荧光定量PCR法检测小鼠肠道中产气荚膜梭菌的实验研究

目的 建立一系列浓度梯度的A型产气荚膜梭菌(clostridium perfringens,C.perfringens)感染小鼠肠道的动物模型,探讨实时荧光定量PCR法对肠道中C.perfringens的检测.方法 小鼠随机分成6组,每组10只,依次腹腔注射浓度为5.7×109、5.7×108、5.7×107、5.7×...     

产气荚膜梭菌实验室诊断方法综述

气性坏疽不仅是战伤的严重并发症,也是其他创伤的严重并发症,其主要致病菌为产气荚膜梭菌。由于产气荚膜梭菌繁殖迅速,引起的临床症状严重,因此日益受到临床及实验室的广泛关注。近年来,国内外学者在对此菌的快速诊断方面作了大量的工作,本文就近年的研究成果进行综述。     

小鼠气性坏疽动物模型的建立

目的建立产气荚膜梭菌感染小鼠的后肢的气性坏疽动物模型,为早期诊断、了解气性坏疽的致病机理及治疗方法提供依据。方法小鼠随机分成4组,每组10只。三个实验组分别肌肉注射3.5×109、3.5×108和3.5×107cfu/ml浓度的产气荚膜梭菌(ATCC13124)菌液0.1ml,空白对照组肌肉注射生理盐水0.1ml,72h后观察小鼠感染情况,取伤口分泌物作革兰氏染色涂片,细菌血平板厌氧培养和荧光定量PCR方法定量检测。结果 3.5×109、3.5×108、3.5×107cfu/ml实验组和对照组在肌肉注射72h内的死亡率为90%、70%、10%和0%。各组平均存活时间依次为(20:43±11:12)h、(37:24±25:39)h、(68:36±10:45)h和(72:00±0:00)h,死亡小鼠出现了气性坏疽的症状,分泌物培养和镜检出产气荚膜梭菌;未死亡小鼠康复;空白对照组无任何症状。各组Ct值均值为21.21±2.69、28.45±2.74、32.49±2.87和0.00±0.00,组间P值均<0.05。结论成功建立了不同浓度的产气荚膜梭菌在不同时间段内感染小鼠的后肢气性坏疽的动物模型,为了解气性坏疽的致病机理及治疗方法奠定基础。     

食品中产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型

目的调查广州地区食品中产气荚膜梭菌的污染水平及菌型分布。方法参照国家标准方法进行产气荚膜梭菌的分离鉴定,采用针对产气荚梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2六种毒素的基因cpa、cpb、etx、iA、cpe和cpb2序列的6对特异性引物,用多重PCR方法对分离菌株进行基因分型鉴定。同时用产气荚膜梭菌A型参照株NCTC64609作为阳性对照。结果从142份食品中分离到21株产气荚膜梭菌,以冷冻肉的带菌率最高,为19.6%;鲜肉和速冻肉饺分别为12.2%和11.9%。经多重PCR方法鉴定,均扩增出预期大小为324bp的cpa基因片段的特异性条带,未扩增出针对cpb、etx和iA基因的特异性条带,证实均为A型产气荚膜梭菌。携带β2毒素基因的产气荚膜梭菌共19株(占总分离株的90.4%),其中1株为肠毒素基因阳性的A型菌株。结论初步调查表明广州地区食品中存在可致人食物中毒的肠毒素阳性A型产气荚膜梭菌污染,为进一步建立广州地区食品中及与食物中毒有关的厌氧菌分子分型数据库奠定了基础。     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

随着PCR(聚合酶链反应)技术的飞速发展,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、自动化和重复性好、定量准确、污染少等优点,成为分子生物学和其它领域的重要技术工具,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.本文就实时荧光定量PCR技术的主要原理、定量方法及目前在研究领域中主要的应用进行了概述.     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌快速诊断中的研究

