碱烧伤后抑制角膜新生血管的实验研究--血管内皮生长因子165反义RNA的作用

目的研究重组腺相关病毒介导的血管内皮生长因子165反义RNA(rAAN-aVEGF165)抑制碱烧伤后角膜新生血管的作用。方法30只SD大鼠随机分成2组，每组15只。实验组前房注射rAAV-aVEGF165，对照组前房注射rAAV-Lacz。30天后，碱烧伤诱导角膜新生血管，以形态学分析评价角膜新生血管的情况，Western blot评价角膜VEGF的表达。结果形态学分析显示实验组角膜新生血管得到抑制，Western blot结果显示，碱烧伤后各个时期角膜VEGF165的表达实验组明显低于对照组。结论下调VEGF能有效抑制角膜新生血管的形成．重组腺相关病毒是眼反义基因治疗的有效载体。     

血管内皮生长因子shRNA表达质粒抑制鼠角膜新生血管与血管内皮细胞中血管内皮生长因子的表达

目的 探讨RNA干扰对大鼠碱烧伤后角膜新生血管(CNV)与血管内皮细胞(EC)中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及作用机制.方法 实验研究.采用DNA重组技术设计合成针对VEGF mRNA的3条shRNA寡核苷酸片段,构建真核表达质粒VEGF shRNA1、2、3,然后将质粒通过脂质体介导分别转染EC,逆转录聚合酶链反应和Western blot免疫印迹法分别检测EC中VEGF mRNA和蛋白的表达及干扰效率,并筛选出干扰效率最高的质粒(VEGF shRNA3质粒)进行体内实验.将20只SD大鼠按完全随机设计方法分为两组,分别为实验组10只和对照组10只,建立大鼠碱烧伤后CNV模型.实验组于结膜下注射VEGF shRNA3质粒后,显微镜下观察CNV生长情况,7 d后利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blot法分别检测实验组和对照组角膜组织VEGF mRNA和蛋白的表达.多组间差异显著性检验用单因素方差分析,两组CNV面积比较采用重复测量的方差分析.结果 经酶切及测序证实重组质粒构建成功.VEGF shRNA1、2、3质粒均可下调VEGF mRNA和蛋白的表达,其中VEGF shRNA3质粒的抑制作用较强,VEGF mRNA和蛋白的抑制率分别为68.92%和66.22%.体内实验中碱烧伤后3、5、7 d,实验组CNV长度较对照组明显降低,差异有统计学意义(F=355.744,P=0.000);实验组CNV面积较对照组明显降低,差异有统计学意义(F=402.700,P=0.000);实验组VEGF mRNA和蛋白在角膜组织中的表达较对照组明显降低,抑制率分别为41.84%和41.86%.结论 构建的VEGF shRNA质粒能右效抑制EC中VEGF mRNA和蛋白的表达.结膜下注射VEGF shRNA3质粒能显著抑制碱烧伤后CNV的形成与VEGF的表达.     

姜黄素对大鼠碱烧伤角膜新生血管的抑制作用

目的:探讨姜黄素(curcumin)对大鼠角膜新生血管(corne-al neovascularization,CNV)形成的影响及CNV形成过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide syn-thesis,iNOS)的表达情况。方法:以碱烧伤建立角膜新生血管模型,采用裂隙灯照相、免疫组化和RT-PCR等方法分别检测使用姜黄素前后各时期角膜组织中VEGF和iNOS的表达情况,并进行统计学分析。结果:姜黄素结膜下注射组角膜新生血管面积明显减少(t值分别为4.453,4.440,3.887,4.718,3.585,P<0.05);免疫组化染色,VEGF和iNOS在正常角膜上皮基底细胞有弱表达,新生血管对照组表达明显增强,其表达主要分布在新生血管形成区域和上皮全层;结膜下注射组表达明显减少;VEGF mRNA和蛋白表达一致。结论:姜黄素可以有效抑制角膜新生血管的发生,其机制与降低角膜新生血管VEGF和iNOS有关。     

