不同质量分数的钛-铜合金对MC3T3-E1细胞分化的影响研究

目的　探究不同质量分数的钛-铜合金对MC3T3-E1细胞分化的影响,并寻找促进细胞分化作用最佳的含铜质量分数。方法　将不同质量分数的钛-铜合金样片分组,设组1（cp Ti）为对照组,组2（Ti-2wt%Cu）、组3（Ti-5wt%Cu）、组4（Ti-10wt%Cu）为实验组。将MC3T3-E1细胞按2 × 104/孔的密度接种到包埋样片的24孔培养板中行共培养。在第3、5、10和15 d时,用微量酶标法检测成骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性表达情况;在第7、14和21 d时,分别用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）、骨钙素（OC）活性表达情况。采用SPSS 20.0统计分析软件包对所有检测数据进行单因素方差分析,比较各组间差异。 结果　Ti-2wt%Cu最有利于ALP活性表达（P＜0.05）,共培养第10 d时达最大值;Ti-5wt%Cu最有利于COL-Ⅰ活性表达（P＜0.05）,共培养第7 d时达最大值;Ti-5wt%Cu最有利于OC活性表达（P＜0.05）,共培养第14 d时达最大值。 结论　与cp Ti相比较,低质量分数钛-铜（Ti-2wt%Cu、Ti-5wt%Cu）对MC3T3-E1细胞分化有促进作用,表现为时间依赖性;高质量分数钛-铜（Ti-10wt%Cu）对MC3T3-E1细胞分化有抑制作用。相对而言,Ti-5wt%Cu合金对MC3T3-E1细胞分化作用最佳。     

多孔纯钛孔隙率及孔隙尺寸对蛋白吸附及成骨细胞分化的影响

目的从分子生物学角度研究筛选利于蛋白质吸附、成骨细胞分化的合适孔隙结构,为多孔钛材料作为牙种植体提供研究基础及制备参数。 方法筛选不同粒径（Ⅰ组：0~200 μm、Ⅱ组：200~400 μm、Ⅲ组：400~600 μm）的NH₄HCO₃造孔剂颗粒,按照不同的质量分数（A组：20%、B组：30%）与钛粉均匀混合,粉末冶金法制备6组多孔纯钛试件,不添加造孔剂制备致密纯钛试件作为对照组;每组10个试件。蛋白定量试剂盒测定蛋白质吸附量以评价多孔纯钛试件的蛋白吸附能力,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）及骨钙素（OCN）基因表达量以评价成骨细胞分化水平。 结果多孔纯钛的蛋白质吸附量高于致密纯钛（P < 0.05）,其中小平均孔隙尺寸及高平均孔隙率组较其余多孔纯钛组吸附更多蛋白质（P < 0.05）。多孔纯钛的孔隙率和孔隙尺寸对成骨细胞分化的影响具有交互效应。成骨细胞培养第7天,仅AI组Runx2基因表达量高于对照组（P < 0.05）;培养第14天,多孔纯钛各组Runx2基因的表达量均低于对照组（P < 0.05）。成骨细胞培养7、14 d后,多孔纯钛各组ALP基因的表达量高于对照组（培养第7天,BⅢ组除外;培养第14天,AⅠ、AⅢ组除外）（P < 0.05）。成骨细胞培养第7天,AⅠ、BⅠ组OCN基因的表达量较对照组及其他平均孔隙尺寸组高（P < 0.05）;成骨培养第14天,仅BⅠ组OCN基因的表达量高于对照组（P < 0.05）。 结论本实验条件下,孔隙结构提高了纯钛试件的蛋白质吸附量,且平均孔隙率为53.3%、平均孔径为191.6 μm的多孔钛试件利于小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨向分化。     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

