生长抑制DNA损伤基因45与p53对卵巢癌细胞凋亡作用的研究

目的：研究生长抑制ＤＮＡ损伤基因（ｇｒｏｗｔｈａｒｅｓｔａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅ,ＧＡＤＤ）对卵巢癌细胞的作用及与ｐ５３蛋白表达的关系。方法：利用ＲＴ－ＰＣＲ鉴定卵巢癌ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株ＧＡＤＤ４５的表达;采用ＲＴ－ＰＣＲ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株ｐ５３蛋白的表达。通过载体构建将目的基因ＧＡＤＤ４５重组于ｐｃＤＮＡ－Ⅲ真核质粒内。利用脂质体（ＤＯＴＡＰ）法转染ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株;Ｇ４１８抗性筛选,ＲＴ－ＰＣＲ进行表达鉴定。采用流式细胞仪分析（ＦＣＭ）以及ＤＮＡ梯度法对细胞凋亡现象进行检测。结果：卵巢癌ＳＫＯＶ３和３ＡＯ细胞株ＧＡＤＤ４５表达阴性。ＳＫＯＶ３细胞株ｐ５３蛋白表达阳性;３ＡＯ细胞株ｐ５３蛋白表达阴性。转染ＧＡＤＤ４５基因的ＳＫＯＶ３细胞株经化学药物足叶已甙（ＶＰ１６）和紫外线诱导后,可以使该细胞产生凋亡现象,而对转染ＧＡＤＤ４５基因的３ＡＯ细胞株经诱导后,未见细胞凋亡现象。结论：转染ＧＡＤＤ４５基因,对ｐ５３蛋白表达阳性的细胞株ＳＫＯＶ３经诱导后,可使细胞进入凋亡状态。对ｐ５３蛋白表达阴性的细胞株３ＡＯ转染ＧＡＤＤ４５基因后,经诱导细胞无凋亡现象,证实ＧＡＤ?     

Notch3及Notch基因细胞内区在卵巢上皮性癌组织中的表达及DAPT对卵巢上皮性癌细胞的作用

目的 了解卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中Notch3及Notch基因细胞内区(NICD)蛋白的表达水平及其临床意义,探讨γ分泌酶抑制剂--氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)对卵巢癌细胞系OVCAR3、A2780细胞的作用.方法 (1)选取2006年7月到2009年6月在北京大学第一医院因卵巢癌接受手术治疗且临床病理资料完整的患者共58例,选取同期因子宫肌瘤或子宫腺肌病及其他非卵巢病变行子宫全切除+双侧附件切除术者共21例作为对照,采用蛋白印迹法检测卵巢癌及正常卵巢组织中NICD蛋白的表达水平,免疫组化法检测卵巢癌及正常卵巢组织中Notch3蛋白的阳性表达率,并对不同临床病理特征的卵巢癌组织中NICD和Notch3蛋白表达进行比较.(2)体外培养卵巢癌OVCAR3、A2780细胞,加入不同浓度(分别为0.1、1、5、10μmol/L)的DAPT,设仅加溶剂二甲基亚砜(DMSO)者为空白对照,采用蛋白印迹法检测DAPT处理后卵巢癌OVCAR3、A2780细胞中NICD蛋白表达水平的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测卵巢癌细胞的生长情况,流式细胞仪检测细胞增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和细胞凋亡率的变化.结果 (1)卵巢癌、正常卵巢组织中Notch3蛋白的阳性表达率分别为78%(45/58)、24%(5/21),两者比较,差异有统计学意义(P<0.01).卵巢癌、正常卵巢组织中NICD蛋白的表达水平分别为1.64±0.19、0.98±0.20,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).卵巢癌组织中,NICD蛋白的表达水平,病理分化程度为低分化者(1.90±0.22)明显高于高～中分化者(1.25±0.21,P<0.05),手术病理分期为Ⅲ～Ⅳ期者(1.80±0.21)明显高于Ⅰ期者(1.21±0.15,P<0.05),而不同病理类型和是否行新辅助化疗间比较,差异则无统计学意义(P>0.05);Notch3蛋白的阳性表达率,不同病理类型、手术病理分期、病理分化程度及是否行新辅助化疗间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(2)DAPT(5 μmol/L)处理不同时间(分别为24、48、72 h)后,OVCAR3、A2780细胞中NICD蛋白的表达水平均明显低于空白对照(P<0.05).不同浓度(分别为0.1、1、5、10 μmol/L)的DAPT处理不同时间(分别为0、6、12、24、36、48、72 h)后,OVCAR3、A2780细胞的生长均明显受抑制,分别与空白对照比较,差异均有统计学意义(P<0.05).不同浓度(分别为0.1、1、5、10 μmol/L)的DAPT处理不同时间(分别为24、48、72 h)后,OVCAR3、A2780细胞的SPF、PI明显下降,细胞凋亡率明显升高,分别与空白对照比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且随着药物浓度的升高,出现这种作用的时间越早.结论 Notch3、NICD蛋白可能在卵巢癌的发生、发展中起一定的促进作用;DAPT能抑制卵巢癌细胞的增殖,促进卵巢癌细胞的凋亡,其机制可能与抑制NICD蛋白的生成有关.     

纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞SKOV3凋亡及细胞内Ca~(2+)浓度的影响

目的:观察纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞SKOV3凋亡的作用及其对细胞内钙离子浓度[Ca2+]i的影响。方法:纳秒级陡脉冲场强10kV/cm,脉宽100ns,频率1Hz,作用5min。SKOV3细胞经纳秒级陡脉冲作用后4h,用透射电子显微镜,流式细胞术检测细胞凋亡。以Fluo-3/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜检测纳秒级陡脉冲对SKOV3细胞[Ca2+]i的影响及[Ca2+]i变化时Ca2+的来源。结果:透射电子显微镜观察到典型的凋亡细胞形态。流式细胞术结果显示,纳秒级陡脉冲主要诱导细胞早期凋亡,早期凋亡率为(22.21±2.71)%,明显高于对照组的(3.04±0.44)%(P<0.01)。纳秒级陡脉冲可明显升高细胞[Ca2+]i(P<0.01),而与细胞外钙离子浓度无关(P>0.05)。结论:纳秒级陡脉冲能够诱导SKOV3细胞凋亡。细胞内钙释放引起钙离子升高,可能是纳秒级陡脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。     

维生素E琥珀酸酯诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡的研究

目的探讨维生素E琥珀酸酯(Vitamin E Succinate,VES)对人卵巢腺癌细胞系SKOV3的生物学效应及机制.方法依培养基中有无加VES,将培养的SKOV3细胞分为对照组和实验组,通过MTT比色法检测VES对该细胞系杀伤率的影响;通过光学显微镜、透射电镜观察及流式细胞仪分析检测凋亡;利用caspase-3荧光检测探讨VES作用、SKOV3细胞的作用机制.结果VES处理SKOV3细胞后,细胞存活率明显降低,光镜下见明显形态学改变,电镜下见各个时期的凋亡细胞,流式细胞仪测定发现典型的凋亡峰,活性caspase-3荧光强度增加.结论VES能诱导卵巢腺癌SKOV3凋亡并可能通过激活caspase家族实现.     

活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3分子的构建及其致卵巢上皮性癌细胞凋亡的实验研究

目的 构建能自我激活的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3分子,并探讨其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的致凋亡作用.方法利用基因重组技术构建活性caspase-3分子--rev-caspase-3及其重组腺病毒--Ad-rev-casp3;应用免疫组化方法、细胞计数试剂盒8、流式细胞仪和蛋白印迹法分别检测rev-caspase-3作用后卵巢癌细胞系AO细胞中活性caspae-3蛋白的表达情况、细胞存活率、凋亡率、细胞周期、caspase-3活性亚单位p17和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)的分解产物p85的表达水平,应用透射电镜观察rev-caspase-3作用后细胞的超微结构,实时PCR技术检测细胞中凋亡相关基因的表达情况;建立卵巢癌裸鼠皮下及腹腔移植瘤模型,观测rev-caspase-3作用后裸鼠生存情况及肿瘤体积的变化.结果 Ad-rev-casp3作用后的AO细胞中显著表达活性caspase-3蛋白,细胞质明显棕染;细胞中活性caspase-3亚单位p17和PARP裂解片段p85的表达水平升高.Ad-rev-casp3以感染复数(MOI)为70作用后的AO细胞存活率为30.3%,凋亡率为40.2%.Ad-rev-casp3以MOI=10作用后的细胞凋亡率只为3.4%,但此时S期细胞比例高达56.5%,G1期比例下降至9.8%,与未感染Ad-rev-casp3(MOI=0)的AO细胞的S期和G1期比例显著不同(P均＜0.05).Ad-rev-casp3作用后的AO细胞呈现显著的凋亡形态改变,电镜下见明显的凋亡小体形成;细胞中活性caspase-3基因的表达水平显著升高,为9.44.Ad-rev-casp3能显著延长荷瘤裸鼠的生存期,平均生存时间为(213±16)d,并显著抑制移植瘤的生长,在第1次注射后53 d时抑瘤率为70%.结论 表达rev-caspase-3的重组腺病毒载体对卵巢癌细胞有强烈的致凋亡作用,并可显著延长荷瘤裸鼠的生存期,抑制肿瘤生长.     

顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的研究

目的:研究顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的发生情况,并探讨可能的发生机制。方法:顺铂干预卵巢癌SKOV3细胞后,用MDC染色荧光显微镜观察自噬囊泡及流式细胞仪检测自噬率;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率及TUNEL法检测凋亡指数;Western blot检测自噬蛋白Beclin1,LC3-Ⅱ和凋亡蛋白caspase9,caspase3的表达。结果:顺铂干预SKOV3细胞后,MDC阳性细胞数明显增多;自噬率提高(P<0.05);凋亡率提高(P<0.05);凋亡指数提高(P<0.05);自噬蛋白Beclin1,LC3-Ⅱ和凋亡蛋白caspase9,caspase3表达均增强(P<0.05)。结论:顺铂不仅可诱导卵巢癌SK-OV3细胞凋亡,而且可诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬性死亡。     

The mechanism of anticancer activity of the new synthesized compound - 6,7-Methylenedioxy-4-(2,4-dimethoxyphenyl)quinolin −2(1H)-one(12e) in human ovarian cancer cell lines

ObjectiveOvarian cancer is the most lethal of the gynecologic malignancies. Most women have advanced disease at diagnosis and require extensive debulking surgery and aggressive chemotherapy. Induction of apoptosis in cancer cells has been used as an important approach for cancer therapy. We examined the anticancer effect of 6,7-methylenedioxy-4-(2,4-dimethoxyphenyl)quinolin-2(1H)-one (12e) in human ovarian cancer cell line.Materials and methodsThe 6,7-methylenedioxy-4- (2,4-dimethoxyphenyl) quinolin-2 (1H) -one (12e) was synthesized and provided by Dr. Li-Jiau Huang of China Medical University. Cell viability analysis showed that 12e inhibited cell growth and induced cell death in time- and dose-dependent manners. In order to study the underlying cell death mechanism, 2774 and SKOV3 cells treated with 12e were studied by morphology, DAPI/TUNEL double staining, DNA gel electrophoresis. To search the mechanisms of anti-proliferative effect of 12e, cell cycle analysis was performed. Changes in proteins related to cell death were analyzed by Western blot.Results12e significantly induced apoptosis evidenced by morphological changes, TUNEL-DAPI double-staining and DNA fragmentation. Western blot analysis demonstrated that the protein level of Bcl-2 was decreased after treatment with 12e, while the level of p53 and Bax was increased. 12e treatment resulted in G2/M arrest through down modulation of cyclin B1 and cdk1.ConclusionThese results suggested that 12e -induced growth inhibition was associated with cell cycle arrest and apoptosis.     