反应停对大鼠碱烧伤诱导角膜新生血管的影响

目的:研究反应停(thalidomide)对碱烧伤诱导角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的影响。方法:建立大鼠角膜碱烧伤诱导CNV模型,SD大鼠36只随机分成角膜新生血管对照组(A组)、反应停灌胃组(B组)和反应停球结膜下注射组(C组)。采用裂隙灯照相、免疫组化和RT-PCR等方法,检测碱烧伤后各时间点不同处理方法大鼠CNV的生长情况及VEGF的表达情况。结果:B组和C组的角膜新生血管面积和VEGF的表达均显著少于A组(P均(0.05);C组的角膜新生血管面积和VEGF的表达少于B组(P均<0.05)。结论:反应停可有效抑制大鼠角膜碱烧伤诱发CNV的生长,降低角膜新生血管VEGF的表达。球结膜下注射较全身应用更有效。     

VEGF siRNA对兔眼碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用

目的:研究血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF small in-terfering RNA,VEGF siRNA)对兔眼碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用。方法:普通家兔25只以碱烧伤法(1mol/LNaOH溶液)诱导角膜新生血管(CNV)生成。碱烧伤后立即以脂质体(LF2000)为载体,右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒,左眼球结膜下注射pSilencer 2.1-U6 hygro空白质粒作为阴性对照。碱烧伤后1,3,5,7,14d,形态学分析评价角膜新生血管的生长情况。结果:与对照眼相比,碱烧伤后球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒,实验眼在各时间段(3,5,7,14d),CNV长度明显变短,面积明显变小,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VEGF siRNA能有效地抑制碱烧伤后CNV的形成。     

瘦素和血管内皮生长因子在碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管模型中的表达

目的 观察碱烧伤后不同时期角膜的组织病理学变化,以及瘦素和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VFGF)的表达,探讨它们与角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的关系.方法 使用碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管模型,采用浸润1 mol·L-1 NaOH溶液、直径为3 mm的单片滤纸,准确置于大鼠右眼角膜中央30 s,制作CNV模型.25只SD大鼠右眼为实验眼,随机分成5组,每组5眼,左眼为正常对照眼.每天用裂隙灯显微镜观察角膜新生血管,分别计算新生血管长度和面积.并行HE染色和免疫组织化学检测.结果 碱烧伤后4 d、7 d、14 d、21 d,实验组CNV面积分别为:(2.55±0.15)m2、(4.15±0.36)mm2、(10.21±0.45)mm2、(8.56±0.06)mm2.免疫组织化学检测显示角膜碱烧伤后1 d,实验组瘦素、VEGF的表达开始增高,碱烧伤后14 d达高峰,14 d后瘦素、VEGF的表达下降,21 d后显著下降;其表达部位主要分布在形成的新生血管区域和上皮层;正常对照组瘦素可微弱表达于角膜上皮层和基质层,VEGF没有表达或仅在上皮基底膜有微弱表达.实验组角膜瘦素、VEGF阳性表达率较对照组明显增加(χ2=29.07,P=0.001;χ2=35.51,P=0.001),瘦素与VEGF的表达具有正相关性(r=0.95,P=0.001).结论 瘦素和VEGF表达水平与角膜新生血管的生成具有相关性,瘦素可能成为治疗CNV的靶点.     

改良内皮抑素基因对大鼠角膜新生血管中血管内皮生长因子及其受体表达的抑制作用

背景 内皮抑素(ES)是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子,能抑制新生血管的发生,而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的聚合能增强ES基因的功能. 目的 探讨改良ES基因对大鼠角膜新生血管(CNV)中血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF受体2(Flk-1)表达的影响及作用机制. 方法 102只清洁级SD大鼠按随机数字表法分为模型组、pCI空载体组、pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组,每组24只;正常组6只.用浸有1 mol/L NaOH溶液的直径3 mm圆形滤纸片快速贴于大鼠角膜中央40 s建立角膜碱烧伤CNV模型,以pCI质粒作为改良前后ES基因的表达载体,每周2次结膜下注射3μg含质粒的转染液进行基因治疗.每日裂隙灯显微镜下观察角膜水肿及CNV生长情况,计算CNV面积.于碱烧伤后1、4、7、14 d用过量麻醉法处死模型鼠并获取角膜组织,用免疫组织化学法检测CNV内皮细胞中CD34的表达以计算CNV密度,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法分别检测角膜VEGF mRNA及Flk-1在角膜中的表达. 结果 角膜碱烧伤后7～14d,pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组CNV面积均明显小于pCI空载体组和模型组,CNV密度均明显小于pCI空载体组和模型组,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);pCI-RGDRGD-ES转染组CNV面积均明显小于pCI-ES转染组,CNV密度均明显少于pCI-ES转染组,差异均有统计学意义( P＜0.05,P＜0.01).碱烧伤后4d,pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组大鼠角膜Flk-1蛋白表达水平明显低于正常对照组大鼠,差异有统计学意义(P＜0.05);碱烧伤后4d,pCI-ES转染组、pCI-RGDRGD-ES转染组大鼠角膜VEGF mRNA的表达水平明显低于正常对照组大鼠,差异有统计学意义(P＜0.05);pCI-RGDRGD-ES转染组大鼠角膜VEGF mRNA表达水平明显低于pCI-ES转染组大鼠,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 结膜下注射ES基因或RGDRGD-ES基因均能抑制碱烧伤诱导的CNV,但RGDRGD-ES基因对CNV的抑制作用更强,其作用机制为抑制VEGF及其受体Flk-1的表达.     

