Zfx在小鼠睾丸生精细胞中的表达

目的:了解Zfx基因在各级生精细胞中的表达情况。方法:本试验采集6、8、17日龄和成年小鼠睾丸,采用组合酶消化法制备单细胞悬液,BSA铺设密度梯度法分离生精细胞,运用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)及Western印迹法(WB)方法检测Zfx基因的表达。结果:组合酶消化法制备单细胞悬液、BSA铺设密度梯度法可获得纯度>85%的各级生精细胞;Zfx基因在原始A型精原细胞、A型精原细胞、B型精原细胞中表达水平低,前细线期精母细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞中表达量高,长形精子、成熟精子不表达。结论:Zfx基因在各级生精细胞中呈现阶段性表达,可能是参与调控生精细胞减数分裂的重要转录因子。     

受体激素水平对未成熟睾丸移植物中生精细胞的生长发育影响

目的 采用已建立的未成熟睾丸组织异体异位移植模型,研究受体小鼠激素水平变化对未成熟睾丸组织移植物生长发育的影响.方法 以免疫缺陷小鼠为受体,将新生1～2d龄昆明小鼠睾丸移植到受体小鼠背部皮下.在移植后不同阶段取出移植物,进行组织形态学观察,分析移植物中生精细胞的发育情况,同时采用放射免疫分析法检测受体动物血清中睾酮(T)、促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平,并以同龄正常昆明小鼠作对照.结果 受体小鼠血清中LH水平没有明显波动,而T和FSH浓度在移植的前8周呈逐渐上升趋势,从9周以后开始下降,且显著低于正常受体内睾酮和FSH浓度,与组织学中所观察到的生精上皮受损程度的增加是同步的.结论 以上结果提示,应注意获取移植物中精子的最佳时间.对于小鼠来说,从新生小鼠睾丸移植物中获取精子的最佳时间是术后5-8周.     

异体异位发育小鼠睾丸组织中精子功能相关基因和蛋白的表达研究

目的:采用已建立的未成熟睾丸组织移植模型,研究异体异位生长发育的小鼠睾丸组织中精子功能相关基因Asrgl1,Gpx4,Asp,Prdx4和Spa17及其相关蛋白GPX-4和PRX-Ⅳ的表达,以迸一步评估该移植模型在生殖医学中应用的可行性.方法:以1～2 d小鼠睾丸组织为供体,7～12周雄性免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植;移植8周后收取移植物组织,采用荧光定量PCR法检测移植物中Asrgl1,Opx4,Asp,Prdx4和Spa17的表达情况,并与正常小鼠睾丸组织进行对比;同时采用Western blot检测GPX-4和PRX-Ⅳ 2种蛋白的表达情况.结果:基因检测显示,5种受试基因在移植物中的表达与8周正常小鼠睾丸组织相比均有下调;蛋白分析提示,GPX-4和PRX-Ⅳ 2种蛋白在8周正常小鼠睾丸组织中表达而在小鼠睾丸组织移植物中表达缺陷.结论:几种主要在精子运动、精子顶体形成及精子的受精功能中发挥作用的基因和蛋白在移植物中表达下调及缺失提示,异体异位睾丸组织移植在临床应用的可行性还需进一步评估     

受体性别及完整性对睾丸组织移植物发育的影响

目的以免疫缺陷小鼠为受体,探讨受体的性别及完整性对未成熟睾丸组织移植物生长发育的影响。方法将作为受体的免疫缺陷小鼠分为4组:雄性正常组、雄性去势组、雌性正常组和雌性去势组。移植供体组织均为新生1～2d的昆明小鼠睾丸,移植部位为受体背部皮下。移植7周后取材,计算移植物的回收率并称重,对各组移植物中生精小管结构和生精细胞的组成情况以及生精细胞的染色体进行观察分析。结果移植7周后,从4组受体中获得的移植物体积和重量与移植前相比均有明显增加。染色体观察显示,所有4组移植物中生精细胞染色体数量均为正常2倍体(40条)和单倍体(20条);HE染色结果显示,所有4组受体取出的移植物中均发现带有长形精子的生精小管,其中雄性正常组、雄性去势组、雌性正常组和雌性去势组分别有1、5、1和3只受体中观察到含有长形精子的生精小管。结论新生昆明小鼠睾丸组织分别移植到去势的、未去势的雄性和雌性免疫缺陷小鼠背部7周后,未成熟的生精细胞均可发育成为长形精子。     