20(S)-人参皂苷Rg3对卵巢癌生长抑制作用的实验研究

目的探讨过敏性紫癜(HSP)患儿尿表皮生长因子(EGF)质量浓度检测及其对早期肾损害的诊断价值。 方法91例HSP患儿为山东省青岛市妇女儿童医疗保健中心2003 01—2004 12住院确诊患儿，采用双抗体夹心ELISA方法检测HSP患儿和30例正常对照组儿童的尿EGF和尿视黄醇结合蛋白(RBP)质量浓度，同时采用全自动特殊蛋白分析仪测定尿微量白蛋白(MA)质量浓度。 结果(1)HSP患儿尿EGF质量浓度\[(78.59±18.09)ng/mL\]明显高于正常对照组\[(29.30±13.92)ng/mL\]，差异有显著性(t值为13.64，P<0.01)。HSP各临床分型间比较发现紫癜肾型尿EGF质量浓度\[(98.31±17.68)ng/mL\]分别高于其它临床型：皮肤型\[(78.76±12.66)ng/mL\]、腹型\[(77.16±11.77)ng/mL\]、关节型\[(76.49±17.45)ng/mL\]、混合型\[(77.71±13.49)ng/mL\]，差异均有显著性意义(P均＜0.05)，而其余各临床分型间比较差异无显著性(P均＞0.05)。(2)HSP患儿尿MA质量浓度为(43.21±10.23)mg/L，明显高于正常对照组\[(6.41±2.86)mg/L\]，两者比较差异有显著性(t′=25.91，P<0.01)。(3)HSP患儿尿RBP质量浓度为(46.8±20.9)ng/mL，明显高于正常对照组\[(12.8±4.8)ng/mL\]，差异有显著性(t′=11.98，P<0.01)。(4)91例急性期受检患儿中尿常规异常者14例(15.38%)，尿MA升高者37例(61.67%)，尿RBP升高者45例(75%)，尿MA和(或)RBP升高者51例(85%)，尿EGF升高者84例(92.3%)，尿EGF阳性率与文献报道肾活检的相仿。 结论HSP患儿尿EGF、RBP、MA质量浓度均明显增高，EGF在HSP伴有肾损害者早期升高尤为明显，考虑EGF增高可能与HSP病理改变程度有关，因此，EGF增高可作为HSP早期肾损害的敏感指标之一。     

Genistein对人卵巢癌细胞系TC-1增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

目的:研究植物雌激素染料木黄酮(genistein)对人卵巢癌细胞系TC-1细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用,探讨其抗癌作用的机制。方法:应用MTT法检测不同浓度genistein对TC-1细胞的生长抑制作用,电镜观察药物作用后细胞超微结构的改变,流式细胞仪检测细胞周期、定量分析凋亡,DNA琼脂糖凝胶电泳法确定凋亡。结果:TC-1细胞经不同浓度genistein处理后,细胞生长明显受到抑制,且这种抑制作用呈时间及浓度依赖性,5mg/L和10mg/L genistein作用72h后,抑制率分别达到89·84%和97·99%。genistein阻断TC-1细胞生长于G2/M期,在G0/G1前出现典型的亚二倍体凋亡峰,且凋亡呈时间依赖性。电镜观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征。DNA凝胶电泳可观察到细胞凋亡特异的DNA梯形带。结论:genistein对TC-1细胞生长的抑制作用呈明显的时间及浓度依赖性,并诱导其发生凋亡。     

UHRF1基因在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达及意义

目的:探讨针对UHRF1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3后UHRF1表达的变化及细胞的增殖和凋亡,为UHRF1基因作为新的靶点治疗卵巢癌提供依据。方法:用siRNA基因沉默技术,将体外化学合成的针对UHRF1基因的siRNA转染至OVCAR-3细胞(转染组),并以转染阴性对照siRNA序列的细胞作为阴性对照组,未经转染的细胞作为空白组;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染前后细胞UHRF1 mRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8实验和流式细胞术分别检测沉默UHRF1基因后对细胞增殖和凋亡的影响。结果:实时荧光定量PCR结果显示,siRNA转染后UHRF1基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中表达显著降低(P<0.01)。Western blot结果显示,转染组、阴性对照组和空白组细胞UHRF1蛋白相对表达量分别为0.16±0.04、0.33±0.03、0.35±0.07;转染组细胞UHRF1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),而阴性对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。CCK-8实验结果显示,转染后48,72,96h,转染组细胞增殖率均显著低于空白组(P<0.01)。流式细胞术结果显示,转染组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(15.83±2.22)%、(7.46±2.93)%,差异显著(P<0.01)。结论:UHRF1基因沉默后可显著抑制卵巢癌OVCAR-3细胞UHRF1的表达,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