Bevacizumab对大鼠角膜新生血管的抑制作用

目的 观察bevacizumab对角膜新生血管的抑制作用.方法 选取鼠龄6～8周、体质量(180±10)g的雄性Wistar大鼠40只,建立碱烧伤角膜新生血管模型;将大鼠随杌分为3个不同剂量药物治疗组(实验组)和1个对照组,每组10只(20眼),大鼠角膜碱烧伤后分别给予结膜下注射不同剂量(0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg)的bevacizumab,对照组注入生理盐水;然后进行角膜新生血管的各项数据观察,观察期为16 d,主要观察项目包括各组角膜新生血管的生长情况;计算角膜新生血管的生长面积;碱烧伤后第7天和第16天后采集角膜,标本行组织病理学检测和免疫组织化学检测,第16天,计算平均OD值;评价药物对角膜新生血管的抑制效果.结果 碱烧伤后第7天、第14天,实验组与对照组新生血管面积比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05);组织病理学检测发现各实验组炎性细胞浸润、新生血管形成均明显轻于对照组.对照组血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)染色明显增强,实验组的表达明显减弱.碱烧伤后第16天,实验组与对照组比较,VEGF染色阳性细胞数和VEGF平均OD值差异均有统计学意义(均为P＜0.05).碱烧伤后第7天、第16天大鼠角膜CD34的免疫组织化学检测结果及新生血管密度计数方面,实验组和对照组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 结膜下注射一定浓度的bevacizumab对大鼠角膜碱烧伤后的新生血管生长有抑制作用.     

抗血管内皮生长因子小干扰RNA抑制大鼠角膜新生血管形成的研究

目的 探讨抗血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF-siRNA)对角膜碱烧伤急性期新生血管(CNV)形成的抑制作用.方法 实验研究.体外化学合成VEGF序列特异性双链小干扰RNA(VEGF-siRNA),脂质体介导转染体外培养的大鼠角膜上皮和基质细胞,实时PCR法检测转染后各时段VEGF mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验测定转染后各时段VEGF蛋白表达水平.制作大鼠角膜碱烧伤动物模型,采用VEGF-siRNA转染的角膜上皮移植联合前房注射脂质体包裹的VEGF-siRNA治疗急性期CNV,免疫组化和ELISA分别检测角膜VEGF表达,观察术后CNV形成.细胞实验和动物实验中siRNA处理组和对照组VEGF蛋白含量比较,采用两样本均数比较的t检验.结果 siRNA对角膜上皮细胞VEGFmRNA的抑制效率达60%～84%,角膜基质细胞VEGFmRNA的抑制效率达59%～76%,角膜上皮和基质细胞VEGF蛋白表达也有相应的下降.采用VEGF-siRNA转染的角膜上皮移植联合前房注射VEGF-siRNA治疗,实验组CNV面积显著小于对照组;实验组VEGF表达水平显著低于对照组.结论 VEGF-siRNA能显著抑制大鼠角膜碱烧伤急性期CNV形成.     

