一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA

目的 检测大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mPNA的表达.方法 根据大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针,完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应,再运用免疫组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达.结果 大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色,其他的组织细胞均显示阴性.结论 本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性,并且具有很高的灵敏度和特异性.实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA,而其他组织细胞不表达.     

原位杂交组织化学的进展及其应用

原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry,ISHH)是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术,此技术的基本原理是通过已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针(probe),如双链或单链DNA探针、RNA探针、合成寡核苷酸探针,与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统(如放射自显影、组织化学或免疫组织化学)在核酸原有的位置上把它显示出来,进而探测组织细胞内标记探针及其转录产物(mRNA)的定位。自1969年,Gall     

体外转录法制备地高辛标记cx43cRNA探针

原位杂交常用探针种类较多。检测组织细胞中mRNA，首选cRNA探针。与DNA探针不同，它是单链探针，杂交时无需变性，也没有互补链的干扰，敏感度比cDNA探针要高；与寡脱氧核酸探针比较，其敏感度也要高出许多；并且cRNA探针杂交形成RNA-RNA双链核酸比RNA-DNA和DNA-DNA双链核酸更稳定，从而允许多次洗涤，提高杂交信号，降低背景染色。但也有一些缺点，探针要求条件高，严防RNA酶污染；粘性强，与组织有较高的非特异性结合，需要多次漂洗。用地高辛标记cRNA探针，既克服了同位素探针的一些缺点，如受半衰期的限制，污物处理困难等．又避免了生物素标记探针时受内源性生物素的干扰。所以我们制备地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测宫颈组织中的connexin43(CX43)mRNA。     

随机引物法标记放射同位素DNA探针及其应用

我们报告应用随机引物和 DNA聚合酶I Klenow大片段进行放射性同位素 DNA探针标记,获得高比放射性DNA基因探针的方法。同时应用这种方法标记了MDRl基因cD-NA探针对脑胶质瘤基因组 DNA进行Southern blot杂交获得满意效果。我们认为,该方法较缺口平移标记法不仅放射比活性高,而且简便易行,是一种适合临床开展分子生物学研究的实验技术。     

原位杂交技术的应用及操作体会

原位杂交技术的原理是依据核酸碱基互补配对原则,利用标记的特定序列探针与待测样本中的原位检测目的基因互补核酸序列杂交,经信号放大显色后镜下观察结果.该方法具有2 个特点:①基因水平的检测,即直接检测DNA 或RNA ;②可以明确定位,在保存组织结构同时揭示组织细胞的异质性,细胞基因表达的异质性和细胞器中的区别定位[1].现根据我科目前开展的DNA 原位杂交人乳头状病毒(HPV)的检测,在日常操作中的方法及体会介绍如下.     

半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的16S和23S rRNA基因及其间区的序列。设计3条引物,建立了扩增16S－23S mRNA基因间区的半套式PCR方法,并将扩增片段制成探针,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出572bp的PCR条带,而对照菌都为阴性,此半套式PCR方法的灵敏度高达1pg;用九里株扩增片段标记后制成的探针,与10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,此杂交方法的灵敏度为0．5ng。结论 基于Q热立克次体16S－23S rRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度,可联合应用于Q热的病原学诊断。     

分子生物学技术在肝癌研究中应用

肝癌的发生是有其分子生物学基础的。自80年代以来许多技术相继开发应用到肿瘤的分子生物学研究,并取得了显著的成效。一类主要用于基因组DNA的检测,如肝癌基因和抑癌基因的定位克隆,比较基因组杂交,代表性差异分析;用于cD-NA或mRNA或mRNA水平的技术包括消减杂交、差异显示PCR、cDNA代表性差异分析、DNA芯片及探针微列阵等。这些技术的应用为肝癌的分子生物学研究开拓了一个崭新的领域。一、DNA水平的研究 1.定位克隆癌基因和抑癌基因:利用各种DNA多态性标记对癌基因或抑癌基因进行染色体定     