目的 在痰液标本中,探讨荧光定量PCR技术快速检测结核分枝杆菌应用的诊断价值。方法 选取210例初诊的疑似结核病患者的痰液标本,分别进行痰涂片、MGIT960液体培养以及荧光定量PCR的检测,其中103例标本还进行了Xpert MTB/RIF检测,通过比较来分析荧光定量PCR在检测结核分枝杆菌方面的敏感度和特异性。结果 荧光定量PCR方法从痰液中检出结核分枝杆菌的阳性率高达28%,显著高于痰涂片15.2%的检出率,并且与结核培养的30.9%检出率相接近。以MGIT960液体培养为金标准,荧光定量PCR方法检测痰液标本中的结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为67.7%、 89.7%,阳性预测值和阴性预测值分别为74.6%和86.1%,两者之间差异没有统计学意义。将荧光定量PCR方法与Xpert MTB/RIF诊断方法相比较,分析发现荧光定量PCR方法的敏感度和特异度分别为85.9%、94.9%,阳性预测值和阴性预测值分别为96.5%和80.4%,两者之间差异没有统计学意义。结论 荧光定量PCR方法在检测结核分枝杆菌时具有较好的敏感度和特异度,效果优于传统的痰涂片方法,并且与Xpert MTB/RIF方法具有较好的一致性。荧光定量PCR检测成本较低,且结果准确,在快速检测结核菌方面具有比较好的应用前景。     

实时荧光定量PCR技术诊断肺结核的meta分析

目的系统评价实时荧光定量PCR技术对肺结核的诊断价值并作meta分析。方法检索Pubmed,EMBASE,BIOSIS,Web of Science以及维普、万方、中国知网、中国医学生物文献数据库。按照Cochrane协作网推荐的诊断试验纳入标准筛选文献,纳入的文献采用QUADAS进行质量评价,用MetaDisc 1.4进行meta分析。结果符合标准的共有21个研究,各研究间存在异质性,但不存在阈值效应。合并后的诊断优势比为105.32,敏感度为0.64,特异度为0.96,阳性似然比为19.79,阴性似然比为0.31。SROC曲线的AUC面积为0.9816,Q＊指数为0.9402。结论荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌有着较高的敏感性和很强的特异性,可作为临床肺结核诊断的重要辅助手段,但并不能完全取代痰涂片检查。     

实时荧光定量PCR对社区暴露腹泻样本CA-CDI的诊断价值

目的评估实时荧光定量PCR检测技术对社区获得性艰难梭菌感染(CA-CDI)的诊断价值。方法选取具有社区暴露史的有效非重复腹泻标本329例,分别以实时荧光定量PCR粪便标本直接检测法与产毒培养+细胞毒性酶免疫分析法(EIA)对CA-CDI进行诊断,并以产毒培养+EIA为“金标准”,评估实时荧光定量PCR检测的效能。结果CA-CDI“金标准”检测阳性率为5.17%(17/329).艰难梭菌荧光PCR检测试剂盒诊断结果与“金标准”差异无统计学意义(P>0.05),检测一致性为0.831,灵敏度与特异度分为76.47%、99.68%。艰难梭菌荧光PCR检测试剂盒对tcd-B的检测结果与“金标准”差异无统计学意义(P>0.05),检测一致性为0.860,灵敏度与特异度为81.25%、99.68%。结论实时荧光定量PCR检测技术以快速、高敏感度、高特异度等特点,可对社区暴露腹泻样本CA-CDI进行独立检测。     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

检测限是检测方法的重要性能指标,用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例,计算可知,一次抽样反应管的检测结果≥4时,才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知,1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368,结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997;而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。     

实时荧光定量PCR检测REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR对30例小细胞肺癌组织及癌旁组织中REST进行检测。结果REST在小细胞肺癌组织中的表达水平0．596比正常肺组织0．949明显降低（P〈0．05）,小细胞肺癌组织中REST的表达与肿瘤的分化程度及侵袭性有关（P〈0．05）。结论REST在小细胞肺癌组织中有低表达,可能参与小细胞肺癌的发病,可能有助于小细胞肺癌的早期诊断、治疗及预后。     