苦参碱对大鼠角膜新生血管的抑制作用

目的观察苦参碱对大鼠角膜烧伤后新生血管生成的抑制作用。方法选取Wistar大鼠32只,建立碱烧伤角膜新生血管模型,随机分成对照组和3个不同剂量的苦参碱实验组,每组8只(16眼)。模型建立后,实验组大鼠在结膜下注射不同剂量的苦参碱(0.2mg、0.4mg、0.8mg),对照组注射生理盐水,在裂隙灯下动态观察大鼠角膜新生血管生长情况并计算角膜新生血管的面积,观察周期为21d。于造模后4d、7d、14d、21d取不同剂量的苦参碱实验组大鼠角膜进行组织病理学检测,采集各组大鼠的角膜标本,用免疫组化法检测角膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,计算其平均光密度值;采用RT-PCR方法检测各组大鼠角膜组织中VEGF mRNA的表达。结果碱烧伤后4d、7d、14d、21d,与对照组相比,各实验组大鼠新生血管面积明显减少,差异均有显著统计学意义(P<0.01);造模后14d时,不同剂量的苦参碱实验组新生血管密度计数(17.83±2.32、11.00±2.37、10.87±2.41)明显低于对照组(21.11±2.14)(P<0.05);各实验组角膜VEGF的平均光密度值均小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各实验组VEGF mRNA水平与对照组相比也显著下降(P<0.05)。结论结膜下注射苦参碱对大鼠角膜碱烧伤后的新生血管生长有抑制作用。     

重组腺相关病毒介导的血管内皮生长因子反义核苷酸对糖尿病视网膜病变的影响

目的观察重组腺相关病毒（rAAV）介导的血管内皮生长因子（VEGF）反义核苷酸（rAAV-aVEGF165）对糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响。方法 40只Sprague-Dawley大鼠用链尿佐菌素（STZ）腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。去除实验中途死亡和血糖恢复的大鼠，共计32只大鼠纳入研究，随机平均分为实验组和对照组,每组各16只。实验组和对照组大鼠玻璃体腔分别注射rAAV-aVEGF165（10¹⁰ pfu/ml）、磷酸盐缓冲液各10 μl，建模后1、5个月免疫组织化学及Western blot评价视网膜VEGF的表达，并对视网膜血管进行透射电子显微镜观察。结果 1个月时，实验组和对照组大鼠视网膜VEGF表达极低；5个月时，实验组大鼠视网膜VEGF表达较同期对照组降低，差异有统计学意义（t=23.87, P＜0.01）。透射电子显微镜观察显示，实验组视网膜未见明显异常改变，而对照组视网膜微血管腔明显狭窄，基底膜明显增厚，密度不均，并出现断裂，内皮细胞明显肿胀，突起增多，管腔明显狭窄，周细胞内细胞器结构模糊，细胞核固缩，呈凋亡状态，异染色质明显分布不均，浓集。结论 rAAV-aVEGF165能下调视网膜VEGF的表达，从而阻止糖尿病视网膜病变的发生、发展；rAAV是眼反义基因治疗的有效载体。 （中华眼底病杂志，2008，24：255-258）     

AAV-mediated expression of vascular endothelial growth factor induces choroidal neovascularization in rat

PURPOSE: To develop a small-animal model of choroidal neovascularization (CNV) by injecting adeno-associated virus (AAV)-VEGF into the subretinal space (SRS) of rats. METHODS: An adeno-associated viral vector encoding human VEGF(165) was injected into the subretinal space (SRS) of Sprague-Dawley or Long Evans rats. Expression of VEGF was identified by RT-PCR and immunohistochemistry. Physiological and pathologic changes in the retina and choroid were evaluated by electroretinography, fluorescein angiography, light microscopy, and three-dimensional reconstruction of serial sections. RESULTS: Green fluorescent protein (GFP) and VEGF were expressed for at least 20 months in the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Histologic sections showed extensive subretinal neovascularization, degenerating photoreceptors, and proliferating RPE at 5 weeks to 20 months after injection of AAV-VEGF. At 2 to 12 months after injection, leaking blood vessels were detected by fluorescein angiography. Electroretinogram a- and b-wave amplitudes were significantly decreased during this time. Three-dimensional reconstruction of serial sections demonstrated that choroidal blood vessels penetrated Bruch's membrane, one of them splitting into three branches in the SRS. In the current model, CNV was produced in 95% of the animals tested (19/20). It persisted for more than 20 months, a necessary requirement for modeling the development of CNV in age-related macular degeneration (AMD). CONCLUSIONS: In this study, a highly reproducible animal model of long-lasting CNV was developed. This model is being used to test antiangiogenic molecules to reduce or inhibit CNV and could be extended to primates.     