浓缩生长因子提取液对钛片表面MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

目的 探讨浓缩生长因子提取液（CGFe）对钛片表面MC3T3-E1细胞增殖分化的影响。方法 实验组使用含CGFe的α-MEM培养液（含10%胎牛血清）培养MC3T3-E1细胞,对照组则使用不含CGFe的α-MEM培养液（含10%胎牛血清）培养细胞。采用MTT法测定培养1、3、5 d时的细胞增殖情况,碱性磷酸酶（ALP）活性测定法检测培养3、5 d时的细胞分化情况;通过扫描电子显微镜（SEM）观察培养12 h时细胞在钛片表面的形态;通过荧光实时定量聚合酶链反应（PCR）测定细胞培养3、7 d时核心结合蛋白因子2（Runx2）和成骨细胞特异性转录因子Osterix（Osx）基因的相对表达量。结果 MTT结果显示：随培养时间延长,细胞数量逐渐增加;各时间点实验组细胞的吸光度值均明显高于对照组（P<0.05）。ALP活性随着培养时间延长而增加,两个时间点实验组的吸光度值均明显高于对照组（P<0.05）。SEM观察：培养12 h时,实验组细胞在钛片表面的形态较对照组更加伸展。PCR结果显示：随着培养时间延长,两组细胞Runx2和Osx基因的表达量逐渐增加,两个时间点实验组的表达量均明显高于对照组（P<0.05）。结论 CGFe能有效地促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及在钛片表面的伸展。     

多孔钛孔隙率和孔隙尺寸对其力学性能及细胞相容性的影响

目的研究多孔钛孔隙率和孔隙尺寸对其力学性能及细胞黏附与增殖的影响,为临床应用提供依据。方法调整加入造孔剂的粒径及质量分数,粉末冶金法制备12组不同孔隙结构的多孔钛,金相显微镜观察其孔隙特征,计算孔隙率及平均孔隙尺寸。万能材料试验机测定其屈服强度、弹性模量及弯曲强度。筛选力学参数与人皮质骨匹配的多孔钛,CCK-8法测定其MC3T3-E1细胞黏附及增殖活性。结果随着多孔钛孔隙率增大,其屈服强度由406.0 MPa降至52.9 MPa,弹性模量由18.2 GPa降至3.5 GPa,弯曲强度从327.2 MPa降至50.6 MPa。多孔钛孔隙率和孔隙尺寸对其屈服强度、弹性模量及弯曲强度均有影响(P<0.05)。MC3T3-E1细胞在多孔钛表面的早期黏附吸光度值低于致密纯钛和塑料培养板对照组(P<0.05),但细胞在前者的增殖活性显著高于后者(P<0.05)。结论在本实验研究范围内,当孔隙率为43.1%～53.3%、且孔隙尺寸为154.8～191.6μm时,多孔钛的力学性能与人骨接近,且有利于成骨细胞增殖。     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞黏附、增殖、分化的影响

目的:研究钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和分化的影响。方法:1)两步法在钛表面制备仿生磷酸钙涂层,扫描电子显微镜(SEM)观察形态,X射线衍射(XRD)、傅立叶转换红外光谱(FTIR)检测表征;2)RGD固定至仿生磷酸钙涂层;3)实验分3组:纯钛组,钛/仿生磷酸钙涂层组,钛/RGD/仿生磷酸钙复合涂层组,细胞分别接种至3组材料表面。4)SEM观察细胞接种4 h和24 h的形态;5)结晶紫染色检测细胞接种4 h和8 h的黏附情况。6)MTT法检测细胞1、3、7 d的增殖活性;7)检测细胞3、7、14 d的ALP活性。结果:SEM细胞形态观察及结晶紫染色结果显示,RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的细胞黏附效果优于对照组。MTT结果显示RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的细胞增殖活性强于对照组。ALP检测结果显示RGD/仿生磷酸钙复合涂层组的成骨分化活性高于对照组。结论:钛表面RGD/仿生磷酸钙复合涂层对MC3T3-E1细胞的黏附、增殖、分化均有促进作用。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