使用实时荧光定量PCR解析婴儿肠道双歧杆菌构建规律

目的 通过非培养的分子生物学方法检测婴儿早期肠道双歧杆菌的菌种组成及其数量变化,解析婴儿肠道双歧杆菌种群构建及菌种组成变化的规律及其可能的影响因素。方法 收集2013年3~4月16例正常足月新生儿第1次,第2、4、7、10、14、28天,3个月,6个月,1岁共10次粪便,使用实时荧光定量PCR和双歧杆菌属及种特异性引物对收集的粪便中的双歧杆菌属及人体肠道特有的8个双歧杆菌菌种进行定性及定量分析。结果 共收集婴儿粪便样品136份,双歧杆菌检出率为93.4%（127/136）,湿便中菌数为10 ⁵~10 ¹¹ CFU/g;第1次胎便双歧杆菌检出率为83.3%（湿便中菌数约为10 ⁵ CFU/g）;出生后14 d内双歧杆菌检出率及菌量在相对低的水平,被检出的双歧杆菌为1种或2种;出生28 d及以后双歧杆菌检出率增至100%,湿便中菌量增至10⁸ CFU/g以上;出生后28 d至6月龄多数婴儿、1岁时全部婴儿粪便中被检出双歧杆菌增至3种;双歧杆菌各菌种的检出率为B. breve (92.1%）、B. infantis（66.1%）、B. catenulatum（59.8%）、B. bifidum（25.2%）、B. longum（24.4%）、B. dentium（13.4%）、B. angulatum（5.5%）、B. adolescentis（1.6%）。结论 受试婴儿出生后到１岁其肠道双歧杆菌数量、菌种组成及其菌种多样性均随时间出现显著的变化,是受试婴儿肠道双歧杆菌种群构建的重要时期;同时发现受试婴儿双歧杆菌的菌种群构建整体上延迟、菌种组成上出现异常,推测是和受试婴儿的生产方式、喂养情况及其他各种环境因素密切相关。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

血清E型沙眼衣原体的Real-time PCR定量分析

目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量。结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率。结论针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体。     

三种乙型肝炎病毒基因检测方法的比较与评价

目的:探讨广州达安、上海复兴、上海之江三种国产乙型肝炎病毒基因(HBV-DNA)实时荧光定量PCR试剂盒的临床检测结果间的差异性。方法:选取138例已知的慢性乙型肝炎患者血浆标本,5例已知正常血浆标本每个标本均用三种国产HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒进行HBV-DNA定量测定,然后再比对检测结果并分析相互之间是否存在差异。结果:分别用上述三种试剂盒进行HBV-DNA定量检测,结果显示三种国产试剂盒HBV-DNA定量检测结果相差在半个数量级以内的占73.9%(102/138),相互之间小于一个数量级的占94.9%(131/138),大于一个数量级而小于两个数量级的占5.07%(7/138),经统计学分析结果无显著性差异(P>0.05)。结论:上述三种国产HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒在同一台仪器上的检测结果相互之间差异很小,有很好的准确度,它们的检测结果可以相互进行比较。     

比较分析痰涂片及荧光定量PCR在诊断肺结核中的作用

目的探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法采用痰涂片抗酸染色法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检。结果荧光定量PCR技术的阳性检出率是63.7%（571/897）,明显高于抗酸染色法的43.4%（389/897）。2种方法检测对照组的结果均为阴性,特异度为100%（103/103）。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。     

伤口分泌物病原菌分布和耐药性分析

目的探讨伤口分泌物中病原菌分布和耐药情况。方法收集泉州市正骨医院2005年8月至2007年6月住院患者伤口分泌物,进行细菌分离、菌种鉴定,并进行药物敏感试验。结果革兰阳性菌分离率最高的是金黄色葡萄球菌(17.04%),其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药问题严重,占20.34%;革兰阴性菌分离率最高的是大肠埃希杆菌(9.26%),其次是铜绿假单胞菌(6.30%)。结论伤口分泌物中分离出的菌种呈现多样化、耐药问题严重,应加强耐药性监测和抗菌药物使用的管理制度,以有效控制细菌感染和耐药。     

猴小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种能快速检测猴小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR方法.方法 以小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素基因的保守区为靶区域设计特异引物和探针,建立一种能快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、线性相关性、重复性等因素进行试验.结果 建立的荧光PCR法对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有特异的反应性,最低检出限为3.3×10 cfu/ml,菌液浓度在3.3×10〈＇7〉cfu/ml至3.3×10cfu/ml时与Ct值有较好的线性关系,试验重复性良好.结论 建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR检测方法适用于猴小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测.