重组pcDNA 3.0-WWOX构建对胆囊癌细胞表达及△Ψm的影响

目的体外构建及鉴定Pc DNA3.0-WWOX真核表达载体,探讨过表达WWOX对人胆囊癌细胞WWOXm RNA表达、蛋白表达及跨膜电位(△Ψm)的影响.方法提取人胆囊癌细胞总RNA,RT-PCR反应合成WWOX的c DNA,PCR产物回收纯化.目的基因WWOX和pc DNA3.0载体经限制性内切酶ECORⅠ和XhoⅠ酶切,将双酶切WWOX片段与pc DNA 3.0载体在T4 DNA连接酶的作用下进行连接重组.pc DNA 3.0-WWOX重组质粒转化后,提取质粒经双酶切鉴定及测序鉴定.将pc DNA 3.0-WWOX重组质粒转染人胆囊癌GBC-SD细胞,应用RT-PCR、Western Blot检测WWOX基因的表达水平、JC-1染色检测胆囊癌细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)变化.结果成功构建了pc DNA3.0-WWOX重组载体,经测序DNA序列与Gene Bank中WWOX序列一致.成功转染pc DNA3.0-WWOX重组质粒至胆囊癌GBC-SD细胞中.RT-PCR及Western blot结果显示:胆囊癌GBC-SD细胞转染pc DNA3.0-WWOX重组质粒48 h后pc DNA-3.0-WWOX组灰度比值明显高于各对照组(P<0.05),对照组间m RNA表达量差异无统计学意义(P>0.05).pc DNA3.0-WWOX组蛋白表达灰度比值均明显高于各对照组(P<0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05).pc DNA3.0-WWOX组细胞线粒体内绿色荧光信号较对照组增高(P<0.05),而对照组间细胞线粒体内绿色荧光信号差异无统计学意义(P>0.05).结论体外成功构建了Pc DNA3.0-WWOX重组载体,顺利进行了重组载体的转化和转染实验.靶向Pc DNA3.0-WWOX重组载体可有效抑制胆囊癌细胞WWOXm RNA降解,促进其蛋白的表达,同时有效促进细胞的早期凋亡.WWOX可能参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长.     

瘤内注射慢病毒载体介导的Bmi1-shRNA对A549皮下移植瘤的抑制作用

目的探讨瘤内注射慢病毒介导的原癌基因Bmi1的特异性短发夹RNA(Bmi1-shRNA)对人非小细胞肺癌免疫缺陷鼠皮下种植瘤生长的抑制作用。方法建立NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠人肺癌A549荷瘤模型,共27只,分为3组。其中治疗组移植瘤内注射含有Bmi1-shRNA的慢病毒载体,阴性对照组注射含有NC-shRNA的慢病毒载体,空白对照注射同剂量PBS。通过激光共聚焦观察移植瘤内绿色荧光蛋白(GFP)表达,RT-PCR、Western blot检测Bmi1mRNA、蛋白水平的表达,观察RNA干扰效果,测量肿瘤体积,计算肿瘤抑制率。结果将A549细胞移植到NOD/SCID鼠背部皮下,成瘤率为100%。激光共聚焦观察治疗组及阴性对照组皮下移植肿瘤组织中有GFP表达,而空白对照组未见GFP表达。治疗组NOD/SCID小鼠的肿瘤体积较阴性对照组和空白对照组显著缩小(P<0.05),肿瘤抑制率分别为52.9%和57.9%。Bmi1-shRNA治疗组中的Bmi1蛋白明显降低,相对空白对照组和阴性对照组,蛋白表达抑制率分别为51.1%、50.3%,差异有显著性(P<0.05)。结论利用慢病毒载体成功...     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤性的研究进展

