浅谈小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定

目的:通过实验验证表面黏附分子CD133是否可以作为干细胞标志物。并通过这个试验过程浅谈小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定。方法:在分选H446细胞(MACS方法)过程中得到CD133阳性(CD133+)细胞与CD133阴性(CD133-)细胞。对这两种细胞进行集落形成、自我更新、增殖分化、侵袭性、耐药性和成瘤性方面等项目的鉴定。结果:各种办法鉴定,发现两种细胞不存在差异。结论:分选小细胞肺癌H446细胞系中肿瘤干细胞方法中不能以表面黏附分子CD133为的标志物。     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。     

高/低侵袭转移性肺癌干细胞模型的建立

目的以人肺癌NCI-H446细胞为研究对象,建立一种高/低侵袭性肺癌干细胞(high/low invasion lung tumor stemcells,H/L-ILTSCs)模型,并鉴定其生物学特性。方法首先,利用transwell小室迁移实验分离高/低迁移性NCI-H446细胞。取高/低迁移性NCI-H446细胞采用transwell小室侵袭实验分离高/低侵袭转移性NCI-H446细胞。然后,以CD133、CD44为肺癌干细胞(lung tumor stem cells,LTSCs)表面标志,采用磁珠分选法分离NCI-H446细胞H/L-ILTSCs并进行纯度鉴定。最后,采用MTT法、transwell侵袭及免疫缺陷动物成瘤等实验,检测H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446细胞的生长增殖,体外侵袭转移及体内成瘤能力。结果 H-ILTSCs生长增殖,体外侵袭转移及体内成瘤能力均高于L-ILTSCs及NCI-H446细胞,而L-ILTSCs与NCI-H446无显著差别。结论人肺癌细胞NCI-H446中可以分离和富集H/L-ILTSCs,且二者存在着干性差别。     

人肝癌细胞系Huh-7中CD133+细胞的分离及鉴定

目的 通过表面标志分选法富集人肝癌Huh-7细胞中CD133+细胞,并初步鉴定其特性.方法 采用流式细胞分选技术从人肝癌细胞系Huh-7中分选出CD133+细胞,并进行干细胞比例分析;通过对CD133+细胞体外成球能力及增殖能力检测,考察CD133+细胞的自我更新能力;观察CD133+细胞在非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内的成瘤情况.结果 分选获得的CD133+细胞经无血清培养后阳性比例达90％以上;CD133+细胞体外无血清培养3d即可成球且生长速度较CD133-细胞快;CD133+细胞在NOD/SCID小鼠体内21 d左右即可形成异种移植瘤.结论 CD133+表面标志物分选方法可以高纯度富集CD133+细胞,利用CD133抗体分选获得的CD133+细胞具有肿瘤干细胞样特性.     

人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.     

CD105/CD133筛选鉴定SMMC-7721株干细胞表面标志物的实验研究

目的：观察人肝癌细胞株 SMMC-7721中膜抗原CD133、CD105的表达情况并对不同亚群的生物学性状进行体内外实验研究。方法以含10%胎牛血清的 DMEM 对SMMC-7721株细胞培养;采用流式细胞仪方法分选检测CD133、CD105在SMMC-7721中表达情况并分选出CD133+/CD105+、CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4个亚群;CCK-8和 Transwell侵袭实验分别检测4个亚群和未分选细胞组的增殖及侵袭能力,软琼脂克隆实验检测5组细胞成球能力;裸鼠成瘤实验了解 CD133+/CD105+、CD133-/CD105-亚群和未分选组的成瘤能力。结果流式细胞仪分选的 CD133+/CD105+、 CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4种细胞亚群的比例分别为1．61%、0．01%、97．88%和0．50%。 CD133+亚群的增殖和成球能力较 CD133-亚群及未分选细胞组强,而CD105+亚群侵袭能力较 CD105-亚群及未分选细胞组强。CD133+/CD105+组与CD133-/CD105-组及未分选细胞组相比成瘤所需的时间短、所需细胞数少、成瘤的体积大。结论 CD133在人肝癌细胞株 SMMC-7721中的表达与其增殖成球能力有关,CD105与其侵袭能力有关,CD133+/CD105+具有体内高度的成瘤能力。 CD133+/CD105+亚群在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中具有肿瘤干细胞特性。     