Receptor tyrosine kinase inhibitors AG013764 and AG013711 reduce choroidal neovascularization in rat eye

Age-related macular degeneration (AMD) is the major cause of blindness for people over 60. In the "wet" form of AMD compounds targeting growth factor signaling pathways such as VEGF have been a major focus for therapeutic interventions. In a previously developed rat model of CNV, we utilized two receptor tyrosine kinase inhibitors (RTKi) to block VEGFR-1, VEGFR-2 and PDGFR signaling following the establishment of CNV. AAV-VEGF(165) was injected into the subretinal space of rats at postnatal days 15-17. Six weeks later, a suspension of RTK inhibitors, AG013764 or AG013711, was injected intraperitoneally (IP, twice daily) or intravitreally (every five days) over a two week period. FITC-dextran whole-mounts of RPE-choroid-sclera were prepared after the animals were sacrificed. CNV area was quantified using Neurolucida to measure the hyperfluorescence on FITC-dextran whole-mounts. Histology and immunohistochemistry were performed as described previously. VEGF expression in control and treated eyes was confirmed by immunohistochemistry and histological sections indicated recovery of retinal morphology and CNV reduction in treated eyes. In the animals IP injected with AG013764 or AG013711 the mean CNV level was reduced by 25 to 33% compared to control, but this effect did not achieve statistical significance. Intravitreal injections of AG013764 or AG013711 reduced the level of CNV by approximately 60% compared to control (p<0.005 or p<0.05, respectively). These data show that two RTK inhibitors, AG013764 or AG013711, delivered intravitreally, significantly reduce blood vessel proliferation in this AAV-VEGF(165) model of CNV.     

腺相关病毒转内皮抑素基因抑制大鼠角膜新生血管的研究

目的:探讨以重组腺相关病毒(rAAV)介导内皮抑素(ES)基因转移对大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的抑制作用。方法:选取SPF级SD大鼠60只,角膜缝线法制作CNV模型,随机分为A,B,C和D共4组。A组:缝线后立即于上方近角膜缘处结膜下注射50μL rAAV-ES转染液;B组:缝线后刮除角膜上皮,用rAAV-ES转染液浸泡角膜10min;C组:缝线后用rAAV-ES转染液浸泡去上皮角膜10min后,同样部位结膜下注射50μL rAAV-ES转染液;D组:对照组,同样部位结膜下注射50μL生理盐水。在裂隙灯显微镜下观察各组CNV的生长情况,并计算其面积;免疫组织化学法观察ES基因表达情况;病理切片检测CNV密度;观察ES基因转移对CNV的抑制作用。结果:裂隙灯显微镜下观察各组大鼠缝线后CNV逐渐生长,14d达高峰,其后逐渐减少;21d后变性。定量数据重复测量的方差分析显示:时间因素与治疗因素之间存在交互效应(F=175.810,P<0.01)。缝线诱导后不同转染组间CNV面积亦有显著性差异(F=2243.816,P<0.01);其中以D组CNV面积最大;C组CNV面积最小。不同时间段CNV生长面积之间差异显著(F=1060.854,P<0.01);对CNV增生的抑制率随着转染时间的延长而增加,C组在缝线后28d,对CNV增殖的抑制率高达到58.25%。免疫组织化学检测显示:A组于上方角膜缘结膜和角膜上皮中可见ES染色阳性;B组在浅基质CNV的内皮细胞中发现少量ES染色阳性;C组角膜上皮及浅基质CNV的内皮细胞中可见较为明显的ES染色阳性;D组角膜细胞均为ES染色阴性。角膜切片结果显示:CNV密度在各转染组均比对照组稀疏。结论:rAAV-ES转基因可明显抑制缝线诱导的大鼠CNV的增生。采用单独结膜下注射rAAV-ES转染液或转染液局部浸泡去上皮角膜的转染途径均能抑制缝线诱导的CNV增生,联合转染途径对缝线诱导CNV增生的抑制效果更好。     

Recruitment of marrow-derived endothelial cells to experimental choroidal neovascularization by local expression of vascular endothelial growth factor