生精障碍BALB/c小鼠睾丸组织的体外培养研究

目的:探寻生精障碍小鼠睾丸组织生精能力的体外发育与成熟方法。方法:8周龄BALB/c雄性小鼠68只,随机分为4组,每组17只。对照组为正常同龄BALB/c雄性小鼠睾丸组织,实验组分别采用注射40 mg/kg白消安后第4周睾丸组织为SCOS组,第6周睾丸组织为重度H-S(H-S1)组,第8周睾丸组织为轻度H-S(H-S2)组。琼脂糖凝胶法体外培养3种生精障碍小鼠睾丸组织及对照组睾丸组织至第4周,通过免疫组化检测减数分裂过程中标记蛋白[减数分裂启动:维甲酸诱导蛋白8(STRA8);减数分裂中:联会复合蛋白3(SCP3);减数分裂后:转换蛋白1(TNP1)]的表达情况,判断体外培养过程中生殖细胞的发育与成熟能力; TUNEL法检测培养前后生殖细胞凋亡情况。结果:①培养前与对照组相比,睾丸组织损伤越严重其STRA8的表达越少(P0.05);随着培养时间的延长,在培养4周后3个实验组中STRA8的表达呈上升趋势(P0.05)。②培养前与对照组相比,SCOS组SCP3表达最少、H-S2表达最多(P0.05);培养4周后SCP3表达增加,但仍未达到对照组表达水平,且损伤越严重,表达越少;③培养4周后TNP1在对照组有阳性表达,H-S1、H-S2组可见个别阳性表达(P0.05),SCOS组无表达。④与培养前相比,培养4周后SCOS组凋亡增加,H-S组凋亡减少(P0.05)。结论:琼脂糖凝胶体外培养可以诱导生精障碍的BALB/c小鼠睾丸组织进行减数分裂,生精功能损伤较轻者的体外培养效果好。     

中药生精冲剂对生精障碍小鼠治疗作用的实验研究

目的:研究生精冲剂对环磷酰胺所致生精障碍小鼠的治疗作用。方法:46只雄性昆明小鼠随机分为正常组(n=10)、模型组(n=12)、对照组(n=12)和中药组(n=12),后3组腹腔注射环磷酰胺,建立生精障碍模型。造模完成后,中药组和对照组分别灌胃中药生精冲剂[16 g/(kg.d)]和克罗米芬[21.6 mg/(kg.d)],正常组与模型组每天灌胃等量生理盐水,连续15 d。次日,测量睾丸重量,并计算睾丸指数;放射免疫法测定血清FSH、LH、T水平;对睾丸组织进行组织学观察。结果:中药组小鼠血清T[(7.046±0.291)nmol/L]、FSH[(2.947±0.587)mIU/ml]、LH[(3.254±0.492)mIU/ml]、睾丸指数[(3.958±0.342)g/kg]与模型组各检测值相比[(6.231±0.317)nmol/L、(5.428±0.719)mIU/ml、(5.155±0.460)mIU/ml、(3.525±0.462)g/kg]差异有显著性(P<0.05)。组织学观察中药组睾丸生精小管生精细胞层数及管腔内精子数明显高于模型组。结论:生精冲剂治疗小鼠生精障碍有效。     

冷冻保存未成熟睾丸组织移植后生精细胞的生长发育木

目的采用睾丸组织移植模型,探讨通过简单易行的冷冻保存程序保存未成熟睾丸组织,并使冷冻后的组织恢复生精过程的可能性,为该动物模型应用在保存雄性生殖细胞、帮助癌症患者保存生殖能力以及保存濒危物种等方面提供进一步的实验依据。方法用DMEM培养基加入二甲基亚砜配制冷冻保存液,将新生1～2d昆明小鼠睾丸组织按分步冷冻的方法进行冷冻,最终放入-80℃超低温冰箱中保存起来。2周后取出冻存的睾丸组织,移植到雄性去势免疫缺陷小鼠背部皮下,分别于移植后4周、5周和8周取材,制作HE染色切片,观察移植物中生精小管结构和生精细胞的组成,并与新鲜移植的睾丸组织进行对比分析。结果采用实验中的冷冻程序保存的新生小鼠睾丸组织,在冷冻保存一段时间后再移植,其表现与新鲜睾丸组织移植相同,其中末成熟的生精细胞可以在受体中继续生长发育,并完成整个生精过程,发育成为精子。结论本实验中所采用的睾丸组织冷冻保存方法具有不需特殊设备、简便易行、适用范围广泛等优点,适用于多种场合中生精细胞的冷冻保存。     