细胞周期同步化逆转卵巢癌对紫杉醇耐药的研究

目的:探讨卵巢癌对紫杉醇耐药的产生和细胞周期的相关性以及细胞周期同步化方法逆转卵巢癌对紫杉醇耐药的可能性。方法:化疗敏感的卵巢癌SKOV3,A2780细胞株和用脱氧胸腺嘧啶核苷(细胞周期S期同步化药物)处理相应的耐药细胞后更换普通培养基,8～10h后加入紫杉醇(100nmol/L),10～12h后撤出紫杉醇,设立不经同步化处理的细胞作对照,收集不同时间点细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:SK-OV3,A2780敏感和耐药组细胞经细胞周期同步化处理后加入紫杉醇其凋亡率敏感和耐药细胞均较对照组增高,以48h检测结果差异最显著。结论:细胞周期同步化方法有可能成为加强紫杉醇的作用效果以及逆转耐药性的有效方法。     

CO_2对人卵巢癌细胞SKOV3转移因子表达的影响

目的:探讨二氧化碳(CO_2)对卵巢恶性肿瘤细胞转移能力的影响。方法:体外培养人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞株,分为CO_2组、N_2组和对照组,分别在CO_2及N_2处理后2h,置于常规条件下培养12、24、48h通过RT-PCR和Western Blot检测不同时相血管内皮生长因子C(VEGF-C)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达。结果:CO_2处理后,SKOV3细胞VEGF-C和MMP9的mRNA和蛋白质表达显著增加(P＜0．05);N_2处理后,SKOV3细胞VEGF-C和MMP9的mRNA和蛋白质表达较对照组增加(P＜0．05)。结论:CO_2促进了SKOV3 VEGF-C和MMP9的表达,对SKOV3的转移能力有增强作用。     

NS398对人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3生长抑制作用的研究

目的 观察环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)选择性抑制剂——氮-2,环己氧-4,硝基苯-甲基磺胺(NS398),对人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAH3生长的抑制作用。方法 应用免疫组织化学(免疫组化)链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连接(SP)法,在蛋白水平,对人卵巢上皮浆液性癌细胞系CAOV3、OVCAR3的COX-2表达情况进行检测;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法,观察NS398对CAOV3、OVCAR3生长的抑制作用,并通过倒置相差显微镜及电子显微镜观察细胞形态学的变化;通过DNA梯形电泳和末端脱氧核苷转移酶(TdT)介导的脱氧尿嘧啶三磷酸(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)实验,对细胞凋亡情况进行检测。结果 CAOV3、OVCAR3的COX-2蛋白表达均为阳性。NS398对CAOV3、OVCAR3增殖的抑制率,均随着作用时间的延长和药物浓度的增加而增加。NS398作用后,CAOV3、OVCAR3细胞胞浆空泡化,可见凋亡小体,细胞表面的微绒毛消失。DNA梯形电泳显示特征性的梯形谱带,TUNEL实验可见凋亡细胞。结论 COX-2很可能成为卵巢癌化学药物治疗(化疗)的有效靶点,COX-2抑制剂——NS398有可能成为卵巢癌化疗的有效药物。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对人卵巢癌细胞株生长的影响

目的：了解粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ ＣＳＦ）对人卵巢癌细胞株生长的影响。方法：采用ＸＴＴ比色法及流式细胞仪检测ＧＭ ＣＳＦ对卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ３、３ＡＯ及ＣＡＯＶ３ 细胞生长的影响。结果：用ＸＴＴ法检测ＧＭ ＣＳＦ对ＳＫＯＶ３、３ＡＯ 及ＣＡＯＶ３ 细胞的生长均无明显影响;流式细胞仪检测也未发现ＧＭ ＣＳＦ对ＳＫＯＶ３、３ＡＯ及ＣＡＯＶ３细胞的增殖指数有明显影响。结论：在卵巢癌化疗过程中应用ＧＭ ＣＳＦ是比较安全的,对其潜在的促进肿瘤细胞增殖的顾虑也许是不必要的。     