PURPOSE: The question of whether adult animals maintain a reservoir of endothelial progenitor cells (EPCs) in the bone marrow that is involved in neovascularization is under investigation. The following study was undertaken to examine the potential contribution of EPCs to the development of choroidal neovascularization (CNV) in adult mice and to examine the role of local expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in this process. METHODS: Lethally irradiated, adult female nude mice were engrafted with whole bone marrow isolated from male transgenic mice expressing LacZ driven by the endothelial specific Tie-2 promoter. Two months, following bone marrow reconstitution, confirmed by quantitative Taqman PCR, an E1-deleted adenoviral vector expressing vascular endothelial growth factor (165) (Ad.VEGF(165)) was injected subretinally to induce CNV, confirmed by collagen IV immunohistochemistry. Bone marrow-derived endothelial cells were detected using either X-gal staining or Y chromosome in situ hybridization. Y chromosome positive cells within the CNV were confirmed to be endothelial cells by lectin staining. RESULTS: Subretinal Ad.VEGF(165) was capable of inducing CNV. Four-week old lesions were found to contain LacZ expressing cells within the CNV in bone marrow transplanted animals but not in negative control animals. Eighteen percent of all Y chromosome positive cells within the CNV were found to be lectin positive while 27% of all endothelial cells within the CNV were Y chromosome positive. CONCLUSION: Engrafted bone marrow-derived EPCs were shown to differentiate into endothelial cells at the site of subretinal VEGF-induced CNV in mice. These results suggest that EPCs contribute to the formation of neovascularization and that subretinal expression of VEGF might play an important role in recruitment of these cells to the site of CNV.     

再生丝素膜对转基因角膜上皮细胞表达细胞因子的影响

目的 探讨再生丝素膜对转基因人角膜上皮细胞表达细胞因子的影响,以及转基因细胞修饰的再生丝素膜构建生物材料复合体的可能性.方法 实验研究.兔角膜缘注射重组腺病毒载体血管内皮生长因子165(Ad-VEGF_(165))诱导新生血管,测量角膜新生血管生长面积,分析角膜组织血管内皮细胞生长因子免疫组织化学结果.用再生丝素膜培养角膜上皮细胞,观察细胞形态、生长曲线、Ad-VEGF_(165)感染效率.收集再生丝素膜Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞培养上清,酶联免疫吸附试验法检测上清中血管内皮生长因子、血管生成素1、表皮生长因子、转化生长因子等细胞因子浓度.采用双因素方差分析基因感染和再生丝素膜材料两因素对HCECs细胞因子表达水平的比较.结果 (1)角膜缘注射Ad-VEGF_(165)后第1周、第1个月角膜新生血管面积分别为(7.60±1.12)mm~2、(12.28±2.54)mm~2,注射后第3天、第1周、第1个月角膜基质内可见血管内皮生长因子阳性表达.(2)再生丝素膜及无再生丝素膜两种培养条件,角膜上皮细胞细胞形态、生长曲线、Ad-VEGF_(165)感染效率均无明显差异.(3)再生丝素膜培养Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞上清中各细胞因子浓度分别为血管内皮生长因子(721.67±66.97)ng/L、表皮生长因子(1042.67±315.81)ng/L、血管生成素1(2421.00±0.00)ng/L、转化生长因子(313.33±34.06)ng/L.无再生丝素膜Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞培养上清各细胞因子浓度分别为血管内皮生长因子(721.67±66.97)ng/L、表皮生长因子(860.33±315.81).g/L、血管生成素1(1960.33±797.90)ng/L、转化生长因子(278.00±53.11)ns/L.Ad-VEGF_(165)感染角膜上皮细胞培养上清中各细胞因子浓度均显著高于对照组,分别为血管内皮生长因子(F=168.16,P<0.0001)、表皮生长因子(F=52.76,P<0.0001)、血管生成素1(F=12.47,P=0.001)、转化生长因子(F=5.647,P=0.016).再生丝素膜与无再生丝素膜两种培养条件下,血管内皮生长因子(F=0.071,P=0.793)、表皮生长因子(F=0.563,P=0.465)、血管生成素1(F=0.14,P=0.714)、转化生长因子(F=0.008,P=0.932)浓度比较差异无统计学意义.结论 再生丝素膜与细胞培养板一样,Ad-VEGF_(165)转基因角膜上皮细胞目的 基因能获得高效表达,同时还使角膜上皮细胞自分泌的新生血管相关细胞因子表皮生长因子、血管生成素1、转化生长因子等获得高效表达.     