目的探讨人端粒酶催化亚单位(h TERT)启动子及巨细胞病毒原核(CMV)增强子联合调控胸苷激酶基因增强型表达载体的改良构建及其在杀伤鼻咽癌细胞中的效应与安全性评价。方法对链接h TERT启动子及CMV增强子、胸苷激酶基因进行酶切(模板为p GL3空载体),以构建增强型表达载体;选取h TERT启动子单调控胸苷激酶基因的表达载体作为对照组。另选用人鼻咽癌细胞(端粒酶阳性,实验组)、人乳腺癌细胞(对照组)及正常人脐静脉内皮细胞(端粒酶阴性)为标本,分别对其采用荧光显微镜观察荧光蛋白表达、聚合酶链式反应(PCR)检测胸苷激酶基因m RNA的表达、Telochaser法检测细胞端粒酶活性,同时分析鼻咽癌细胞增殖及抑制受增强型载体的影响作用。结果 h TERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控,可以成功改良构建;通过荧光显微镜下观察显示人鼻咽癌细胞和人乳腺癌细胞均有荧光表达,但后者较前者在表达数量及强度方面有所加强,且对照组的人乳腺癌细胞亦有荧光表达存在,但ECV-304细胞无荧光表达。在PCR定量检测方面,结果显示增强型载体组(实验组)的胸苷激酶基因m RNA的表达量显著强于对照组的单启动载体(P0.05)。在细胞端粒酶活性方面,ECV-304细胞为阴性,肿瘤细胞端粒酶活性均为阳性。四甲基偶氮唑蓝(MMT)检测结果显示,增强型载体组可明显抑制鼻咽癌细胞的体外增殖,其细胞存活率较对照组显著降低(P0.05)。动物体内实验结果显示改良重建的增强型载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用(抑瘤率为56.5%),显著高于单启动子载体组(抑瘤率为43.3%)(P0.05);实验组与其他对照组抑瘤率比较差异均有统计学意义(P0.05)。实验组裸鼠肝肾病理检查显示,肝、肾组织结构正常,均无明显损害。结论以h TERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控,成功改良构建后能够靶向及高效地杀伤鼻咽癌细胞及体外移植瘤,且应用后在动物模型体内未见明显的毒副反应。     

RNA干扰对胆囊癌细胞上皮细胞黏附因子表达的影响

目的:观察RNA干扰(RNAi)对胆囊癌GBC-SD细胞株中上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)表达的抑制作用。方法:针对EP-CAM基因的不同位点构建4个miRNA重组质粒。经DNA测序后,用LipofectamineTM2000介导转染人胆囊癌GBC-SD细胞株,48 h后用RT-PCR和Western blot检测EP-CAM的mRNA和蛋白的表达变化情况。结果:经测序分析证实,靶向EP-CAM的4个miRNA重组质粒均构建成功。RT-PCR及Western Blot技术显示,4个重组质粒均不同程度地抑制靶基因EP-CAM的表达。结论:针对人EP-CAM基因的miRNA表达载体能有效地下调GBC-SD细胞中EP-CAMmRNA及蛋白的表达。     

反义血管内皮生长因子(VEGF)转染体内抑制胆囊癌VEGF及其受体表达的研究

目的:探讨Oligofectamine介导的血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)转染对人胆囊癌GBC-SD细胞裸鼠移植瘤的生长及VEGF、Flt-1和KDR表达的影响。方法:通过裸鼠皮下接种体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型,并将裸鼠分为对照组(A组)、VEGF SODN Oligifectamine组(B组)和VEGF ASODN Oligifectamine组(C组),各组裸鼠在接种后24h内,在接种部位皮下分别缓慢注射200μl磷酸缓冲液(PBS)、VEGF SODN100μg Oligofectamine0.5μl(总体积为200μl)及VEGF ASODN100μg Oligofectamine0.5μl(总体积为200μl),每3天1次,连续治疗5周,观察各组裸鼠的成瘤性、体积及瘤重的变化,并运用免疫组化技术检测胆囊癌裸鼠移植瘤中VEGF、Flt-1和KDR的表达变化。结果:A、B、C组裸鼠2周时的成瘤率分别为87.5%、87.5%和37.5%,C组显著低于A、B组(P<0.05),5周时各组的成瘤率均为100%。各组裸鼠移植瘤5周时的体积和瘤重分别为:A组(253.49±27.11)mm3和(1.96±0.17)g,B组(255.84±26.51)mm3和(1.86±0.21)g,C组(125.45±17.49)mm3和(0.97±0.13)g,C组显著低于A、B组(P<0.05),C组的抑瘤率为(50.79±9.19)%。A、B组裸鼠移植瘤VEGF、Flt-1和KDR的表达均无统计学差异(P>0.05),而C组裸鼠移植瘤VEGF、Flt-1和KDR的表达较A、B组明显减弱(P<0.05)。结论:VEGF ASODN在体内能显著抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的增殖,降低其在裸鼠体内的成瘤性,抑制VEGF、Flt-1和KDR在蛋白水平的表达,抑制裸鼠移植瘤的生长及血管的形成。     