兔输卵管内皮素-1 mRNA阳性表达细胞的分布

为了探明内皮素－1在兔输卵管组织细胞中的来源,本文采用地高辛精标记ET－1 cRNA探针核酸原位杂交法对兔输卵管内皮素－1mRNA阳性表达细胞的分布进行了研究。结果显示,输卵管粘膜上皮细胞浆内可见ET－1mRNA阳性杂交信号,呈深蓝色,阳性杂交信号强且密集,该阳性杂交信号主要分布在细胞核的上方,靠近游离面。     

HBV基因型与肝癌的预测性相关研究 Ⅰ.地高辛甙元标记HBV-DNA探针的制备

用地高辛甙元随机引物法标记HBV DNA探针,通过核酸分子杂交技术测试该探针。结果证实,该探针检测HBV DNA的特异性和敏感性均达到了实验要求,为进一步开展临床HBV核酸分子杂交检测技术提供了可靠的实验材科。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

应用探针微孔板杂交技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

寻找一种检测孕妇血浆中胎儿DNA新方法,采用SPY探针微孔板杂交法,通过PCR产物与SRY探针杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值,结果发现：探针微孔板杂交检测法的灵敏性和特异性均高于电泳检测方法,提示：探针微孔板杂交检测技术的灵敏性和特异性较高,更适用于临床应用。     

固化DNA纳米胶体金探针杂交目视化比色检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的实验研究

目的 建立以纳米金颗粒为载体的DNA探针杂交方法,快速、特异地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)特异性mecA基因.方法 采用直径为60nm的胶体金纳米颗粒与巯基修饰的2条mecA基因寡核苷酸探针共价结合,制备成固化的DNA 金纳米探针.将金纳米探针与其互补的mecA基因靶序列在液相中杂交,通过调节2条探针的比例和不同的检测方法对杂交反应条件和产物检测进行优化.结果 金纳米探针呈稳定的酒红色,与互补的靶序列DNA进行液相杂交后颜色呈现明显的蓝色变化.当2条探针不对称加入时颜色变化更明显.采用反向色谱反应盘检测反应产物也可获得满意的效果.产物离心后检测灵敏度可达2.36 fmol/L.结论 固化纳米胶体金探针杂交技术具有快速简便的特点,有望为MRSA的快速检测提供一种新的方法.     

聚合酶链反应和DNA探针杂交法检测沙眼衣原体的比较

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）和DNA探针杂交法检测泌尿生殖道沙眼衣原体（Ct)的临床诊断价值。方法：应用这两种方法对未使用过抗衣原体药物的80例宫颈炎患者同时进行Ct检测。结果：PCR法检出Ct基因的阳性率（23．8％）高于探针杂交法（15．0％），两者比较有显著性差异。结论：PCR法检测Ct较DNA探针杂交法敏感，如将两法结合应用结果将更可信。     

聚合酶链反应结合DNA探针杂交在结核杆菌检测中的应用

应用PCR和Southern转移、光敏生物素标记DNA探针杂交技术进行了结核杆菌检测的应用研究。实验结果表明PCR结合探针杂交可将PCR敏感性提高100倍,但不影响其特异性。106例结核性痰标本PCR检测阳性率为46.2％,结合探针杂交达76.4％,涂片阴性的标本差异尤为明显,因而显著提高了结核阳性诊断变率。21例非结核性痰标本PCR和探针杂交未发现假阳性。对临床可疑而PCR阴性标本有必要合用DNA探针杂交。     

N-ras基因DNA损伤检测方法的建立

目的 建立应用依赖随机化末端连接物PCR（RDPCR）技术检测N—ras基因DNA损伤的试验方法。方法 采用单引物PCR技术制备N—ras基因外显子1单链探针,酶切构建DNA损伤模型,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色。结果 单引物PCR技术制备单链探针获得成功,目的基因在相应位置出现了清晰的杂交条带。结论 RDPCR技术可定位检测到该酶切DNA损伤位点,表明该方法已成功建立,将有利于其在化学致癌作用机制研究及肿瘤预防领域的应用。     

应用探针微孔板杂交技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

寻找一种检测孕妇血浆中胎儿DNA新方法.采用SRY探针微孔板杂交法,通过PCR产物与SRY探针杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值.结果发现探针微孔板杂交检测法的灵敏性和特异性均高于电泳检测方法.提示探针微孔板杂交检测技术的灵敏性和特异性较高,更适用于临床应用.     