卵巢上皮性癌淋巴道定向高转移细胞系的建立及其生物学特性的鉴定

目的筛选卵巢上皮性癌（卵巢癌）淋巴道定向高转移恶性肿瘤细胞亚群,并对其生物学特性进行鉴定。方法将卵巢癌细胞株SKOV3细胞接种于裸鼠爪垫皮下,待植入细胞在裸鼠体内成瘤并发生转移时,取其淋巴结转移灶中癌细胞再次接种于裸鼠爪垫皮下传代,每代均取出淋巴结转移灶中癌细胞进行培养,通过单细胞分离（克隆）培养或局部淋巴结转移灶筛选的方法建立连续传代细胞系,重复传3代后,通过裸鼠接种实验观察各代裸鼠的淋巴结转移率。利用细胞生长曲线、HE染色、染色体分析、流式细胞分析、裸鼠接种、免疫组化等方法鉴定各代细胞的生物学特性。结果所建立的连续传代1～3代的细胞系,分别命名为SKOV3-PM1、SKOV3-PM2和SKOV3-PM3细胞,癌细胞在裸鼠体内传3代后,裸鼠的淋巴结转移率为100％（10／10）,原代SKOV3细胞的淋巴结转移率为10％（1／10）,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;SKOV3-PM3细胞形成的淋巴结转移灶的数目（26／10）较SKOV3细胞多（1／10,P〈0．01）;且转移灶多位于淋巴结。细胞染色体分析显示,SKOV3细胞染色体数目大多数分布在83～89条,SKOV3-PM3细胞染色体数目大多数分布在91～105条。SKOV3与SKOV3-PM3细胞染色体数目比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;转移灶中上皮膜抗原（EMA）表达呈阳性,证实转移细胞株保持着卵巢癌细胞的生物学特性;SKOV3-PM3细胞倍增时间为22．7h,SKOV3细胞为49．6h,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞分析显示,SKOV3-PMl、SKOV3-PM2、SKOV3-PM3细胞的淋巴结转移灶中癌细胞的DNA合成期和分裂期细胞的比例分别为24．2％、29,4％和36．7％,明显高于SKOV3细胞的21．5％（P〈0．05）。结论本研究成功建立了卵巢癌淋巴道定向高转移细胞系,为研究卵巢癌的淋巴结浸润转移的发病机制提供了良好的实验材料。     

靶向调控的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3联合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂flavopiridol对卵巢上皮性癌的治疗作用

目的 观察人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统调控下表达活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3联合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂flavopiridol对卵巢上皮性癌(卵巢癌)的治疗作用.方法 应用活细胞计数法--细胞计数试剂盒8(CCK-8)、流式细胞仪和蛋白印迹法(western blot)检测AdHTVP2G5-rev-casp3联合flavopiridol作用后卵巢癌AO细胞的细胞存活率、凋亡率、细胞周期和细胞中活性caspase-3片段p17及其底物聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶的裂解片段p85的表达情况;观测AdHTVP2G5-rev-casp3联合flavopiridol治疗前后荷卵巢癌裸鼠生存情况、移植瘤体积、肝酶水平及各器官组织的病理检查结果.结果 AdHTVP2G5-rev-casp3[感染复数(MOI)=5～20]或flavopiridol(300 nmol/L)单独作用均不引起AO细胞的显著凋亡,凋亡率均＜11%;联合应用能产生显著的协同杀伤作用,当两者分别以MOI=20、300 nmol/L联合作用时,细胞存活率为11.6%,凋亡率为73.5%,该协同作用在AdHTVP2G5-rev-casp3感染细胞后72 h再加入flavopiridol作用48 h最为显著.低剂量(MOI=10)的AdHTVP2G5-rev-casp3能引起细胞的S期比例显著增高(62.5%).两者联合作用后的AO细胞中p17和p85的表达水平也显著高于两者单独作用时.单独应用AdHTVP2G5-rev-casp3或flavopiridol均可延长荷瘤裸鼠的生存时间[分别为(141±14)、(134±10)d]并抑制肿瘤生长(抑瘤率分别为30%、40%),但两者联合应用具有协同作用,裸鼠生存时间可达(286±6)d,抑瘤率为81%.两者联合应用后裸鼠的肝酶水平无显著升高,肝等各器官组织的HE染色病理检查未见异常.结论 低剂量的活性caspase-3可引起卵巢癌细胞在S期的募集,从而增强细胞对flavopiridol的敏感性;低剂量的活性caspase-3联合flavopiridol对卵巢癌细胞具有显著的协同杀伤作用,能显著抑制移植瘤的生长并延长荷瘤裸鼠的生存期,并降低flavopiridol对肝脏的毒性作用.     