miR-3662在胆囊癌组织中的表达及对胆囊癌细胞增殖的影响

目的探讨miR-3662在胆囊癌组织中的表达及对胆囊癌细胞增殖的影响。方法选取30对人胆囊癌组织及其癌旁组织标本;将GBC-SD和SGC-996细胞分为miR-3662组和miR-NC组,其中miR-3662组细胞转染miR-3662,miR-NC细胞转染miR-NC;将8只裸鼠随机分为实验组和阴性对照组,每组4只,其中实验组裸鼠接种miR-3662组细胞,阴性对照组裸鼠接种miR-NC组细胞。采用qRT-PCR法检测miR-3662在30对人胆囊癌组织及癌旁组织中的相对表达量;采用CCK-8法检测转染细胞的吸光度（A）值、平板克隆形成实验观察细胞集落形成数、制取裸鼠皮下移植瘤检测瘤体质量。结果miR-3662在人胆囊癌组织中的相对表达量明显低于癌旁组织（P＜0.05）;miR-3662组GBC-SD和SGC-996的miR-3662的相对表达量较miR-NC组均明显上调（均P＜0.05）;加入CCK-8后第5天时,与miR-NC组相比,miR-3662组细胞A450值明显为小（P＜0.05）;miR-3662组GBC-SD和SGC-996的集落形成数较miR-NC组均明显减少（均P＜0.05）;实验组的裸鼠皮下移植瘤体质量较阴性对照组明显减少（P＜0.05）。结论miR-3662在人胆囊癌组织中低表达,能够抑制人胆囊癌细胞的增殖能力,可能作为胆囊癌治疗的新靶点。     

RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C表达的影响

目的:观察RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的影响.方法:将转染VEGF-C小分子干扰RNA(siRNA)载体质粒(HX1、HX2和HX3)的EC9706细胞分别注射于裸鼠皮下,以转染无关序列和正常EC9706细胞为对照,SPF环境饲养4周后处死,取移植瘤组织,分别采用RT-PCR和免疫组化SP法检测VEGF-C mRNA和蛋白的表达.结果:5组移植瘤体积、质量及VEGF-C蛋白和mRNA相对表达量差异均有统计学意义(F分别为3.372、3.948、7.621和8.916,P均<0.05).与正常细胞对照组和无关序列组相比,HX1、HX2及HX3转染组移植瘤组织中VEGF-C蛋门及mRNA表达明显降低(P<0.01).结论:VEGF-C siRNA能有效抑制裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF-C mRNA及蛋白的表达.     

慢病毒载体介导siRNA沉默Id-1通过ERK1/2信号通路抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长

目的 构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默Id-1,观察其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其对ERK1/2信号通路的影响。 方法 构建合成特异性针对Id-1基因的siRNA慢病毒载体,转染肝癌HepG2细胞系,经半定量RT-PCR鉴定筛选沉默效果最佳的细胞系,于倒置荧光显微镜(×400)下观察转染前后细胞的形态学变化。取细胞浓度为5×10⁶ mL^-1的干扰效率最佳的稳定转染细胞系、稳定转染空载体病毒细胞系及正常HepG2细胞系悬液各0.2 mL,分别注射到转染实验组、阴性对照组及空白对照组的裸鼠右腋皮下,每周测量肿瘤体积及裸鼠体质量,绘制肿瘤生长曲线,28 d后处死裸鼠,制作肿瘤组织标本,行常规病理检查,采用半定量RT-PCR及Western-blot方法检测肿瘤组织Id-1,ERK1/2的mRNA和蛋白的表达水平及p-ERK1/2的蛋白表达水平。 结果 倒置荧光显微镜显示,转染前后细胞形态学变化不明显。经半定量RT-PCR筛选出Id-1基因的siRNA慢病毒载体的最佳细胞系为sh31,与稳定转染空载体病毒细胞系相比,目的基因Id-1的表达降低了80%以上,与未干扰的HepG2细胞相比降低了60%; 转染细胞皮下接种后,转染组最终瘤体大小明显小于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。半定量RT-PCR显示,转染组肿瘤组织的Id-1及ERK1/2 mRNA分别为(0.389±0.058)及(0.475±0.079),均明显低于阴性对照组[(0.845±0.113),(0.977±0.082)]和空白对照组[(0.917±0.083),(0.978±0.056)](均为P<0.05)。Western-blot检测显示,转染组的Id-1及p-ERK1/2蛋白均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。 结论 Id-1基因特异性siRNA的慢病毒表达载体通过靶向抑制Id-1的表达,明显抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,推测Id-1可能通过调节ERK1/2 MAPK信号通路参与肝癌的发生发展。     

