(P<0.01或0.05)。结论西红花酸对AGEs诱导内皮细胞通透性增加有抑制作用,该作用可能与其抑制p38MAPK通路有关,这可能是其抗糖尿病血管病变的机制之一。     

2型糖尿病大鼠模型GLUT4 mRNA表达的研究

目的：研究葡萄糖转运体4（GLUT4）mRNA表达在2型糖尿病胰岛素抵抗中的分子机制。方法：采用高脂高糖饲养，一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备2型糖尿病大鼠模型。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析大鼠骨骼肌、心肌和脂肪组织中GLUT4 mRNA的表达量变化与差别。结果：正常对照组和2型糖尿病大鼠模型组GLUT4 mRNA在骨骼肌中有相对较高表达，在心肌中表达次之，在脂肪组织中表达相对偏低。2型糖尿病大鼠模型组骨骼肌中GLUT4 mRNA表达量只有对照组骨骼肌的48％、心肌的44％、脂肪组织的38％。结论：GLUT4 mRNA表达量下降导致骨骼肌、心肌和脂肪组织对葡萄糖摄取利用减少是胰岛素抵抗的重要分子基础，是诱发2型糖尿病原因之一。