吡格列酮对鼠角膜碱烧伤后新生血管抑制作用的研究

目的:探讨吡格列酮对大鼠碱烧伤后角膜血管内皮细胞生长因子(VEGF),碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)表达的调节作用,以及对碱烧伤后角膜新生血管生长的抑制作用。方法:建立大鼠角膜碱烧伤模型,结膜下注射吡格列酮,观察烧伤后不同时期的角膜新生血管的数量、长度,应用免疫组化和Western blot方法检测碱烧伤后及烧伤治疗不同时期的VEGF,b-FGF的表达变化情况,并与对照组比较。结果:大鼠角膜碱烧伤后2d角膜新生血管开始生长,7～10d达到高峰,吡格列酮治疗后的角膜新生血管的发生延迟,血管的生长受到抑制,VEGF,b-FGF随时间发生变化,表达较对照组下降。结论:局部应用吡格列酮对由碱烧伤引起的鼠角膜新生血管的发生、发展有明显的抑制作用,其机理可能是通过下调促血管生成因子VEGF,b-FGF的表达而实现的。     

角膜碱烧伤后VEGF的表达与新生血管的关系

目的研究碱烧伤后角膜血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）的表达与角膜新生血管化的关系。方法30只Sprague-Dawleg（SD）大鼠碱烧伤，诱导角膜新生血管模型。碱烧伤后不同时间形态学分析来评价角膜新生血管的情况，免疫组化及Westem blot评价角膜VEGF的表达。结果角膜碱烧伤后24hVEGF的表达开始增高，伤后4d达高峰，伤后7d VEGF的表达下降，14d后显著下降。碱烧伤后，角膜新生血管与VEGF的表达呈明显的平行关系。结论碱烧伤后大鼠角膜VEGF的表达水平与新生血管的形成有相关性，并在其中发挥重要作用。     

重组B因子小干扰RNA对激光诱导大鼠脉络膜新生血管的抑制作用

目的　探讨重组B因子（CFB）小干扰RNA(siRNA)抑制激光诱导的大鼠脉络膜新生血管(CNV)的效果。方法　采用基因重组的方法获得重组CFB siRNA,取棕色挪威（BN）大鼠42 只84 只眼,用激光光凝方式建立CNV模型,随机分为尾静脉注射组、玻璃体腔注射组、视网膜下腔注射组、对照组。3种不同的注射方式组分别设有相应的空质粒注射组。除对照组外,其余各组于激光光凝后第1、3、5天分别进行注射CFBsiRNA,尾静脉、玻璃体腔、视网膜下腔注射组的注射剂量分别为50、20、10 μg;对照组激光光凝后不给于任何干预。激光光凝前和光凝后14 d分别行荧光素眼底血管造影(FFA),根据荧光渗漏程度对各激光光斑评分来检测CNV的生成情况;免疫组织化学法检测各组大鼠脉络膜内血管内皮生长因子(VEGF)、第Ⅷ因子的表达情况。结果 各组激光光斑荧光渗漏程度评分结果显示,CFB-siRNA尾静脉注射组与对照组相比荧光渗漏程度明显减轻 (χ2=15.1620,P<0.05)。免疫组织化学结果显示,CFB-siRNA尾静脉注射组VEGF、第Ⅷ因子的阳性表达强度在激光光凝后不同时间点之间差异无统计学意义(F=20.35,18.33;P>0.05),而与同时间点其他各组相比,明显降低(F=77.96,55.68;P<0.05)。其他各组VEGF、第Ⅷ因子的阳性表达强度在激光光凝后14 d均显著强于激光光凝后7 d (F=60.89,61.12;P<0.05)。结论 通过下调VEGF及第Ⅷ因子的表达水平,重组CFB-siRNA能有效的抑制CNV的生成。     

血管抑素对角膜新生血管和VEGF表达的作用

目的:探讨血管抑素(angiostatin,AS)对鼠碱烧伤角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的作用,探讨 AS对CNV的作用及机制。方法:SD大鼠105只随机分为正常对照组(5只)、生理盐水组、地塞米松组、AS1组、AS2组(各25只),除正常组外,实验各组制作左眼碱烧伤CNV模型,分别予生理盐水、1g/L地塞米松液、10μg/mLAS液、20μg/mLAS液点眼,4次/d,于碱烧伤后1,3,7,14,21d运用裂隙灯、免疫组织化学方法观察新生血管长度及面积、VEGF的表达。结果:AS治疗组碱烧伤后第3d起各时间点CNV面积均明显小于盐水组(P<0.05)。碱烧伤后各时间点AS治疗组VEGF表达量均明显少于盐水组(P<0.05)。结论:AS能显著抑制碱烧伤CNV,可能与其抑制VEGF的表达有关。