睾丸移植物间质细胞4种基因的表达分析

目的 研究新生小鼠睾丸组织异体异位移植后,4种在睾丸间质细胞中起重要作用的基因表达情况,为异体异位睾丸组织移植模型用于科研及临床的可行性提供进一步实验数据.方法 将162只1～2d昆明小鼠的睾丸移植到54只7～12w去势雄性免疫缺陷小鼠背部;在移植后9个时间段(3d和1～8w)取出移植物;选取4种在睾丸间质细胞中表达或高表达的基因3β -hsd、1hr、p450scc和star,采用聚合酶链反应,对发育不同阶段移植物中4种基因的表达情况进行分析,并与正常小鼠相应各年龄段睾丸中的基因表达情况相比较.结果 在9个时间段取出的移植物中,所测定4种基因的表达趋势与在正常小鼠睾丸中所见基本相同.结论 新生小鼠睾丸组织异体异位移植到免疫缺陷小鼠体内后,间质细胞4种受试基因的表达趋势与在正常小鼠中的表现基本相同.     

睾丸体积与睾丸生精状态的相关性分析

对103例男性不育患者的睾丸体积与睾丸活检进行对比分析。睾丸活检按光镜下曲细精管中精子发生状态分为轻、中、重度生精障碍,轻度25例,中度45例、重度33例。其睾丸体积分别为13.38±5.13ml,9.09±3.85ml,6.57±3.71ml。三组间睾丸体积有非常显著差异（P<0.01）。表明睾丸体积与睾丸生精状态密切相关。因此,在体检中测定睾丸体积可以迅速判断男性的生殖状态。     

睾丸移植物中支持细胞相关基因和蛋白表达的研究

目的 研究新生小鼠睾丸组织异体异位移植后,几种在睾丸支持细胞中起重要作用的基因和蛋白表达情况,为异体异位睾丸组织移植模型用于科研及临床的可行性提供进一步实验数据.方法 将162只1～2d昆明小鼠的睾丸移植到54只7～12周去势雄性免疫缺陷小鼠背部;在移植后9个时间段(3d和1～8周)取出移植物;选取4种在睾丸支持细胞中表达或高表达的基因abp、amh、vim和clu,采用聚合酶链反应,对发育不同阶段移植物中4种基因的表达情况进行分析,并与正常小鼠相应各年龄段睾丸中的基因表达相比较;同时采用免疫组织化学方法对支持细胞的GATA-4蛋白在移植物组织中的表达量及分布情况进行分析.结果 在9个时间段取出的移植物中,所测定4种基因的表达趋势与在正常小鼠睾丸中所见基本相同;免疫组化结果显示,4周和8周移植物支持细胞中GATA-4蛋白呈高表达,与在正常小鼠睾丸组织支持细胞中的表达基本一致.结论 新生小鼠睾丸组织异体异位移植到免疫缺陷小鼠体内后,支持细胞的发育在组织形态学以及几种受试基因的表达趋势和蛋白的表达情况与在正常小鼠中的表现基本相同.     

青春期营养性肥胖大鼠睾丸生精细胞周期的变化

目的探讨青春期营养性肥胖大鼠的睾丸生精细胞周期的变化。方法80只新生的雄性清洁级SD大鼠随机分为两组,对照组(n=32只)喂普通饲料,肥胖组(n=48只)喂高脂饲料,分别于喂养后的第3、4、5、6周末观察喂养后体重,计算Lee’s指数,流式细胞分析术检测睾丸生精细胞周期的改变。结果与对照组比较,肥胖组大鼠第3周开始体重有显著性增加(P<0.05),6周内体重持续上升,至第6周末肥胖组大鼠体重超过对照组达26.6%(P<0.01),Lee’s指数随着大鼠肥胖程度的增加而逐渐增高;大鼠G0/G1期细胞在高脂饲料喂养第3周末增多(P<0.05)、肥胖组S期细胞显著下降(P<0.01),此时处于G2/M期细胞的百分数明显增多(P<0.05)。结论青春期时的肥胖可以引起睾丸生精细胞S期细胞百分数逐渐减少,出现G2期细胞阻滞,细胞有丝分裂延迟。     