透钙磷石涂层浸提液掺锶对 MC3T3-E1细胞成骨相关因子表达的影响

目的：探讨透钙磷石与锶对成骨细胞的协同作用。方法：电化学沉积制备含透钙磷石涂层钛片,浸提法制备其浸提液,向配制好的浸提液中分别加入0．1％、0．5％和1％的锶。将 MC3T3-E1细胞置于掺锶的浸提液中进行培养,检测不同含锶量的透钙磷石涂层浸提液中 MC3T3-E1细胞活性、ALP 活性,RT-PCR 检测 bFGF 和 VEGF mRNA 表达。结果：含透钙磷石涂层钛片浸提中锶的浓度为0．1％、0．5％和1％时,培养的 MC3T3-E1细胞增殖率、ALP 活性、bFGF 和 VEGF mRNA 表达均高于无锶对照组（P ＜0．05）。结论：掺锶透钙磷石对 MC3T3-E1细胞成骨功能有促进作用。     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

TGF-β1促进rhBMP-2对成骨前体细胞增殖分化的观察

目的:观察TGF-β1对rhBMP-2促进成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和分化能力的影响。方法:MC3T3-E1加入不同浓度的rhBMP-2和TGF-β1+rhBMP-2进行组织学观察,用MTT法检测细胞增殖,通过ELISA检测细胞ALP含量。结果:随着加入rhBMP-2浓度的增加,MC3T3-E1细胞的增殖逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组增加更为显著(P<0.05)。TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50、100μg/L间存在统计学意义(P<0.05)。随着rhBMP-2浓度的增加,ALP值逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组ALP值升高更为显著(P<0.01),TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50μg/L间有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1可促进rhBMP-2对MC3T3-E1的增殖和成骨分化作用。     

新型根管封闭剂对MC3T3-E1成骨细胞的细胞毒性评估

目的：评估新型根管封闭剂RealSeal sealer、GuttaFlow对MC3T3-E1成骨细胞的细胞毒性,并与传统的AH Plus比较。方法：制备RealSeal sealer、GuttaFlow和AH Plus（固化7d）的材料浸提液,倍比稀释为4种浓度：100%、50%、25%、12.5%;MC3T3-E1细胞于其中分别培养24h和72h,CCK-8法检测细胞存活率,评价不同材料的细胞毒性。结果：在实验期内,RealSeal sealer组的细胞存活率显著低于AH Plus、GuttaFlow（P〈0.05）,AHPlus、GuttaFlow和阴性对照组间无显著差异。结论：在本实验条件下,RealSeal sealer对MC3T3-E1成骨细胞的毒性最强,而GuttaFlow和AH Plus几乎无细胞毒性。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞EphA2表达的调控

目的：研究小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1在成骨分化过程中,牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）对EphA2表达的影响。方法：使用终浓度1mg/L的Pg-LPS与MC3T3-E1共培养,分别在第3、7、14天3个时间点,采用RT-PCR和Western-Blot技术测定EphA2的表达和成骨相关基因的表达,并通过PNPP法测定碱性磷酸酶活性。结果：RT-PCR结果提示,在第3天和第7天,实验组比对照组EphA2基因表达分别增高4.5倍和1.3倍,两组之间存在显著差异（P〈0.05）。同时成骨标志物ALP和Sp7基因表达降低,与对照组相比差异有显著性,但Runx2和ColⅠ基因的表达则无明显差异。但是在第14天,实验组和对照组之间EphA2和成骨相关基因表达均无显著性差异。Western-Blot结果提示,在第7天实验组比对照组EphA2蛋白表达增加。结论：Pg-LPS对前成骨细胞系MC3T3-E1细胞,在成骨分化的早期和中期能够促进EphA2的表达,但是在成骨分化晚期对EphA2的表达则无明显作用。     