发夹DNA探针检测乙胺丁醇耐药结核杆菌embB基因306密码子突变研究

目的:针对结核杆菌耐乙胺丁醇embB306codon位点,设计发夹DNA探针及其相应的单侧延长臂发夹DNA探针,建立发夹DNA探针芯片技术,并初步运用荧光显微镜观测探针与扩增产物杂交的荧光信号.方法:运用Beacon designer软件,设计embB基因包含306codon的发夹DNA探针及其相应的单侧延长臂发夹DNA探针,荧光显微镜检测embB306codon扩增片段与探针杂交后荧光信号,比较扩增产物测序结果.结果:通过荧光显微镜观测到结核标准株及embB306codon突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号存在显著差异;33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐乙胺丁醇组embB306codon突变检出率为66%,测序法突变检出率为69%.结论:embB306codon点突变是结核杆菌耐乙胺丁醇的主要原因;发夹DNA探针芯片技术可以有效检测单碱基靶点突变;应用荧光显微镜可以高灵敏地观测荧光芯片杂交靶点.     

临床基因诊断技术（三）

二、核酸杂交技术1.制备探针:1cDNA探针:从相应组织中分离出mRNA,经逆转录得cDNA,由cDNA再复制成双链DNA,后者被重组到适当的质粒中(贮存),转化到细胞中增殖后酶制取。2从建因工程构建的基因文库中,选取含稳定基因的重组体酶切制取。3人工合成(DNA合成仪)寡核苷酸,一般不超过50     

用不同标记的乙型肝炎病毒DNA探针对肝组织内病毒基因进行原位核酸分子杂交

本文报道采用国产[α-(55)~S]dATP及进口[3~H]dNTP与生物素标记HBV DNA全基因探针进行原位核酸分子杂交,均可获得阳性结果。其中[3~H]dNTP标记探针的敏感性与特异性最佳。对6例慢性乙型肝炎患者肝组织切片进行原位核酸分子杂交,结果与肝组织提取物经Southern吸印转移HBV DNA杂交的阳性率完全一致。原位核酸杂交显影后的银颗粒呈灶性分布于肝细胞内,提示病毒在肝内扩散为细胞——细胞间传播方式进行。对1例有复制型HBV DNA的肝癌组织进行原位核酸分子杂交,发现HBV DNA主要分布在光镜下癌细胞旁肝细胞胞浆中,而癌细胞中未测得HBV DNA,其意义有待更多病例数检测后才能阐明。     

量子点流式微球技术用于DNA的检测研究*

目的 构建一种基于新型纳米材料量子点的流式微球技术,用于高通量的DNA检测,实现DNA的快速、低成本检测。方法 将能与靶DNA一端杂交的探针DNA（P1）标记在微球表面,与DNA配对杂交后,加入能与靶DNA另一端杂交的量子点标记的探针DNA（P2）,组装成一种流式微球-探针P1、靶DNA、量子点-探针P2的夹心复合结构,通过测定杂交前后平均荧光强度的变化检测DNA的浓度。结果 该新型检测方法可以区分出完全互补、单碱基错配及完全非互补的DNA（P?<0.05）,且随着DNA浓度的升高,检测到的平均荧光强度逐渐增强（P?<0.05）,对DNA的最低检出限可达0.2?nmol/L。结论 新型量子点流式微球技术检测DNA具有高敏感性和高特异性、分析速度快、操作简单等优点,是一种非常重要的具有潜力的新型临床检测方法。