艾迪注射液及联合应用化疗药物抑制人卵巢癌细胞株A2780增殖的研究

目的 :探讨艾迪注射液对人卵巢癌细胞株A2 780增殖的影响及与多种化疗药物的协同作用。方法 :采用MTT法测定艾迪注射液与 4种化疗药物单独及联用对A2 780细胞的增殖抑制作用 ,运用流式细胞仪测定艾迪注射液对A2 780细胞周期的影响及凋亡率。结果 :艾迪注射液可抑制A2 780细胞增殖 ,其抑制作用呈剂量和时间依赖性 ,并可诱导细胞凋亡。低浓度的艾迪注射液与化疗药物联用 ,可产生较强的抑制细胞增殖的作用。结论 :艾迪注射液具有直接抗肿瘤作用 ,对化疗药物协同作用的机制可能与其诱导细胞凋亡有关。     

卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC_3/PIX_3及OC_3/PIX_5的比较基因组杂交研究

目的:了解两种卵巢癌紫杉醇耐药株(OC3/PIX3及OC3/PIX5)和其亲代细胞紫杉醇敏感株(OC3)染色体DNA拷贝数的差异变化,探讨耐药细胞的分子遗传学改变。方法:运用比较基因组杂交(comparative genom ic hybrid ization,CGH)技术,将OC3/PIX3及OC3/PIX5与其亲代细胞株OC3的染色体基因组进行比较分析。结果:3种细胞株的染色体2pter-p21、3q、5p、9均有遗传物质表达增加;10号染色体表达增加仅见于OC3。染色体1,4,6的遗传物质在3种细胞株的表达均有减少。3p的减少发生在OC3和OC3/PIX5。仅在OC3细胞中见到7q、8p减少。OC3和OC3/PIX5出现染色体10q22过度扩增。最有意义的变化是OC3/PIX3细胞染色体2p22的过度扩增。结论:2p22拷贝数过度扩增可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。     

3-甲基腺嘌呤对顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡影响的研究

目的:探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对顺铂(DDP)诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响。方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞,用PI3K/Akt通路抑制剂3-MA预处理SKOV3细胞3h,再用DDP作用48h,经Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率,TUNEL法检测凋亡指数(AI),Western blot检测凋亡蛋白caspase3,caspase9的表达。结果:3-MA预处理后,DDP诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡率为(37.04±7.15)%,凋亡指数为58.0±5.20,而单用DDP组凋亡率为(10.46±0.65)%,凋亡指数为26.0±3.46。3-MA预处理后,DDP诱导的SKOV3细胞凋亡率和凋亡指数均较单用DDP组明显提高(P<0.05)。caspase3,caspase9蛋白的表达也明显增强。结论:3-MA可上调caspase3,caspase9蛋白的表达,通过内源性途经增强DDP促卵巢癌细胞SKOV3的凋亡活性。     

Inhibition of cell growth and induction of apoptosis in ovarian carcinoma cell lines CaOV3 and SKOV3 by natural withanolide Withaferin A

Objective

Withaferin A, a natural withanolide, has shown anti-cancer properties in various cancers including breast cancer, but its effects in ovarian cancer remain unexplored. Notch 1 and Notch3 are critically involved in ovarian cancer progression. We decided to examine the effects of Withaferin A in ovarian carcinoma cell lines and its molecular mechanism of action including its regulation of Notch.

Methods

The effects of Withaferin A were examined in CaOV3 and SKOV3 ovarian carcinoma cell lines using MTS assay, clonogenic assay, annexin V/propidium iodide flow cytometry, and cell cycle analysis. Western analysis was conducted to examine the molecular mechanisms of action.

Results

Withaferin A inhibited the growth and colony formation of CaOV3 and SKOV3 cells by inducing apoptosis and cell cycle arrest. These changes correlated with down-regulation of Notch1, Notch3, cdc25C, total and phosphorylated Akt, and bcl-2 proteins.

Conclusions

Withaferin A inhibits CaOV3 and SKOV3 ovarian carcinoma cell growth, at least in part by targeting Notch1 and Notch3.