脂多糖刺激的单核巨噬细胞培养上清液对小鼠MC3T3-E1细胞c-fos表达的影响

目的：研究经牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）脂多糖（LPS）刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞（MC3T3-E1细胞）c-fos表达的影响。方法：收集100μg/L的Pg LPS刺激RAW264.724h后的上清液,以20%稀释浓度分别作用于MC3T3-E1,分别在1、3、6、12、24、48、72h时,采用RT-PCR和Western blot检测ALP mRNA、c-fos mRNA及蛋白表达水平的变化。结果：Pg LPS刺激RAW264.7细胞培养上清作用于MC3T3-E1后,ALP mRNA表达均下降,在6h时表达最低,而c-fos的mRNA和蛋白水平均提高,分别在3h和6h时达最高水平。结论：Pg LPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清可通过上调成骨细胞c-fos的表达而抑制其成骨能力。     

Bioaggregate对成骨细胞矿化相关基因表达的影响

目的：通过与三氧化矿化聚合物（MTA）比较,评价Bioaggregate（BA）对成骨细胞MC3T3-E1的细胞毒性及其对成骨细胞矿化相关基因表达的影响。方法：将MC3T3-E1细胞与BA或MTA共培养分别至1、2、3d后,它们对成骨细胞的毒性通过MTT技术来检测。同时,其对成骨细胞矿化相关基因Ⅰ型胶原（COLⅠ）,骨钙素（OCN）,骨桥蛋白（OPN）表达的影响运用定量PCR检测。结果：BA和MTA均对MC3T3-E1细胞无毒性作用。与MTA比较,BA能够诱导成骨细胞矿化相关基因COLⅠ,OCN,OPN的表达。结论：BA是一种新型的根管充填材料并且能够诱导成骨细胞矿化相关基因的表达。     

硫酸软骨素蛋白聚糖对MC3T3-E1细胞株矿化的影响

目的:观察硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)对前成骨细胞株MC3T3-E1矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和钙离子沉积量的影响。方法:MC3T3-E1细胞株在含不同浓度CSPG(0、5、10、15 mg/L)诱导液中培养,不加CSPG组为对照组,其余3组为实验组,细胞诱导14 d时行ALP染色和活性检测,21 d时行茜素红染色和钙离子沉积量检测。结果:与对照组比较,各实验组ALP和茜素红染色面积随CSPG浓度增加逐渐减小,颜色变浅;定量分析结果显示,钙离子沉积量整体差异有统计学意义(P<0.05),ALP活性整体差异无统计学意义。结论:在本实验周期内,CSPG以剂量依赖方式抑制MC3T3-E1细胞株钙离子的沉积。     

MC3 T3-E1细胞在四种生物膜上粘附增殖能力的比较研究

目的：研究四种生物膜的表面形态及生物相容性,比较它们对 MC3 T3-E1细胞粘附增殖能力的影响,及成膜材料与制备方法之间的交互作用。方法：以聚己内酯[poly（ε-caprolactone）,PCL]与聚乳酸-羟基乙酸[poly（lactic-co-glycolic acid）, PLGA]作为膜材料,浇铸及电纺两种方法分别制备生物膜,使用场发射扫描电子显微镜观察四种膜表面结构,CCK-8法检测膜上 MC3T3-E1细胞1、3、7 d增殖量,激光共聚焦显微镜评价细胞在材料表面的粘附情况,实时荧光定量 PCR反应检测粘附相关基因。结果：扫描电镜观察到浇铸膜表面具有孔隙结构,电纺膜表面电纺丝交织成网;CCK-8检测中3 d、7 d 时 PLGA 膜上细胞增殖量大于 PCL膜（P＜0．05）,与制备方法无关（P＞0．05）;激光共聚焦显微镜观察到除 PCL 电纺膜表面细胞铺展不佳外,其余膜上细胞生长良好;实时荧光定量 PCR检测发现 PCL浇铸膜上细胞整合素基因表达量高于其他组（P＜0．05）,且不同材料与制备方法间存在交互作用。结论：PLGA膜有利于 MC3T3-E1细胞增殖,而 PCL 浇铸膜适合细胞粘附。因此,相对单一材料或成膜方式,PLGA与 PCL及浇铸、电纺法的混合膜可成为以后发展的方向。