Survivin siRNA对甲状腺乳头状癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响

目的探讨凋亡抑制基因Survivin的小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)对甲状腺乳头状癌细胞株K1裸鼠移植瘤血管生成的影响。方法将表达特异性Survivin si RNA序列的质粒载体,与表达无关序列si RNA的质粒载体分别转染K1细胞;G418筛选出稳定表达Survivin si RNA和表达无关序列si RNA的K1细胞,与未转染的K1细胞分别注射于裸鼠皮下,观察三组移植瘤的生长速度。SP免疫组化法检测各组移植瘤中的微血管密度(MVD)。结果 Survivin si RNA组比无关序列si RNA组肿瘤平均质量减少56%,比未转染组肿瘤平均质量减少63%;Survivin si RNA组MVD明显低于无关序列si RNA组及未转染组(P<0.05);无关序列si RNA组与未转染组MVD值差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Survivin si RNA可抑制甲状腺乳头状癌细胞K1裸鼠移植瘤的微血管生成及肿瘤生长。     

yrdC靶向RNA干扰抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤的实验研究

目的检测胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达yrdC靶向RNA干扰的重组腺病毒,转染人胃癌细胞株BGC-823,检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化,转染后细胞移植裸鼠体内成瘤,观察yrdC沉默后移植瘤生长的变化。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法,检测7例胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达针对人yrdC的si RNA的重组腺病毒,重组腺病毒Ad-shyrdC转染BGC-823细胞,Western blot检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化。裸鼠分3组,分别皮下移植转染Ad-shyrdC、空病毒Ad-Null及未转染的BGC-823细胞（1&#215;107/只）,5周后检测裸鼠肿瘤的体积及质量,肿瘤HE染色及yrdC、PCNA、TUNEL免疫组化染色,观察各组yrdC蛋白表达、细胞增殖能力及细胞凋亡的变化。结果胃癌组织中yrdC mRNA及蛋白表达量均比癌旁组织增高。成功构建表达抑制yrdC基因的重组腺病毒Ad-shyrdC,腺病毒介导的yrdC靶向RNA干扰能特异性抑制BGC-823中yrdC蛋白的表达,Ad-shyrdC组肿瘤细胞yrdC蛋白水平明显下降。转染BGC-823细胞后移植裸鼠体内,5周后成瘤体积及质量较Ad-Null组及PBS对照组明显减小（P〈0.05）;yrdC蛋白表达减少,PCNA染色提示肿瘤细胞增殖活性受抑,TUNEL染色显示凋亡明显增多（P〈0.01）。结论腺病毒介导的RNA干扰能有效抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤,yrdC基因有可能成为胃癌基因治疗的靶点。     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌移植瘤组织中Hpa基因表达的影响

目的:应用RNAi技术沉默肝素酶(heparanase,Hpa)基因,探讨其对人食管癌裸鼠移植瘤组织中Hpa基因表达的影响.方法:①先转染后成瘤:采用浓度为15 μmol/L体外合成的Hpa小分子干扰RNA(siRNA)转染EC9706细胞72 h,另设无关序列组及空白对照组.然后将转染后的EC9706细胞种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤,待瘤体长至足够大时,取瘤组织;②先成瘤后转染:构建裸鼠食管癌移植瘤模型,待肿瘤长出1周后,依每次3 μg/只腹腔注射siRNA及无关序列,连续3 d,另1组仅注射PBS作空白对照,然后取瘤组织.采用免疫组化及原位杂交技术观察各组瘤组织中肝素酶蛋白及mRNA的表达.结果:无论是先转染后成瘤组还是先成瘤后转染组siRNA均可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,与无关序列组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:应用RNAi技术沉默Hpa基因可以有效下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,为临床防治食管癌浸润转移奠定了一定的理论基础.     