精子发生阻滞不育患者睾丸雌激素受体α的表达

目的:探讨雌激素受体α(ERα)在睾丸的表达与精子发生阻滞的关系。方法:用HE染色技术检查120例不育症患者睾丸活检标本,其中精子发生阻滞患者标本应用免疫组化法检查ERα的表达,并以10例健康人睾丸组织作为对照。结果:120例标本中符合精子发生阻滞病理诊断标准者有31例(占25.8%)。正常健康人睾丸组织中,ERα在睾丸支持细胞、类肌细胞和间质细胞的细胞核内表达,生精上皮细胞不表达;而在精子发生阻滞的睾丸组织中,ERα也在睾丸支持细胞、类肌细胞和间质细胞的细胞核内表达,但表达较弱,生精上皮细胞不表达。两者表达强度存在显著性差异(P<0.05)。结论:雄激素与雌激素通过各自的受体发挥协调作用而共同促进精子发生。精子发生阻滞可能与包括雄激素受体、ERα及热休克蛋白90在内的一系列复杂的细胞信号转导障碍有关。     

长期给予睾酮致大鼠生精小管伴有生精细胞排列疏松

目的:确定睾酮致大鼠睾丸内睾酮抑制因而精子发生障碍是否伴有生精细胞排列疏松。方法:成年雄性SD大鼠肌注十一酸睾酮[19 mg/(kg.15 d)]130 d后取睾丸组织块,作甲基丙烯酸树脂包埋切片,观察睾丸的组织学变化。结果:除精子形成、精子释放障碍等改变以外,11.5%的生精小管轮廓内生精细胞的排列明显较疏松,成串、成束或成团的生精细胞(主要是精母细胞和精子细胞)之间出现朝向小管腔走行的放射状裂隙。结论:生精细胞排列疏松是大鼠睾丸内睾酮抑制所致重要组织学改变之一。     

Expression of green fluorescent protein under beta-actin promoter in living spermatogenic cells of the mouse: stage-specific regulation by FSH

Spermatogenic cells from a mouse strain expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under chicken beta-actin promoter were studied under living conditions to analyse stage- and cell-specific expression and hormonal regulation of the transgene. The isolated seminiferous tubules were examined by transillumination and the live cell squashes by phase contrast and fluorescence microscopy. FSH effects were measured in whole seminiferous tubules comparing stages I-VI, VII-VIII and IX-XII of the cycle. Beta-actin was highly expressed in spermatogonia, but almost no expression was found at early meiosis (leptotene spermatocytes). A gradual increase in translation of beta-actin was found during later stages of meiosis and early spermiogenesis, with a maximum in elongating spermatids. FSH increased the translation of beta-actin after 4 h and 24 h of incubation at stages I-VI, after 24 h at stages VII-VIII but not at stages IX-XII of the cycle. The results support the view that beta-actin plays a role in the nuclear elongation of spermatids and that its expression is regulated by FSH in a stage-specific fashion. Techniques used in this study give us new insight to study temporal and hormonal regulation of gene products in living spermatogenic cells.     

Expression of cubilin in mouse testes and Leydig cells

Cubilin (cubn) is a receptor for vitamins and various protein ligands. Cubn lacks a transmembrane domain but anchors to apical membranes by forming complexes with Amnionless or Megalin. In an effort to better understand the uptake of nutrients in testis, we analysed cubn expression in the developing mice testes. In testes, cubn mRNA increased from birth to adulthood. In the inter‐stitium and isolated seminiferous tubules, neonatal increase in cubn mRNA until 14 days post‐partum (pp) was followed by a marked increase at puberty (28 days pp). Cubn was found in the gonocytes, spermatogonia, spermatocytes and spermatids in the developing testes. In adult testes, strong Cubn immunoreactivity was found in the elongating spermatids, suggesting the role of Cubn in endocytosis during early spermiogenesis. In Sertoli cells and peritubular cells, Cubn immunoreactivity was weak throughout the testis development. In the inter‐stitium, Cubn immunoreactivity was found in foetal Leydig cells, was weak to negligible in the stem cells and progenitor Leydig cells and was strong in immature and adult Leydig cells, demonstrating a positive association between Cubn and steroidogenic activity of Leydig cells. Collectively, these results suggest that Cubn may participate in the endocytotic uptake of nutrients in germ cells and somatic cells, supporting the spermatogenesis and steroidogenesis in mouse testes.