肺癌肿瘤干细胞研究新进展

自从小鼠非小细胞肺癌模型最初阶段分离到支气管肺泡干细胞(BASCs)后;陆续发现A549肺癌细胞株Holoclone型克隆集落存在不断自我更新的肿瘤干细胞,人肺腺癌中CD24+IDF-1R-细胞为BASCs样癌干细胞。研究表明,CD133分子、ABCG2可作为分选肺癌肿瘤干细胞细胞表面标志物,BMI-1基因过表达可能与肺癌肿瘤干细胞增殖相关。进一步发现侧群细胞细胞中存在肺癌干细胞。本文对肺癌肿瘤干细胞及相关研究进展予以综述。     

造血祖细胞对乳腺癌细胞生物学特性的影响

目的 分选CD133+造血祖细胞（CD133+ hemopoietic progenitor cell, CD133+ HPC），体外观察其对乳腺癌细胞生物学活性的影响，为肿瘤转移与治疗提供新的理论研究基础。方法 采用免疫磁珠分选技术分选脐带血CD133+ HPC，与人乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养，采用MTT、Transwell方法观察其对乳腺癌细胞增殖、黏附、侵袭活性的影响。结果 在体外培养的条件下CD133+ HPC可以显著促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、黏附、侵袭，差异具有统计学意义。讨论 CD133+ HPC可以提高肿瘤细胞的生长、黏附、侵袭活性，促进肿瘤的生长及转移，可能称为阻断肿瘤生长和转移的新的治疗靶点。     

Notch 1信号通路对人肝癌SMMC 7721细胞中CD133+细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究人肝癌SMMC 7721细胞中CD133+细胞的干细胞特性,初步探讨调控Notch 1信号通路对CD133+细胞亚群增殖和凋亡的影响.方法 流式分选和检测SMMC 7721细胞中的CD133+细胞.利用软琼脂集落实验及裸鼠成瘤实验验证CD133+细胞的干细胞特性.RT-PCR法检测CD133+细胞中Notch信号系统的表达;将分选出来的CD133+细胞分为激活组(加入Notch 1激活剂Jagged 1)、抑制组(加入Notch 1抑制剂DAPT)和空白对照组(加入PBS缓冲液),RT-PCR法检测3组细胞Hes-1基因的表达,MTT法和流式细胞仪检测各组细胞增殖能力和凋亡能力.结果 成功分选出CD133+亚群细胞;软琼脂集落实验和裸鼠成瘤实验表明CD133+细胞较CD133-细胞具有较强集落形成能力和体内成瘤能力;RT-PCR检测CD133+细胞中仅表达Notch 1/Jagged 1信号通路;激活组Hes-1表达强度增强,抑制组表达强度减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).MTT检测激活组、抑制组和空白对照组吸光度值差异均有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测激活组总凋亡率大于空白对照组,反之,抑制组总凋亡率小于空白对照组,各组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133+细胞是人肝癌SMMC 7721细胞中干细胞标志物之一,Notch 1信号通路对CD133+细胞的增殖和凋亡发挥着重要作用.     

CD44~+胃癌细胞的获取及其干细胞特性的初步鉴定

目的:肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在恶性疾病发生发展中起重要作用,且是肿瘤治疗失败的根源。胃癌细胞系中同样也存在着肿瘤干细胞。本研究目的是通过筛选人胃癌细胞系SGC-7901细胞中的CD44(+)肿瘤干细胞(CSCs)样细胞,然后对其干细胞特征进行初步鉴定。方法:磁珠分选术(MACS)从胃癌SGC-7901细胞中筛选出CD44(+)胃癌细胞,采用免疫荧光流式细胞术、球状体形成、软琼脂集落形成、FCM等实验对其干细胞特性进行初步鉴定。结果:1.免疫荧光流式细胞术分析结果显示,人胃癌SGC-7901细胞系中只有约2.4%的CD44(+)阳性细胞,经过MACS磁珠分选后,CD44(+)亚群的细胞阳性率可以提高到97.4%。将分选后CD44(+)和CD44(-)细胞接种到无血清培养基中观察球形体的形成,结果发现,CD44(+)细胞形成明显的球状体,CD44(-)细胞不形成球形体(P0.05)。将分选后CD44(+)和CD44(-)细胞接种到软琼脂中观察集落形成,发现CD44(+)细胞群有强大的增殖能力,形成集落大且数量多,而CD44(-)细胞群集落少且小(P0.05)。FCM分析显示:CD44(+)细胞G0/G1期百分率明显高于CD44(-)细胞(P0.05)。CD44(+)胃癌细胞比CD44(-)胃癌细胞具有更强的迁移能力。CD44(+)胃癌细胞的体外侵袭能力比CD44(-)细胞明显增强。结论:所获得的CD44+细胞具有胃癌干细胞特性,可作为今后胃癌干细胞研究的实验基础。     