RNA干扰survivin基因对Eca-109细胞体内增殖的影响

目的利用RNA干扰抑制Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin沉默后对食管癌细胞Eca-109体内增殖的影响。方法构建靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染Eca-109细胞,建立稳定转染干扰组细胞Eca-109/si-survivin;同法建立阴性对照组细胞Eca-109/si-control,并以Eca-109为空白对照组细胞;通过Western blot检测survivin基因沉默效果;借助裸鼠移植瘤模型分析survivin干扰前后裸鼠成瘤时间及瘤结节质量的改变,比较各组Eca-109细胞的体内增殖速度;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术法检测移植瘤细胞凋亡的变化。结果干扰组细胞survivin蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组细胞survivin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠平均瘤结节质量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠的平均瘤结节质量差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的体内增殖。     

CAPN1对胆囊癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的检测钙蛋白酶1(CAPN1)在胆囊癌(GBC)组织中的表达水平,探究其对人GBC细胞系(GBC-SD)增殖、侵袭及转移的影响。方法采用免疫组化法检测GBC组织、癌旁组织、正常胆囊组织中CAPN1蛋白表达水平,分析其与GBC患者临床病理参数的关系。体外培养GBC-SD细胞和正常胆囊上皮细胞,将GBC-SD细胞分为CAPN1-si RNA组、阴性对照组和空白对照组,病毒感染72 h后,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)技术检测细胞中CAPN1 m RNA及蛋白表达水平,CKK-8法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果 GBC组织、癌旁组织、正常组织中CAPN1阳性表达率比较,差异有统计学意义(P0.05)。不同TNM分期、病理分化和有无远处转移的GBC患者CAPN1阳性表达率比较,差异有统计学意义(P0.05)。GBCSD细胞中CAPN1 m RNA及蛋白水平显著高于正常胆囊上皮细胞(P0.05),感染CAPN1-si RNA后,GBC-SD细胞中CAPN1 m RNA及蛋白表达显著下调(P0.05)。与空白及阴性对照组比较,si RNA组GBC-SD细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著下降(P0.05)。结论 CAPN1在GBC组织中高表达,CAPN1沉默可抑制GBC细胞的增殖、迁移及侵袭,可能作为潜在生物靶标应用于GBC基因治疗。     

脆性位点基因WWOX调控人胆囊癌细胞的体外增殖效应

［摘要］目的　探讨脆性基因WWOX调控胆囊癌细胞的增殖效应及其机制．方法　将前期成功构建的pcDNA3.0-WWOX重组质粒按脂质体介导转染GBC-SD细胞,同时转染空载体、脂质体为阴性对照及GBC-SD为空白对照．转染48 h后采用倒置显微镜观察各组胆囊癌细胞形态学变化,MTT、BrdU检测胆囊癌细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞增值周期的变化．结果　倒置显微镜观察pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞数量明显减少,悬浮细胞及细胞碎片增加,而Vector control、NC、Mock组细胞呈正常增殖状态．MTT检测显示pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞增殖于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,并随时间推移,pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性抑制明显．BrdU检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖率为（0.44±0.03）,对照组分别为（0.78±0.02）,（0.81±0.01）,（0.85±0.01）,表明pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性较对照组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）．细胞周期检测发现pcDNA3.0-WWOX组G0 /G1期细胞增多,G2 /M 期和S 期细胞减少,细胞凋亡率较对照组（Vector control,NC,Mock）明显增高、增殖指数下降（P＜0.05）,而对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）．结论　过表达WWOX基因体外可有效抑制胆囊癌细胞增殖活性, WWOX可能参与胆囊癌细胞恶性生物学行为的发展过程,有望成为胆囊癌基因治疗新的潜在靶点．     

共干扰Hpa、EP-CAM对人胆囊癌细胞株裸鼠模型的实验研究

目的:研究miRNA转染乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)和上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)对胆囊癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤作用.方法:通过脂质体转染法将含Hpa、EP-CAM的真核表达质粒分别及共同转染至人胆囊癌细胞株GBC-SD,MTT法检测体...     

hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对HeLa裸鼠移植瘤生长抑制的作用

目的:探讨hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对宫颈癌HeLa裸鼠皮下移植瘤生长抑制的作用. 方法:将含有hTERT启动子的TRAIL基因载体转染宫颈癌细胞HeLa,检测稳定转染细胞中GFP/TRAIL的表达;实验裸鼠分为基因组,化疗组,放疗组,综合组(基因 放化疗),对照组,每组5只,未转染HeLa组为对照组,不作任何处理;将稳定转染基因载体及未转染的HeLa细胞种植于裸鼠背部皮下,联合放化疗,来观察移植瘤成瘤情况,移植瘤的体积、质量以及质量抑制率的变化. 结果:转染hTERT-TRAIL细胞中GFP/TRAIL(绿色荧光蛋白)表达率高于对照组,有统计学意义 (P＜0.01);各组裸鼠在接种细胞第5～7日全部长出肿瘤小结节,结节出现的时间差异无统计学意义(P＞0.05);转染hTERT -TRAIL细胞与对照组HeLa细胞裸鼠的移植瘤质量相比差异有统计学意义(P＜0.05); hTERT -TRAIL细胞在裸鼠体内所形成的移植瘤生长较慢, 4 wk后肿瘤质量抑制率为43.08%,联合放化疗后肿瘤质量抑制率为61.63%,有统计学意义(P＜0.01). 结论:hTERT启动子驱动的TRAIL对人宫颈癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,联合放化疗能抑制裸鼠移植瘤的生长. 基因治疗联合放化疗等多途径综合治疗为以后的肿瘤研究和临床治疗提供思路.     

KISS-1对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用

目的探讨KISS-1基因对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响。方法通过脂质体介导将pc DNA3.1-KISS-1转染人胃癌细胞BGC-823,用Western blot检测转染前后KISS-1蛋白的表达。将转染pc DNA3.1-KISS-1的BGC-823细胞(转基因组)、转染空质粒的BGC-823细胞(空质粒转染组)和单纯BGC-823细胞(对照组)分别接种于BALB/C裸鼠,构建裸鼠胃癌移植瘤模型,测量肿瘤体积和瘤质量,并绘制肿瘤生长曲线;采用免疫组织化学法和半定量反转录-聚合酶链反应检测肿瘤组织中KISS-1蛋白和mRNA的表达。结果 KISS-1基因成功转入胃癌BGC-823细胞,转基因组KISS-1蛋白的表达较空质粒转染组和对照组显著增加(P<0.05);与空质粒转染组和对照组比较,转基因组裸鼠肿瘤生长速度显著减慢、肿瘤体积显著减小,瘤体质量显著减轻(P<0.05)。结论通过基因转染的方法能表达有活性的KISS-1,并能抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长。     

RNA干扰Heparanase基因表达对胆囊癌侵袭性影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术沉默人胆囊癌GBC-SD细胞中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因的表达,探讨抑制HPA基因后对GBC-SD细胞侵袭性的影响.方法:构建靶向人HPA基因miRNA重组质粒,采用脂质体转染法将质粒转染入人胆囊癌GBC-SD细胞,RT-PCR检测转染前后HPA mRNA表达情况,选出对HP...     

鼻咽癌靶向肽修饰的rES对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响

【摘要】 目的 探讨鼻咽癌靶向肽（NTP）修饰的重组人血管内皮抑素（rES）对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响,为鼻咽癌的靶向治疗提供新思路。 方法 合成pET-28a-rES与pET-28a-rES NTP质粒,并通过大肠杆菌表达系统制备rES与rES-NTP重组蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（WB）鉴定重组蛋白。建立人鼻咽癌CNE1细胞裸鼠移植瘤模型,酶联免疫吸附试验检测重组蛋白注射后不同时间点在肿瘤组织中的含量。将致瘤成功的裸鼠随机分为对照组、rES组、rES-NTP组3组,3组分别隔日尾静脉注射100 μL的生理盐水、rES重组蛋白（15 mg/kg）、rES-NTP重组蛋白（15 mg/kg）,共给药4周。测量移植瘤的体积与重量;免疫组织化学染色法检测移植瘤中CD31的表达;荧光定量PCR、WB检测移植瘤中VEGF、HIF-1ɑ-mRNA与蛋白质的表达。结果 rES与rES-NTP重组蛋白的理论分子量分别为22.48 kd、23.33 kd,经SDS-PAGE与WB鉴定正确。尾静脉注射后5 min、30 min、1 h、3 h、6 h时,rES-NTP组在肿瘤组织中的含量均高于rES组（P＜005）,而在注射后12 h时,两组差异无统计学意义（P＞0.05）。rES-NTP组移植瘤的体积和重量受到明显的抑制,低于对照组与rES组（P＜0.05）。rES-NTP组中的CD31、VEGF、HIF-1ɑ表达量均低于对照组与rES组（P＜0.05）。结论 rES-NTP重组蛋白具有较好的肿瘤靶向能力,能够有效抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长,抑制血管生成,下调VEGF及HIF-1ɑ表达。     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.