CD133在人NSCLC组织和细胞系中表达的初步研究

目的观察经典的肿瘤干细胞标记分子CD133在人NCSLC组织和肺癌细胞系中的表达情况。方法用CD133多抗经免疫组化染色观察12例不同类型NSCLC组织中CD133的表达,经免疫荧光染色观察CD133在H446、SPC-A1肺癌细胞中的表达。用AC133单抗经流式和激光共聚焦观察人NSCLC组织、肺癌细胞系中糖基化CD133抗原(AC133抗原)的免疫活性。结果CD133多抗染色发现CD133在NSCLC组织、正常肺组织、H446细胞和SPC-A1细胞中普遍表达。AC133单抗染色发现不同类型NSCLC组织均有少量AC133( )细胞,而在H446、SPC-A1肺癌细胞及正常肺组织中未检测到AC133( )细胞。结论不同类型NSCLC组织中有少量的AC133( )细胞,为深入研究肺癌发生、发展的分子机制提供了新的靶点。     

Chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in laryngeal carcinoma

Background  Mounting evidence suggests that tumors are histologically heterogeneous and are maintained by a small population of tumor cells termed cancer stem cells. CD133 has been identified as a candidate marker of cancer stem cells in laryngeal carcinoma. This study aimed to analyze the chemoresistance of CD133⁺ cancer stem cells.

Methods  The response of Hep-2 cells to different chemotherapeutic agents was investigated and the expression of CD133 was studied. Fluorescence-activated cell sorting analysis was used to identify CD133, and the CD133⁺ subset of cells was separated and analyzed in colony formation assays, cell invasion assays, chemotherapy resistance studies, and analyzed for the expression of the drug resistance gene ABCG2.

Results  About 1%–2% of Hep-2 cells were CD133⁺ cells, and the CD133⁺ proportion was enriched by chemotherapy. CD133⁺ cancer stem cells exhibited higher potential for clonogenicity and invasion, and were more resistant to chemotherapy. This resistance was correlated with higher expression of ABCG2.

Conclusions  This study suggested that CD133⁺ cancer stem cells are more resistant to chemotherapy. The expression of ABCG2 could be partially responsible for this. Targeting this small population of CD133⁺ cancer stem cells could be a strategy to develop more effective treatments for laryngeal carcinoma.

     

HuH7细胞系CD13~+CD133~+HCC细胞分选及CSCs特性分析

目的探讨CD13、CD133双荧光标志流式细胞术(fluorescence activated cell sorter,FACS)分选人肝癌HuH7细胞系CD13+CD133+HCC细胞方法及癌干细胞(cancer stem cells,CSCs)特征。方法 CD13、CD133双标志,采用FACS从人肝癌HuH7细胞系分选出CD13+CD133+HCC、CD13+CD133-HCC、CD13-CD133+HCC、CD13-CD133-HCC等4种细胞亚群;通过CD13+CD133+HCC细胞生长曲线,细胞周期,形成肿瘤球和裸鼠体内成瘤能力,及对5-FU、吡柔比星化疗药物的敏感性研究,分析CD13+CD133+HCC细胞是否具有CSCs生物学特征。结果人肝癌HuH7细胞系CD13+CD133+HCC细胞占23.8%,3.1%分选为CD13+CD133+HCC细胞,78.45%的CD13+CD133+HCC细胞处于G0/G1期;CD13+CD133+HCC细胞增殖明显快于其他3个细胞亚群;在裸鼠103个CD13+CD133+HCC细胞就可以成瘤,而1.0×105个CD13-CD133-HCC只有2只成瘤(2/5),干细胞培养CD13+CD133+HCC细胞8～15 d形成肿瘤球;CD13+CD133+HCC细胞对5-FU和吡柔比星具有抵抗特性,而其他3个亚群较易于杀灭。结论 CD13、CD133双标志FACS从HuH7分选的CD13+CD133+HCC细胞具有CSCs特征,可能成为HCC治疗靶细胞。     

LY294002抑制小细胞肺癌干细胞样细胞自我更新

目的:研究Akt活性抑制剂LY294002抑制源自人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌球形成细胞即肺癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养NCI-H446细胞系细胞。以干细胞条件培养基用超低粘附6孔细胞培养板悬浮培养富集和扩增LCSLCs。裸鼠皮下成瘤实验鉴别LCSLCs高致瘤特性。Western blot分析LCSLCs中Akt蛋白磷酸化水平。肿瘤球形成试验检测LY294002对LCSLCs自我更新的影响。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6d,NCI-H446细胞系细胞呈三维非粘附性球体生长。LCSLCs具有高致瘤特性。与NCI-H446细胞系细胞比较,LCSLCs信号分子Akt组成性活化。LY294002有效降低LCSLCs中Akt磷酸化水平,并以剂量依赖方式抑制LCSLCs肺癌球形成(P<0.05)。结论:靶向干预小细胞肺癌LCSLCs信号分子Akt组成性活化可能成为抑制肺癌干细胞特性治疗小细胞肺癌的新策略。     

喉癌CD133+肿瘤干细胞与化疗抵抗

目的 筛选喉癌细胞中的CD133+细胞亚群,探讨其肿瘤干细胞特性及化疗抵抗性,并分析其原因。 方法 流式细胞仪检测Hep-2细胞经顺铂,氟尿嘧啶,紫杉醇作用后,CD133表达率的变化。采用流式细胞分选技术分离CD133+,CD133-细胞亚群,观察各亚群对上述药物的反应。采用软琼脂克隆形成实验检测各亚群的克隆形成能力,采用transwell小室体外侵袭实验,检测各亚群细胞的侵袭能力。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和western blot法,检测各亚群细胞中耐药基因ABCG2基因的表达。 结果：Hep-2细胞中CD133表达率为1-2%. 化疗药物作用后CD133+亚群被富集。CD133+细胞克隆形成率为(41.9±3.9%)显著高于CD133-细胞(11.7±1.6%), P<0.01。CDl33+细胞侵袭细胞数为(88±9.7)显著高于CD133-细胞（53±7.2）, P<0.01。CD133+细胞ABCG2的表达水平显著高于CD133-细胞。 结论： CDl33+喉癌细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性, CD133+喉癌肿瘤干细胞存在化疗抵抗,ABCG2的高表达是其中的主要原因。针对CD133+细胞的治疗势必会促进对喉癌治疗的进展。     

内皮细胞对结肠癌细胞系SW480中CD133~+细胞表达VEGF的影响

目的 从结肠癌细胞系SW480中分离结肠癌干细胞,并检测内皮细胞对这些细胞表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响.方法 分别利用免疫磁珠分选技术和尤血清培养法富集CD133+细胞,利用MTT法和平板克隆形成实验检测其生物学特性;采用细胞免疫荧光法检测SW480细胞和CD133+细胞中CD133及VEGF的表达;将SW480细胞或磁珠分选CD133+细胞分别在6种培养条件下进行培养:SW480细胞在含血清培养基(serum-supplied medium,SSM)中培养、SW480细胞在尤血清培养基(serum-free medium,SFM)中培养、磁珠分选CD133+细胞在SFM中培养、SW480细胞与内皮细胞在SSM中共培养、SW480细胞与内皮细胞在SFM共培养、磁珠分选CD133+细胞与内皮细胞在SFM共培养,利用免疫组织化学法检测不同培养条件下结肠癌细胞中CD133及VEGF的表达情况.结果 SW480细胞系中存在少量的CD133+细胞,这些细胞能够连续传代并且表现出更强的增殖潜力以及克隆形成能力.经细胞免疫荧光法检测发现SW480细胞高表达VEGF,低表达CD133,而免疫磁珠分选的CD133+细胞所形成的细胞球低表达VEGF,高表达CD133.无血清培养条件下的SW480细胞随着时间的延长CD133表达率逐渐增加,添加内皮细胞诱导后无血清培养的SW480细胞与前者相比CD133阳性率显著增加(P<0.05).经过1周的连续培养后,CD133+细胞表达VEGF的比例没有变化,添加内皮细胞诱导1周后,CD133+细胞表达VEGF的比例显著增加(P相似文献